“Año de la lucha contra la corrupción e impunidad”

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

FACULTAD DE INGENIERÍA
E.A.P. DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
“PRODUCCION DE ENZIMA INULAZA Y TRANSFERENCIA DE OXIGENO”

ALUMNOS:

 Chavez Novoa Patricia

 Huanca Corales Alex

DOCENTE:
Augusto Castillo Calderón

ASIGNATURA:
Laboratorio de Ingenieria De Bioprocesos
GRUPO: “A -1”

Nuevo Chimbote, 3 de Junio del 2019

 INDICE
I. INTRODUCCION ...................................................................................................... 3
II. OBJETIVOS ............................................................................................................. 4
2.1. OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 4
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 4
III. MATERIALES E INSTRUMENTOS .......................................................................... 5
3.1. EQUIPOS............................................................................................................................. 5
3.2. MATERIALES ..................................................................................................................... 6
3.3. REACTIVOS ....................................................................................................................... 6
IV. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL .......................................................................... 7
4.1. DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO ............................................................................... 7
4.2. PREPARACIÓN DE MEDIOS, PROGRAMA DE MUESTREOS ............................... 3
4.3. MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL, CULTIVO DEL
MICROORGANISMO. ................................................................................................................... 7
a) Determinación del 𝑢𝑀 ........................................................................................................ 7
b) Determinación de los rendimientos del nutriente limitante en células ....................... 7
c) Evaluación del pH............................................................................................................... 8
d) Evaluación del KLa ............................................................................................................. 8
V. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS. ............................................... 11
VI. RESULTADOS ....................................................................................................... 12
6.1. Determinación de Biomasa ................................................................................................ 12
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 22
VIII. ANEXOS ................................................................................................................. 23
1) Cálculos para concentraciones en el medio de mantención. ........................................ 23
2) Cálculos para concentraciones en el medio de activación ............................................ 23
3) Cálculos para concentraciones del medio de fermentación: ........................................... 4
 INDICE DE DIAGRAMAS
Diagrama 1: Medio liquido de cultivo ----------------------------------------------------------------------------------------- 8
Diagrama 2: Medio liquido de activación------------------------------------------------------------------------------------- 9
Diagrama 3: Curva de calibrado de crecimiento de biomasa --------------------------------------------------------- 12
Diagrama 4: Determinación de concentración de biomasa ----------------------------------------------------------- 13

INDICE DE FIGURAS
Ilustración 1: Instrumentos de laboratorio .................................................................................................... 5
Ilustración 2: Materiales de laboratorio ....................................................................................................... 6
Ilustración 3: reactivos de laboratorio .......................................................................................................... 6

INDICE DE TABLAS
Tabla 1: composición de medios de mantención______________________________ 7
Tabla 2: Composición de medio de activación _______________________________ 7
Tabla 3: Composición del medio de fermentación_____________________________ 8
Tabla 4: cronograma de actividades ______________________________________ 19
I. INTRODUCCION

La inulinasa es una enzima relevante para la producción de fructosa

por hidrólisis enzimática de la inulina. Esta enzima también se aplica
en la producción de fructooligosacáridos que pueden usarse como un
nuevo ingrediente funcional alimentario. En Brasil, la producción de
esta enzima utilizando residuos de la industria de la caña de azúcar y
el maíz (bagazo de caña de azúcar, melaza y licor de maíz) es
económicamente atractiva, debido a la gran cantidad y bajo costo de
dichos residuos (Bender et al, 2006)

Se estudia el efecto del extracto de yacón como fuente de carbono en

la producción de inulinasa, como fuente vegetal de inulina.

El uso de inulinasa provee una alternativa a los procesos químicos, de

hidrolizar inulina a jarabe de fructosa de alta pureza, usada
ampliamente en la industria de alimentos. Es por esto que, el objetivo
del trabajo es evaluar la producción de inulinasa mediante
fermentación en estado sólido utilizando Kluyveromyces marxianus
NRRL Y-7571.
II. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Diseñar y realizar una experiencia de fermentación en cultivo

celular por lote de kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571, en un
extracto de yacon, a fin de producir la enzima inulinasa y medir el
coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno a distintas
condiciones de agitación.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Identificar y describir las partes, accesorios y geometría de un

fermentador de laboratorio, conocer su operación,
esterilización, carga y descarga y toma de muestra.
 Identificar en el fermentador los instrumentos de medición y
control automáticos, así como la calibración de los sensores.
 Polarización, calibración y caracterización dinámica del
electrodo de OD.
 Activación celular y desarrollo del inoculo
 Poner en marcha el CL, seguimiento y determinación de la
Umax; y Yx/s y Qx.
 Determinar el KLa por el método dinámico de Humphry y
correlacionar los resultados.
 Obtener los perfiles de masa celular, fuente de carbono y
oxígeno disuelto y pH a través del tiempo total de fermentación
en el birreactor.
III. MATERIALES E INSTRUMENTOS

