TEMA 14.

INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA

1. Introducción

La cromatografía es una técnica relativamente nueva. Los primeros

conocimientos se remiten a hace unos 100 años. Sin embargo, el avance de estas
técnicas ha sido tal, que no se entiende el desarrollo de la química analítica si sus
aplicaciones.

A principios del siglo XX aparecen los primeros conocimientos, ya que Tswett

se dedicó a observar el avance de los colorantes (concretamente de distintos tipos de
clorofila) a lo largo de un papel. Por eso, el nombre de la técnica como conjunto de
cromo (color) y grafo (escritura). Sin embargo, no fue hasta 1930 cuando Tiselius
desarrolló los primeros métodos continuos de cómo llevar a cabo una separación
cromatográfica.

En 1941 aparecen las primeras explicaciones teóricas a la metodología. Así,

Martin y Synge comienzan a explicar la cromatografía de reparto considerándola como
una destilación fraccionada con un elevado número de platos teóricos (Premio Nobel en
1952).

Años más tarde se inician otros tipos de cromatografías. Concretamente en 1947

se desarrolla la cromatografía iónica y en 1952 la cromatografía de gases. Por tanto, los
mayores desarrollos se han llevado a cabo en los últimos 50 años.

2. Terminología útil

La cromatografía se define como método para la separación de los componentes

de una mezcla, los cuales son distribuidos en dos fases, una estacionaria (sólida o
líquida) y otra móvil (líquida o gas). El caso de un gas o un líquido circulando por un
sólido es sencillo de entender; sin embargo, para que un líquido pueda circular por otro,
al igual que en la extracción, los líquidos deben ser inmiscibles.

Los componentes de una muestra van a tener distintas tendencias respecto a cada
una de las fases, produciéndose de esta manera la distribución. El fundamento de la
separación va a basarse en propiedades físicas de las moléculas, como:

a) Solubilidad: cuando aparecen fases líquidas.

b) Adsorción: cuando la fase estacionaria es un sólido.
c) Volatilidad: cuando la fase móvil es un gas.
d) Tamaño de la molécula: ya que en función de este tamaño podrán circular o
no por los poros de la fase sólida
e) Otras: como características ácido-base.

En toda técnica cromatográfica nos vamos a encontrar con dos fases, una
estacionaria y otra móvil. Obviamente, la fase estacionaria estará estacionada o fija;
mientras que la móvil circulará entre la estacionaria.

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 Si la fase estacionaria es un sólido, se le conoce con el nombre de adsorbente.
Dicho de otra forma, la fase está hecha de un compuesto químico que actúa como
adsorbente. En este tipo de técnica lo que se muestra es la tendencia de un compuesto a
quedar adsorbido en la superficie del adsorbente.

Cuando la fase estacionaria es líquida, necesitamos de un medio para mantenerla

fija, necesitamos de un soporte. La manera que tiene el soporte de mantener la fase
líquida es simplemente adsorbiéndola. Para ello, la fase líquida se va a impregnar y
anclar mediante enlaces químicos al soporte, adquiriendo mucha estabilidad. La sílice,
va a actuar tanto como fase estacionaria, como adsorbente; pero también como soporte
para una fase estacionaria líquida.

El término cromatograma se utiliza para designar a la información que

observamos, es decir, a la información que nos da la técnica cromatográfica. Este
cromatograma es distinto en función de la técnica utilizada:

El desarrollo de la técnica consiste en partir de una mezcla y hacer que sea

arrastrada a lo largo de la fase estacionaria para que se separen sus distintos
componentes.

El revelado consiste en poner de manifiesto, de alguna manera, la separación que

hemos llevado a cabo. Así, en el caso de la cromatografía en papel o capa fina, si
tenemos tres componentes separados pero incoloros, debemos revelar su posición en la
placa mediante el uso de luz ultravioleta. Otra manera de llevar a cabo la etapa de
revelado es usando reactivos químicos como yodo o H 2SO4 (este último tiene el
inconveniente de destruir la muestra, ya que la carboniza). En el caso de la columna, el
revelado lo va a llevar a cabo el detector.

Con el término de elusión nos referimos al proceso de pasar la fase móvil a

través de la fase estacionaria. Los eluatos, si nos fijamos en el ejemplo de la columna,
serían cada una de fracciones de fase móvil recogidas:

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 El proceso de separar cada uno de los componentes en distintos eluatos se hace,
sobretodo, en cromatografía preparativa. En química analítica, el fin perseguido no es
preparar la muestra para llevar a cabo una posterior síntesis.

