Técnicas de Biología molecular I

Se inició con el descubrimiento de las

enzimas de restricción y la transcriptasa
reversa. (Nota: las enzimas de transcripción
son enzimas que pueden cortar Ac. N. en
sitios específicos al detectar una secuencia
específica).

Muy pronto se estaba haciendo ingenieria

genética, como introducir genes humanos
en bacterias, hasta que se desarrolló el PCR

La extracción consiste en eliminar todo lo

que este interaccionando con el DNA para
poder obtenerlo puro. Las condiciones son:
desactivar las nucleasas, lisar las celulas por
distintos metodos, separarlas de los
componentes con proteasas y ribonucleasas (para los lipidos se ocupan algunos solventes) y asi
obetener el DNA puro.

Las etapas son disgregar el tejido, producir la lisis, luego la clarificacion de celulas que no se han
roto, purificar ac. nucleicos que nos interesan, y finalmente hacer analisis cuantitavo para ver
cuantos obtenenos y un analisis cualificativo para ver como esta el DNA que obtuvimos.
 Para lisar, romper el tejido y disgregar
las celulas, se puede hacer por una
trituracion mecanica o bien por
mortero. También se puede hacer por
detergentes (porque rompen
membranas). También se puede ayudar
por métodos enzimáticos, por ejemplo:
lisozimas, para romper las paredes de las
bacterias; proteasas para eliminar
proteínas que se encuentran en la
membrana o posteriormente para
eliminar las proteínas que están
interaccionando con el DNA.

Se agrega EDTA, que elimina el metal

libre – como calcio y magnesio- al unirse
a ellos, e inhibe la nucleasas

Nota: Si nos interesa RNA, hay que eliminar las RNA asas; y si nos interesa DNA, hay que eliminar las
DNA asas.

Nota 2: La temperatura es importante y debe mantenerse regulada.

También se trabaja con cierta concentración salina para soltar las proteínas que están
interaccionando con el ADN y proteasas para degradar las proteínas asociadas, después se hace una
extracción con fenol/cloroformo o isoaminicocloroformo, se esa manera se obtienen 2 fases: una
fase orgánica y una fase acuosa

En el límite entre ambas fases quedan todas la proteínas que se desnaturalizan y el DNA queda en
la fase acuosa. El procedimiento se repite hasta que no hayan precipitados (no hay proteínas) y
después se agrega alcohol fenol/cloroformo, de esa manera el DNA precipita, hasta se puede
enrollar si es de alto peso molecular.
Nota: cuando el DNA aún tiene proteínas se puede volver a solubilizar y añadir proteasas hasta que
ya no haya, buscando el máximo de pureza

El espectrofotómetro permite cuantificar la muestra de acuerdo con cuanta longitud de onda

absorbe la muestra. El ácido nucleico absorbe el luz ultravioleta, después es visible.

 Proteína máximo de absorción es 280

 ADN máximo de absorción es 260.

¿Por qué las proteínas y el DNA absorben el ultravioleta? Por los anillos aromáticos.

En proteínas, ¿cuáles son tales aromáticos? Triptófano, fenilalanina y tirosina

En DNA, ¿cuáles son tales aromáticos? Las bases nitrogenadas, pero a diferencia de los anillos se
absorben distinta longitud de onda.

Ahora podemos hacer electroforesis y

generalmente hay 2 tipos: uno con soporte
de poliacrilamida y otro con agarosa.

Poliacrilamida para fragmentos pequeños de

DNA (menos de 500 pares de bases).
Agarosa para fragmentos más grandes de
DNA (si el DNA es de muy alto peso, es difícil
que pueda realizarse una electroforesis, por
lo que debiera fragmentarse)

Después que uno hace la electroforesis se tiñe, por

ejemplo, con cloruro de etilo o colorante
fluorescente, entonces cuando es de muy alto peso
se fragmenta y después de analiza en los geles.

Hoy en día hay muchos colorantes, estos también

se colocan en un transiluminador y se observan
por fluorescencia.
Nota: El bromuro de etilo no se utiliza tanto por que produce mucho daño y es muy contaminante.

Una de las propiedades que tienen los ácidos nucleicos es que se pueden desnaturalizar, lo que en
DNA significa separación de las cadenas. Además, las hebras se pueden complementar y volver a
sus condiciones normales, por lo tanto, este proceso es reversible

Desnaturalización e hibridación

La desnaturalización puede ser por calor u

otros métodos y puede ser parcial o total. Si
es parcial, las regiones que se desnaturan
primero son las más ricas en A-T, en regiones
de C-T se requiere un poco más de T° para
desnaturalizar.

Si yo ahora coloco mi ADN en un tubo y lo

caliento a distintas T°, por ejemplo 30, 35, 40,
etc.

Vamos a un gráfico y vemos la absorbancia

a cada T°, se obtiene un gráfico:

En primer lugar, vemos un aumento de la absorción,

que coincide con la desnaturalización del ADN, y las
bases cada vez se exponen más (se absorbe más).
Esto se llama efecto hipercrómico (ruptura de
puentes de hidrógeno)

Al revés, si yo tengo un ADN desnaturado y quiero

ver la absorción, se renatura, la absorción disminuye
y el fenómeno se llama efecto hipocrómico
La absorbancia aumenta al desnaturalizar el DNA porque las bases quedan más expuestas que en
el DNA nativo o normal.