3.1. EQUIPOS

Olla a presion Estufa electrica pH-metro

Agitador Incubadora Autoclave

Refrigerado

Spectofotometro Centrifuga Agitador de Tubos

(Borosil Germany)

Desecador Shaker o agitador orbital Biorreactor (Biostast-Aplus)

(Marca CSN )

Ilustración 1: Instrumentos de laboratorio

 3.2. MATERIALES

Matraz Erlenmeyer Tubos ensayos Mechero Bunsen Tripode

Ilustración 2: Materiales de laboratorio

3.3. REACTIVOS

 Agar saboraud.
 Glucosa.
 Peptona (bioceno).
 3,5-Dinitrosalicylic acido.
 Extracto de Yacon.

Extracto de Agar agar Peptona

malta Extracto de
levadura

Ilustración 3: reactivos de laboratorio

 IV. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

4.1. DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

Antes de comenzar a diseñar los procedimientos hallamos la masa

adecuada del nutriente para los diferentes medios; mantención,
activación y fermentación, teniendo de referencia la composición de
medios (concentración) para Kluyveromyces marxianus NRRL Y-
7571 para la producción de proteína.

Tabla 1: composición de medios de mantención

MEDIO NUTRIENTE CONCENTRACIO VOLUMEN PESO

N (g/l) (ml) (g)
SOLIDO DE Extracto de 3 50* 0.15
MANTENCION levadura
Peptona 5 50* 0.25
Extracto de 3 50* 0.15
malta
Agar 20 50* 1
Glucosa 10 50* 0.5

*=Volumen en el cual se diluyó su masa correspondiente (columna

derecha).
Se determinó el peso del nutriente conociendo la concentración
requerida para la composición del medio de mantención (anexo1).

TABLA 2: Concentración de Nutrientes para el medio de activación (10 ml)

Nutriente Concentración Volumen ml Peso (g.)
(g/L)
Sacarosa (Loba Chemie) 10 10 0.1
Extracto de levadura 3 10 0.03
(Merck)
Peptona (Bioceno) 5 10 0.05
MgSO4.7H2O (sigma) 0.65 10 0.0065
Ph (6,0)
T 30ºC, N 180 rpm
*=Volumen en el cual se diluyó su masa correspondiente (columna derecha).

Se determinó el peso del nutriente conociendo la concentración

requerida para la composición del medio de activación (anexo2).
Tabla 2 Composición del medio de fermentación para Kluyveromyces marxianus NRRL Y-
7571
MEDIO NUTRIENTE *VOLUMEN CONCENTRACIÓN PESO Ó
VOLUMEN

FERMENTACIÓN Extracto de yacón %(v/v) 2L 26.2 52.4ml.

Extracto de levadura 2L 10 20g
Fosfato monopotasico 2L 1 2g
Sulfato de amonio 2L 10 20g
Sulfato de magnesio 2L 0.386 0.772g
heptahidratado
Inóculo %(v/v) 2L 4.275 8.55ml.
pHo = 4,0
T°= 30°C
N= 150rpm
*Volumen en el cual se diluyó su peso o volumen correspondiente.

Un día antes de la preparación debemos esterilizar en la estufa del laboratorio

los materiales a usar, en el caso de las pipetas serán a 140°C por 20 min., los
matraces, tubos de ensayo y otros a 60°C.
a) Diseño y preparación del medio liquido de cultivo.
1g de agar
Pesar 0.5g de glucosa
0.25 de peptona
0.15 extracto de levadura
0.15 extracto de malta
Aforar
Aprox. 50 ml de agua destilada

Ebullición En 1-2 min en mechero

bunsen

Preparar 7 tubos con tapa

Verter 7ml en cada tubo

Reposar Aprox, 1 hora

Esterilizar 20 minutos en olla a presión

Colocar En posición inclinada

Diagrama 1: Medio liquido de cultivo

 b) Resiembra celular
 Desinfectar con algodón y alcohol el área de trabajo antes
de empezar la resiembra.
 El asa bacteriológica se somete al fuego del mechero hasta
alcanzar el rojo vivo.
 Dejar enfriar el asa bacteriológica por unos segundos, luego
del tubo de ensayo que contenía las células desarrolladas
en medio sólido, se extrae una gota
 Flamear el tubo para cerrarlo.
 El procedimiento de resiembra se hace en los 2 tubos de
ensayos preparados con medio sólido (con agar).
 La azada se dirige dentro del tubo y se arrastra por la
superficie desde adentro hacia fuera.
 Se llevan a la incubadora a 30 º C durante
aproximadamente 24 horas.
c) Preparación del medio de activación