3. Tipos de cromatografía

Existen distintas técnicas cromatográficas. Así, si atendemos al estado de las

fases, las podemos clasificar en:

a) Cromatografía de reparto: tanto la fase móvil como la estacionaria son

líquidos. En ocasiones recibe el nombre de cromatografía líquido-líquido.

b) Cromatografía de adsorción: necesariamente la fase estacionaria tiene que ser

un sólido.

c) Cromatografía de gases: la fase móvil va a estar en estado gas. No va a existir

una cromatografía gas-gas, ya que no podemos tener dos gases y dos fases distintas. Por
tanto, cuando la fase móvil es un gas, la estacionaria podrá ser un sólido, hablando de
cromatografía de gases de adsorción; o un líquido, hablando de cromatografía de gases
de reparto.

Las técnicas cromatográficas, también las podemos clasificar o nombrar

atendiendo al montaje de la técnica:

a) Cromatografía en columna: la fase estacionaria se encuentra en una columna.

La cromatografía de gases, necesariamente, va a llevarse a cabo en columna.

b) Cromatografía plana: el soporte va a ser un papel o una placa (cromatografía

en placa fina).

Por tanto, podremos definir una técnica de la manera más completa, ya que
podemos añadir tanto el término que le corresponde en función del montaje, pero
también el correspondiente según el estado de sus fases.

4. Aplicaciones

4.1. Cualitativas

Desde el punto de vista cualitativo, la cromatografía nos permite ver la presencia

o ausencia de un compuesto. Para ello, en función de la cromatografía aplicada,
usaremos un término u otro. En el caso de la cromatografía plana se usa el Rf:

Evidentemente, la identificación por este parámetro es pobre. Sin embargo, la

ausencia de un componente nos la va a determinar de manera inequívoca.

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 En el caso de la cromatografía en columna, el parámetro medido es el tiempo de
retención, es decir, el tiempo que transcurre desde que introducimos la muestra hasta
que es detectado el componente por el detector:

Esta señal también va a ser pobre para decir con seguridad que tenemos un
componente y no uno similar, pero sí va a ser muy útil para determinar la ausencia.

4.2. Cuantitativas

Las aplicaciones cuantitativas también van a depender en función del montaje de

la cromatografía:

a) Columna: usaremos el cromatograma. La altura o área de la señal o pico

cromatográfico va a ser proporcional a la cantidad de compuesto. Por tanto, mediante un
calibrado previo, podremos obtener la cantidad de compuesto en la muestra.

b) Plana: tenemos distintas posibilidades, en función de cómo llevemos a cabo el

revelado. Así, si el revelado lo hacemos con H2SO4, cuanto más negras sean las manchas
obtenidas, más especie contendré. Por tanto, relacionaremos la oscuridad con la
concentración. Para ellos necesitaremos un densitómetro que nos permite comparar las
densidades de la mancha con la del resto de la placa. Lógicamente, necesitaremos
realizar un calibrado previo.

Otra forma más engorrosa, pero más precisa, de obtener información cuantitativa
mediante cromatografía plana es recortando la zona en la que ha quedado nuestro
componente y disolviéndola en el disolvente apropiado. Dado que la disolución tendrá
un único componente, podremos llevar a cabo la medida de la concentración mediante
cualquiera de las técnicas explicadas en temas anteriores.

De manera general, cuando hablamos de análisis, vamos a usar cromatografía en

columna.

5. Teoría de Martin y Synge

Esta teoría se basa en una seria de suposiciones las cuales permiten explicar
cómo se lleva a cabo la separación de las moléculas por cromatografía. Obviamente, las
moléculas que vamos a separar tienen que tener diferente alguna de sus propiedades,
para, en base a ella, realizar dicha separación.

La teoría de Martin y Synge se centra en al cromatografía en columna. Para

ellos, una columna va a estar dividida en un número elevado de platos teóricos y
contendrá tanto la fase móvil como la fase estacionaria .En cada uno de los platos van a
cumplirse las condiciones de equilibrio de reparto, las cuales dependen de las constantes
de los componentes.