Nota: T° de Fusión o Tf es la temperatura a la cual el ADN esta un 50% desnaturado. Mientras más
alto sea este valor, más rico es el ADN es C-G

Si el ADN desnaturado y se puede volver a renaturar,

que pasa si se agrega un oligonucleótido que sea parcialmente complementario a una de las
hebras de ADN. (esto se llama Sonda)

Se pueden fabricar sondas dirigidas a secuencias específicas para reconocer genes específicos. Por
ejemplo, si hay una infección en un hospital y no sé qué tipo de bacteria es, se aísla una muestra
desde el sitio infectado y haciendo el experimento con sondas especificas se puede identificar la
bacteria causante de la infección. Las sondas se acoplan a fluorocromos que cuando se unen dan
una fluorescencia.

Esto se llama hibridación, y se utiliza, por ejemplo, en Southern Blot.

Nota: la hibridación también puede ser el unir hebras de distintas especies cuando hay
complementariedad

 Southern Blot: sirve para ver si cierta secuencia está presente en el DNA
 Northern Blot: es más específica. Se busca la expresión o no de un determinado ARN y si
ese ARN esta o no.

Otras técnicas son:

 Identificación de bacterias, virus

 Hibridación in situ (FISH)
 Microarreglos de ADN (Microarray para comparar una expresión génica bajo distintas
condiciones)
Southern Blot: se aísla ADN, dependiendo del tamaño se fragmenta, se separa en geles de agarosa
y posteriormente se transfieren estos fragmentos que están en el gel a un papel de nitrocelulosa,
se coloca una serie de papel absorbente para que por capilaridad pasen las bandas desde el gel al
papel. Posteriormente se saca el papel y con el papel de nitrocelulosa se incuba con las sonda.

Si la sonda encuentra su complementario, por ejemplo, al inicio, se verá una banda al inicio al lavar
la muestra.

Norther Blot es similar pero con RNA y Western Blot es con proteínas.
CITOGENETICA MOLECULAR

Con este tipo de estudios se puede lograr identificar defectos submicroscópicos del ADN. La
tecnología FISH combina las técnicas de citogenética convencionales con técnicas moleculares y
está basada en la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos tanto en cromosomas
mitóticos como en núcleos interfásicos.

EXISTEN DOS METODOS DE FISH:

 Método directo: utiliza nucleótidos marcados con moléculas fluorescentes y puede

observarse la señal inmediatamente después del FISH al microscopio de fluorescencia
 Método indirecto: se utilizan sondas unidas a moléculas como la biotina o digoxigenina y
posteriormente se incuban con anticuerpos antibiotina o antidigoxigenina unidos a
fluorocromos que permiten su observación al microscopio de fluorescencia. Hay una amplia
variedad de sondas comerciales y también pueden fabricarse.
Según las sondas utilizadas en FISH, se pueden detectar diferentes tipos de secuencias en el genoma
humano:

 Sondas de secuencia única: se usa para la detección de regiones específicas (regiones

subteloméricas, o microdeleciones). Estas sondas hibridan con el ADN de una región
genómica concreta, correspondiente a un gen o a una banda cromosómica. Con ellas es
posible detectar alteraciones numéricas y estructurales
 Sondas centroméricas: son sondas “alfa-satélite” que permiten la detección de secuencias
altamente repetitivas de las regiones pericentromericas
 Sondas para regiones específicas: detecta secuencias altamente repetitivas localizadas en
determinadas regiones de los cromosomas (por ejemplo: Yq12)
 Sondas para el pintado de cromosomas completos: detectan secuencias de eucromatina
en determinados brazos o cromosomas completos. Están formadas por una batería de
sondas que en su conjunto hibridan con todo el cromosoma. Dichas sondas permiten
visualizar alteraciones citogenéticas numéricas y estructurales.

Aquí por ejemplo aparecen 2 cromosomas homólogos en

que se hicieron hibridaciones con 6 sondas distintas y
aparecen 2 señales porque son 2 cromosomas homólogos.

Hay 2 señales en cada uno por que están duplicados, no se

han separado las cromátidas hermanas.
Cariotipo espectral: se logra teñir todos los cromosomas
dirigiendo sondas específicas para cada cromosoma (esto se
logró después que se secuenció el genoma humano, porque
ahí se pudieron fabricar distintas sondas para distintos
cromosomas).

Cuando se hace un cultivo celular lo primero que se hace es disgregar las células, se aíslan y se
cultivan en distintos medios y esas células después se traspasan a otro medio, de tal manera que el
primer medio se llama cultivo primario y el siguiente, cultivo secundario.

Las células normales se pueden dividir un cierto número de veces, mientras que las células
cancerosas son inmortales y se puede estar años trabajando ellas.

Los cultivos primarios (preparados

directamente a partir de los tejidos de
un organismo) tienen características
especiales que los diferencian de las
líneas celulares: conservan la
morfología de las células del órgano
del que fueron aisladas, sus
cromosomas tienen un número
diploide (2n), su crecimiento in vitro es
limitado y hay inhibición por contacto
(solo crecen por monocapa).

Cuando de un cultivo primario pueden ser removidas células del recipiente de cultivo a uno nuevo
donde proliferarán se habla de cultivos secundarios.

Líneas celulares

Las Líneas Celulares continuas están formadas por células que se diferencian genética- y
morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden provenir de células que se
derivan de tumores o de un proceso de transformación de un cultivo primario mediante transfección
con oncogenes o con tratamiento con carcinogénicos, lo que les confiere un nuevo fenotipo. Este
tipo de cultivo tiene la característica de no tener inhibición por contacto y de crecer de manera
indefinida. El paso de un cultivo primario a línea se denomina transformación. (aquí también cambia
el número de cromosomas, hay translocaciones, deleciones, etc. Alteraciones en general).