MEDIR Matraz Erlenmeyer de 125 ml

Todos los nutrientes

PESAR

En cada tubo y adicionar agua

COLOCAR para disolver

ESTERELIZAR

MEDIR EL pH 6.0

En un mechero de Bunsen la
CALENTAR mezcla para evitar contaminación

Constantemente con una varilla

AGITAR por un minuto (aparición de la
primera burbuja)

Diagrama 2: Medio liquido de activación

 d) Preparación del medio de fermentación.
DISEÑO DE MEDIO DE FERMENTACIÓN:
1. Se hizo taras de aluminio, las cuales servirían para pesar las muestras
necesarias.
2. Luego, se pesó los componentes de la tabla 1 diluyendo completamente con
agua destilada. Por separado el extracto de yacón en un matraz, el extracto
de levadura con sulfato de amonio en otro matraz con agua destilada y las
sales de fosfato monopotasico y Sulfato de magnesio heptahidratado aparte.
3. Se regulará el pH hasta 4 para empezar.
4. Esterilizar las soluciones por separado y dejar enfriar.
5. Mezclar el extracto de yacón, el extracto de levadura, las sales y agregar el
inoculo.
6. Colocar en baño maría con un agitador magnético e iniciar el cultivo por lote
alimentado.
7. Durante el desarrollo del cultivo, evaluar el crecimiento de biomasa tomando
una muestra inicial al que se le mide la absorbancia y se centrífuga guardando
el sobrenadante en viales y la masa sedimentada en capachos que serán
expuestos a la estufa.
8. Una vez iniciado el crecimiento de biomasa se manipula el flujo de
alimentación de tal manera que en tiempos determinados se provoque en el
comportamiento del crecimiento.
9. Luego se llevará a cabo la alimentación con una segunda fermentación para
un volumen final del medio 2 litros de solución.

4.2. PREPARACIÓN DE MEDIOS, PROGRAMA DE MUESTREOS

a) Determinación de la cinética de crecimiento de la biomasa

Luego de la inoculación de la cepa en el medio de cultivo realizaremos
un seguimiento del crecimiento de la concentración celular por el
método espectrofotométrico, para ver la relación de la fuente de
carbono con la cinética de crecimiento de la cepa. Cabe mencionar que
es posible realizarlo por otros métodos (con similitudes en los principios
en los cuales se basan y procedimiento) como son peso seco,
turbidimetría, entre otros, sin embargo, optamos por éste método por la
brevedad de pasos en la medición de la concentración.
Materiales e Instrumentos:

1. Matraz de 1Lt.
2. Espectrofotómetro
3. Cubeta de plástico
4. Caldo de cultivo
5. Medio definido de cultivo
6. Tubos de ensayo
 7. Centrifuga
8. Agua destilada
9. Estufa
10. Balanza Analítica

Previamente a la determinación de concentración celular por Densidad

Óptica basado en el aumento de la turbidez del medio al incrementarse la
concentración de microorganismos, el cual se determina por
espectrofotometría a 640nm, es necesario realizar una curva de calibrado.
Para la construcción de la curva de calibrado, las concentraciones de
microorganismos son determinados por peso seco con el siguiente
proceso:

Una muestra de volumen conocido a

Centrifugar 5000rpm por minutos.

El sobrenadante que se obtiene de la

Eliminar
centrifugación.

El precipitado con agua destilada.

Resuspender

Todo el proceso anterior se realiza 2

Repetir veces más.

El precipitado resultado volver a diluir con

Secar agua y secar a 80° por 12 horas

Diagrama 3: Curva de calibrado de crecimiento de biomasa

 30ml de medio rico + cepa, a un matraz
Inocular de 1Lt. y aforar hasta 300ml.

Usando varilla de vidrio o sosteniendo

Mezclar
del cuello del matraz.

5ml de la mezcla anterior. Del matraz se

Extraer extraerán las siguientes muestras.

La absorbancia en el espectrofotómetro
Medir
de la muestra.

La concentración usando la curva de

Calcular calibrado

Diagrama 4: Determinación de concentración de biomasa

La medición del crecimiento de biomasa se realizará cada 1 hora por un

total de 8 horas con la finalidad de construir una curva y analizar la cinética
de crecimiento de la cepa Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571.

Una vez obtenido los datos de absorbancias, introducirlos en la curva de

calibrado realizada previamente para obtener las concentraciones.
b) Preparación del reactivo DNS

 Se mezcla y disuelve en 250 ml. de agua destilada 8 gr. De NAOH

y 15 gr. de tartrato de Sodio y Potasio.
 Posteriormente se agregan 5 gr. de Acido 3,5 dinotrasalicilico bajo
calentamiento. Se aforan a 500 ml con agua destilada y se
almacenan a temperatura ambiente protegiéndolo de la luz.

 Método para el análisis de sustrato

125 ul de la muestras
Diluir
375 ul de agua destilada
500 ul de DNS

Mantener En baño maría 5 min

Enfriar Con agua helada (3 min)

Añadir 5ml de agua destilada

Reposar
Por

Agitar
13 minutos

Leer
A 540 nm

Diagrama 5.- Análisis de la muestra

Leer las absorbancias por cada hora en un tiempo total de 8 horas.

Realizar la curva.
 c) Determinación de proteínas por el método Bradford

Disolver 100 mg de colorante azul brillante de Coomasie G-250 en 50

mL de etanol al 95%. Adicionar a esta solución 100 mL de ácido
fosfórico al 85% (w/v). Aforar a 1 litro.

Procedimiento:
 Agregar a un tubo de ensayo 100 ul de muestra
convenientemente diluida en tampón buffer.
 Añadir 5 ml del reactivo Bradford (a cada muestra) mezclar y
dejar reaccionar durante 5 minutos.
 Leer las absorbancias a una longitud de onda de 595 nm,
contrastándola con un blanco de agua destilada de 100 ul.
 La concentración se obtiene interceptando la medida de
absorbancia en la curva de calibrado.

La curva de calibrado se obtiene a partir de nuestras de concentración

conocida de una solución estándar de albumina suero de bobino y
analizadas según el procedimiento anterior.

4.3. MONTAJE DEL EQUIPO EXPERIMENTAL, CULTIVO DEL

MICROORGANISMO.
La determinación de parámetros cinéticos se realizará a partir de los
datos obtenidos durante la fermentación, empleando construcción de
gráficas y regresión lineal con el programa Excel.

a) Determinación del 𝒖𝑴
𝑿
 Utilizando la ecuación 𝐥𝐧 (𝑿 ) = 𝝁𝒕 + 𝒄, determinamos distintos
𝟎
valores de 𝝁.
 Tabular 𝑺𝒊 vs. 𝝁𝒊
𝟏 𝟏 𝑲 𝟏
 Con la ecuación = 𝒖 + (𝒖 𝒔 ) × 𝑺, graficamos.
𝒖 𝑴 𝑴
𝟏
 La intercepción con el eje y será el valor de 𝒖 siendo su inversa el
𝑴
𝑲𝒔
valor de 𝒖𝑴 , además la pendiente 𝑚 = 𝒖 conocido anteriormente
𝑴
𝒖𝑴 determinamos 𝑲𝒔 .

b) Determinación de los rendimientos del nutriente limitante en células

 Fuente de carbono y energía: extracto de yacón M = 180 g
Teniendo en cuenta los siguientes parámetros:

Ln(X / X0) = m t

Fórmula para el rendimiento:

  Para el rendimiento del nutriente limitante
YX/S = X / - S

 Para el rendimiento en proteínas

YP/S = P / - (𝑺)𝑻

 Para el rendimiento teórico:

Y°P/S = P / - (𝑺)𝑷

Fórmula para el cálculo de la productividad

 En células:
QX = X / t

 En producto:
QP = P / t

c) Evaluación del pH

La evolución del pH se valorará mediante un electrodo el cuál puede

introducirse al medio de fermentación por un orificio en la tapa
superior además de contar con un software conectado con el mismo
que brinda el registro de datos en una laptop.

Los resultados que se obtendrán permitirán determinar si la cepa

resulta ser la más adecuada en términos tiempo-tasa de crecimiento
durante el proceso de fermentación para establecer el tiempo de
duración en la producción de biomasa.

Para analizar pH inicial se medirá en el tiempo de activación, para que

la reacción se lleve a cabo deben romperse algunos o todos los
enlaces químicos de los reactivos para que puedan formarse los
enlaces nuevos de los productos.

d) Evaluación del KLa

Para la determinación del KLa se empleará el método Dinámico de
Humphry, previamente realizado la caracterización dinámica del
electrodo de OD.
Tabla 3.- Matriz de valores a obtener de KLa a distintos valores de agitación (RPM) y
velocidad de aireación (cm/min).

N(rpm) 550 700 850

Vs(cm/min)
7.89

15.79

23.68

El electrodo de OD que se empleará, será previamente calibrado para

su uso en la toma de datos. Al igual que el electrodo de pH, el
electrodo se encuentra conectado con un software en una laptop el
cuál registrará los datos, dichos datos se emplearán para la
construcción de una gráfica y a partir de ésa gráfica podremos
determinar el KLa. Se empleará del Excel para la construcción de
gráficas y tablas.

Se utiliza la actividad respiratoria de un cultivo en crecimiento para

disminuir el contenido de oxígeno en la mezcla antes de reiniciar la
aireación. La siguiente figura ilustra esquemáticamente este
procedimiento.

Ilustración 4.- Esquema del procedimiento de la determinación de KLa por el método de

desgasificación dinámica.

La concentración de oxígeno en el fermentador antes del punto A, es

estable. El suministro de aire se suspende repentinamente en el punto
A y, por lo tanto, el valor de KLa es igual a cero, y la pendiente de la
línea AB es una medida de la velocidad de respiración del cultivo:
 𝒅𝒄𝒍
= −𝝁(𝑶𝟐 )𝑿
𝒅𝒕
Donde:

𝜇(𝑂2 ) 𝑒𝑠 𝑙𝑎 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑎 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑖𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝑋 𝑒𝑠 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑏𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎

La aireación se reinicia en el punto B y la concentración de oxígeno

disuelto aumenta hasta alcanzar el valor inicial. El incremento en la
concentración de oxígeno disuelto observado en el período BC, es la
diferencia entre la transferencia de oxígeno hacia la solución y la
demanda de oxígeno por la respiración del cultivo:
𝒅𝒄𝒍
= 𝑲𝑳 𝒂(𝑪∗𝒍 − 𝑪𝒍 ) − 𝝁(𝑶𝟐 )𝑿
𝒅𝒕
Ésta ecuación también se puede expresar como:
𝟏 𝒅𝒄𝒍
𝑪𝒍 = 𝑪∗𝒍 − ( + 𝝁(𝑶𝟐 )𝑿)
𝑲𝑳 𝒂 𝒅𝒕

La representación gráfica de la ecuación anterior, con 𝑐𝑙 en las

𝒅𝒄
ordenadas y ( 𝒅𝒕𝒍 + 𝝁(𝑶𝟐 )𝑿) en las abcisas, es una línea recta cuya
𝟏
pendiente es igual a − 𝑲 𝒂. La recta se construye con los valores de
𝑳
las tangentes a la curva BC, correspondiente a diferentes valores
de 𝑐𝑙 .

Ilustración 5.- Representación esquemática de la determinación del coeficiente volumétrico de

transferencia de oxígeno, KLa, por el método dinámico
V. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS.

FECHA ACTIVIDAD
28/05/19  Identificación y descripción de las partes, accesorios y
geometría del fermentador BIOSTAT-Aplus,
conocimiento de su operación, esterilización, carga y
descarga y toma de muestras.
 Identificación en el fermentador los instrumentos de
medición y control automático, así como la calibración de
sensores.

03/06/18  Presentación del pre-informe.

07/06/19  Curva de calibrado del método de Bradford.

11/06/19  Polarización, calibración y caracterización dinámica del

electrodo de oxígeno disuelto.

19/06/19  Inoculación en el fermentador BIOSTAT-Aplus.

20/06/19  Medición de los parámetros cinéticos y determinación de

Kla.

21/06/19  Cuantificación de la enzima inulinasa y medición del

coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno a las
diversas condiciones de agitación.

25/06/19  Presentación del informe final.

 VI. RESULTADOS

6.1. Determinación de Biomasa

Tabla 1: Lecturas obtenidas durante la corrida de la fermentación

TIEMPO ABS
N° HORA OD (%) pH OBSERVACIONES
(horas) (640nm)
01 0 8:15 0.034 101.5 4.04
20.06.2019 02 2 10:15 0.064 100.7 4.01
03 4 12.15 0.051 99.9 4
04 6 2:15 0.061 96.7 4
05 8 4:15 0.145 88.8 4
CLA 9 5:15 0.263 88.8 4
21-22.06.2019

11 7:15 0.641 41 3.97

14
01 10:15 0.797 0.0 3.57 1:4

02 24 8:15 0.764 0.0 2.92 1:10

03 27 11:15 0.956 0.0 2.87 1:15
04 30 2:15 0.620 0.0 2.84 1:20

120

100

80

60
OD (%)

40

20

0
0 5 10 15 20 25 30 35
-20
TIEMPO (HORAS)

Grafica 1. Control del oxígeno disuelto durante la corrida de fermentación

 4.5
4
3.5
3

2.5
PH

2
1.5
1

0.5
0
0 5 10 15 20 25 30 35
TIEMPO (HORAS)

Grafica 2. Control del oxígeno disuelto durante la corrida de fermentación

 RESULTADOS DEL GRUPO A

CONCENTRACIÓN INULASA
0.2
0.18
0.16
CONCENTRACIÓN (G/L)

0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 5 10 15 20 25 30 35
TIEMPO (HORAS)

GRAFICA 3. Variación de la producción de la enzima INULASA en (g/L) durante la etapa de

fermentación en el Biostat-Aplus conteniendo 2L de caldo de KLUYVEROMYCES MARXIANUS NRRL-
Y-7571, operando a 150 rpm y velocidad de aireación 15,7882 cm/min, a 30ºC
 EVALUACIÓN DEL KLa

Determinación de la velocidad de aireación

𝐹𝑙𝑢𝑗𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑖𝑟𝑒
𝑣𝑣𝑚 = 𝐹𝑎𝑖𝑟𝑒 = 𝑉𝑠 ∗ 𝐴
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑢𝑡𝑖𝑙

vvm = 1 min-1 Volumen útil = 2L Diámetro tanque = 12,7cm

𝑐𝑚3
𝐿 𝑐𝑚3 2000 𝑐𝑚
𝑚𝑖𝑛
𝐹𝑎𝑖𝑟𝑒 = 2 = 2000 𝑉𝑠 = 𝜋 = 15,7882
𝑚𝑖𝑛 𝑚𝑖𝑛 ∗12,72 𝑚𝑖𝑛
4

Oxigeno disuelto vs Tiempo

90
80
70
60
O2 (%)

50
40
30
20
10
0
0 100 200 300 400 500 600 700
Tiempo (Segundos)

GRAFICA 4. Perfil del nivel de oxígeno disuelto en el tiempo, por aplicación del método dinámico en
el Biostat-Aplus conteniendo 2L de caldo de Kluyveromyces Marxianus NRRL-Y-7571 en su fase
exponencial, operando a 400 rpm y velocidad de aireación 15,7882 cm/min, a 30ºC.
 70

60

50

40
CL(%)

y = -127.36x + 103.41
30 R² = 0.9833

20

10

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Na+dCl/dt

Grafica 5. Perfil para determinar de la pendiente el valor inverso de KLa, por método aplicación del
método dinámico, operando a 400 rpm.
1
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = −
𝐾𝐿 𝑎
1
𝐾𝐿 𝑎 = − = 0,0078518𝑠 −1 = 28.26632ℎ−1
−127.36

Tabla 3. Valores de KLa (h-1) obtenidos para distintos valores de N velocidad de agitación (rpm) en el
fermentador.

N (rpm)
300 400 500
Vs (cm/min)
15,7882 28.26 32,3

A continuación, la gráfica 7 muestra el perfil de respuesta del electrodo de oxígeno,

determinándose los valores de tiempo de respuesta td y la constante de tiempo.
 TIEMPO DE RESPUESTA
5
4.5
y = -0.0043x + 4.5766
4 R² = 0.958
3.5
3
LN (02)

2.5
Series1
2
Linear (Series1)
1.5
1
0.5
0
0 50 100 150 200 250 300 350 400
Tiempo (s)

GRAFICA 6. Determinación del tiempo de respuesta del electrodo de oxígeno.

ln(100%) = −0,0043𝑥 + 4,5766

𝑥(𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎) = 6.644229𝑠
 6.2. Determinación de proteínas

Para la determinación de proteínas se usaron los datos tomados el día

(21.06.2018)

METODO BRADFORD

Tampón
Nº Sol. Std. (ul) Citrato- [ ] (g/L) ABS
fosfato
1 100 0 0.5 0.156
2 80 20 0.4 0.106
3 60 40 0.3 0.090
4 50 50 0.25 0.069
5 40 60 0.2 0.059
6 20 80 0.1 0.019
7 10 90 0.05 0.011
8 0 100 0 0

Tabla 2. Toma de datos de la experiencia del método de Bradford para la determinación de la

concentración producida de enzima INULINASA.

ABSORVANCIA
0.2
0.18 y = 0.389x - 0.005
0.16 R² = 0.9856
0.14
ABSORVANCIA

0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
TIEMPO

Grafica 7. Curva de calibrado estándar para la determinación de proteínas mediante el método

BRADFORD
 Determinación de Proteínas

TIEMPO Nº ABS
(horas) (595 nm)
0 1 0.011
2 2 0.005
4 3 0.025
6 4 0.031
7 5 0.030
8 6 0.035
10 7 0.037
11 8 0.037
13 9 0.035
15 10 0.058

Tabla 3. Toma de datos de la producción de enzima INULINASA usando las muestras depositadas
en los viales durante la fermentación y determinación de la concentración producida de enzima
INULINASA.

CURVA DE CALIBRACIÓN DE LAS PROTEINAS

0.18
0.16 y = 0.3389x - 0.0001
R² = 0.9984
0.14
0.12
ABSORVANCIA

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
-0.02 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
CONCENTRACIÓN

GRAFICA 8. Curva de calibración de proteínas determinada mediante el método de Bradford para

encontrar la variación de la concentración de la enzima INULINASA.
  RESULTADOS DEL GRUPO B

Tabla 4. Toma de datos de la producción de enzima INULINASA usando las muestras depositadas en
los viales durante la fermentación y determinación de la concentración producida de enzima
INULASA.

TIEMPO ABSORVANCIA (540

Nº DEL TUBO DILUCIONES
(horas) nm)

0 1 0,011 0,032753024

2 2 0,005 0,015048687

4 3 0,025 0,074063145

6 4 0,031 0,091767483

7 5 0,03 0,08881676

8 6 0,035 0,103570375

10 7 0,037 0,109471821

11 8 0,037 0,109471821

13 9 0,035 0,103570375

15 10 0,058 0,171437002

CURVA DE CALIBRACIÓN DE LAS PROTEINAS

0.18
0.16 y = 0.3389x - 0.0001
0.14 R² = 0.9984
0.12
ABSORVANCIA

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
-0.02 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
CONCENTRACIÓN

GRAFICA 9. Curva de calibración de proteínas determinada mediante el método de Bradford para

encontrar la variación de la concentración de la enzima INULASA durante el tiempo de
fermentación.
 CONCENTRACIÓN INULASA
0.2
0.18
CONCENTRACIÓN (g/L) 0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 5 10 15 20 25 30 35
TIEMPO (horas)

GRAFICA 10. Variación de la producción de la enzima INULASA en (g/L) durante la etapa de

fermentación en el Biostat-Aplus conteniendo 2L de caldo de KLUYVEROMYCES MARXIANUS NRRL-
Y-7571, operando a 150rpm y velocidad de aireación 15,7882 cm/min, a 30ºC

EVALUACIÓN DEL KLa

Determinación de la velocidad de aireación

𝐹𝑙𝑢𝑗𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑖𝑟𝑒
𝑣𝑣𝑚 = 𝐹𝑎𝑖𝑟𝑒 = 𝑉𝑠 ∗ 𝐴
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑢𝑡𝑖𝑙

vvm = 1 min-1 Volumen útil = 2L Diámetro tanque = 12,7cm

𝑐𝑚3
𝐿 𝑐𝑚3 2000 𝑐𝑚
𝑚𝑖𝑛
𝐹𝑎𝑖𝑟𝑒 = 2 = 2000 𝑉𝑠 = 𝜋 = 15,7882
𝑚𝑖𝑛 𝑚𝑖𝑛 ∗12,72 𝑚𝑖𝑛
4
 80

70

60

CL (%) 50

40

30

20

10

0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
TIEMPO (s)

GRAFICA 11. Perfil del nivel de oxígeno disuelto en el tiempo, por aplicación del método dinámico
en el Biostat-Aplus conteniendo 2L de caldo de Kluyveromyces Marxianus NRRL-Y-7571 en su fase
exponencial, operando a 500rpm y velocidad de aireación 15,7882 cm/min, a 30ºC.

70

60

50

40
CL(%)

y = -111.45x + 147.41
30 R² = 0.9833
20

10

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Na+dCl/dt

Grafica 12. Perfil para determinar de la pendiente el valor inverso de KLa, por método aplicación del
método dinámico, operando a 500 rpm.
1
𝑃𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 = −
𝐾𝐿 𝑎
1
𝐾𝐿 𝑎 = − = 0,00897263𝑠 −1 = 32,301468ℎ−1
−111.45
A continuación la gráfica 7 muestra el perfil de respuesta del electrodo de oxígeno, determinándose
los valores de tiempo de respuesta td y la constante de tiempo.

4 y = -0.0106x + 4.8533
3
R² = 0.9785
Ln (CL%)

0
0 100 200 300 400 500 600
-1

-2

-3
TIEMPO (s)

GRAFICA 13. Determinación del tiempo de respuesta del electrodo de oxígeno.

ln(100%) = −0,0106𝑥 + 4,8533

𝑥(𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑠𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑎) = 23,408473𝑠

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Joao Pauto Bender, Marcio Antonio mazutti, Dibora de Oliveira,

Marco Di Lucclo, and Helen Treichel. Universidad Regional Integrada
del Alto Uruguay y de las Misiones - Departamento de Ingeniería de
Alimentos 2006.
 Becker, J.A.1999. Biotecnología: curso de prácticas de laboratorio.
Editorial Acriba. S.A. (Biblioteca Central UNS)
 Castillo, A., & Chamy, R. (2010). Producción de inulinasa por
levaduras de Kluyveromyces marxianus. Scientia Agropecuaria, 235-
243.
 Fermentation and Biochemical Engineering handbook (Biblioteca de
agroindustria).
VIII. ANEXOS
ANEXO 1

1) Cálculos para concentraciones en el medio de mantención.

 Extracto de levadura
𝑔 1𝐿 𝑚
Concentración= 3(g/L) 3 ∗ =
𝐿 1000 𝑚𝑙 50 𝑚𝑙
𝑚
𝐶= 𝑚 = 0.15𝑔
𝑣
𝑔 1𝐿 𝑚  Agar
3 ∗ = Concentración= 20(g/L)
𝐿 1000 𝑚𝑙 50 𝑚𝑙
𝑚 = 0.15𝑔 𝑚
𝐶=
𝑣
 Peptona
𝑔 1𝐿 𝑚
Concentración= 5(g/L) 20 ∗ =
𝐿 1000 𝑚𝑙 50 𝑚𝑙
𝑚
𝐶= 𝑚 = 1𝑔
𝑣
𝑔 1𝐿 𝑚  Glucosa
5 ∗ = Concentración= 10(g/L)
𝐿 1000 𝑚𝑙 50 𝑚𝑙
𝑚 = 0.25𝑔 𝑚
𝐶=
𝑣
 Extracto de malta
𝑔 1𝐿 𝑚
Concentración= 3(g/L) 10 ∗ =
𝐿 1000 𝑚𝑙 50 𝑚𝑙
𝑚
𝐶= 𝑚 = 0.5𝑔
𝑣
ANEXO 2
2) Cálculos para concentraciones en el medio de activación

 Extracto de levadura
𝑚 = 0.10𝑔
(Merck)
Concentración= 3(g/L)  Peptona (Bioceno)
𝑚 Concentración= 5(ml/L)
𝐶=
𝑣 𝑚
𝐶=
𝑔 1𝐿 𝑚 𝑣
3 ∗ =
𝐿 1000 𝑚𝑙 10 𝑚𝑙 𝑔 1𝐿 𝑚
5 ∗ =
𝑚 = 0.03𝑔 𝐿 1000 𝑚𝑙 10 𝑚𝑙
𝑚 = 0.05𝑔
 Sacarosa
Concentración= 10(g/L)  MgSO4.7H2O (Sigma)
𝑚 Concentración= 0.65 (g/L)
𝐶=
𝑣 𝑚
𝐶=
𝑔 1𝐿 𝑚 𝑣
10 ∗ =
𝐿 1000 𝑚𝑙 10 𝑚𝑙
 𝑔 1𝐿 𝑚
0.65 𝐿 ∗ 1000 𝑚𝑙 = 10 𝑚𝑙
𝑚 = 0.0065

ANEXO 3

3) Cálculos para concentraciones del medio de fermentación:

CÁLCULOS PARA EL MEDIO DE FERMENTACIÓN

 Para extracto de yacón %(v/v):

𝑚𝑙
𝑉 = 26.2 100𝑚𝑙 × 200𝑚𝑙 = 52.4𝑚𝑙.

 Para extracto de levadura %(m/v):

𝑔
𝑚 = 10 × 2𝐿 = 20𝑔.
𝐿
 Para Fosfato monopotásico %(m/v):
𝑔
𝑚=1 × 2𝑙 = 2𝑔.
𝐿
 Para Sulfato de amonio %(m/v):
𝑔
𝑚 = 10 × 2𝐿 = 20𝑔
𝐿
 Para Sulfato de magnesio heptahidratado %(m/v):
𝑔
𝑚 = 0.386 × 2𝐿 = 0.772𝑔.
𝐿
ANEXO 4
Plan de muestreo y registro de datos:
Grupo responsable:………………………………………………………………
Día de la experiencia:……………………………………………………………
Microorganismo K.marxianus NRRL Y-7571. Fuente carbono: Extracto de yacon
pH 4.0 inicial:…………T 30°C N:……..rpm y Q: 2L/min……………

nombre OD pH
Hora Tiempo del
N° Observaciones
(Horas) Absorbancia alumno
(640 nm )
1

CLA

1
2
3
4
5
6
7