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 Imaginemos una columna con 5 platos teóricos, el la cual introducimos una
muestra con las siguientes características:

Componente A: 729 mg siendo KA = 0,5

Componente B: 729 mg siendo KB = 2,0

En estas condiciones, al añadir el eluyente, se irán arrastrando los componentes

por los distintos platos teóricos. Así, el equilibrio que se alcanzaría en el primer plato
sería:

Aunque esquemáticamente hayamos separado claramente la fase móvil y la

estacionaria, en la realidad no existe esta separación tan limitada. Una vez que se
alcance el equilibrio en este primer plato, añadiremos más cantidad de eluyente. Para
simplificar cálculos vamos a suponer que añadimos un volumen de eluyente igual al
existente en el primer plato teórico, quedando desplazado este volumen al segundo
plato:

Del mismo modo, se volverá a alcanzar el equilibrio en ambos platos. Si

continuamos operando de la misma manera, el resultado final sería:

El resultado es que en el primer plato abunda el componente A; mientras que en

el último plato tendremos mayoría de B. Si introducimos más platos teóricos, podríamos
llegar a la separación completa de los componentes A y B. este razonamiento es muy
similar al que hacíamos en la extracción a contracorriente, pero en cromatografía
estamos operando de manera continua.

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 Por tanto, para que se produzca la separación, podemos establecer dos requisitos
indispensables. El primero de ellos, sería que los componentes de la muestra tienen que
moverse a lo largo de la columna, ya que si no tuvieran esta tendencia al avance
quedarían retenidos constantemente en el primer plato. El segundo de los requisitos es
que además de desplazarse deben hacerlo a distinta velocidad. La constante de reparto
va a ser la que me indique qué componente se mueve más rápidamente, y por tanto, será
el que llegue antes al final de la columna.

Esta teoría, tal y como Martin y Synge la formularon requiere de un elevado

número de platos teóricos. Estos platos teóricos deben cumplir una serie de propiedades:

a) Deben tener un relleno uniforme para obtener platos idénticos, de manera que
la altura de cada plato sea idéntica para todos ellos.

b) El volumen efectivo de cada plato, V h, sea constante. Este hecho es lógico

cuando los platos son idénticos.

c) En cada plato debe alcanzarse el equilibrio. Esto se entiende muy bien en una
separación llevada a cabo en etapas. Sin embargo, el existir un movimiento de la fase
móvil por la estacionaria, el equilibrio apenas va a durar.

Teniendo todo esto en cuenta, podemos expresarlo en función de fracciones

molares, siendo y la fracción molar de la fase estacionaria y x la fracción de la fase
móvil:
n

 y  x   1  dV V   dV V 
n

 h h

En este desarrollo en potencia del binomio se sabe que en un plato r tras n

adiciones, lo que queda en el plato viene dado por la siguiente función:

r nr
f n ,r  n! / r! n  r !   dV   1  dV 
 Vh   Vh 

Esta función nos da una distribución similar a la de Gauss, siendo más parecida
cuantos más platos teóricos tengamos. De hecho, la distribución gráfica sería:

Esta teoría aunque pretende explicar lo que ocurre al realizar una cromatografía,
se encuentra con algunas limitaciones:

a) Para que el equilibrio establecido en cada plato sea rápido (por no decir
instantáneo), se requiere gran superficie de contacto entre las fases.

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 b) Para poder alcanzar el equilibrio se necesitan flujos pequeños. Sin embargo, el
uso de flujos pequeños hace que la fase móvil se desplace lentamente y comience a
predominar el proceso de difusión. Al predominar este proceso, la separación
cromatográfica desaparece, ya que cualquier sustancia en un líquido va a difundir de las
zonas más concentradas a más diluidas:

Podemos observar gráficamente, como lo conseguido por la separación se pierde

con la difusión.

c) Los solutos no se comportan idealmente, sino que van a interaccionar entre sí,
no se van a disolver uniformemente…

d) No toda la muestra se introduce en el primer plato. Esto es debido a que los

platos teóricos tienen un volumen muy pequeño en comparación con las muestras
normalmente usadas, las cuales suelen ocupar unos 10-15 platos.

6. Teoría cinética

Desde el punto de vista de la química analítica lo más importante de un sistema

cromatográfico, o de cualquier técnica de separación, es su poder de resolución. Dicho
de otra forma, lo que interesa saber es si una columna va a tener la resolución suficiente
como para separar mi problema.

Para determinar la eficacia de una columna se usa lo que se conoce como teoría
cinética. Esta teoría nos habla de una relación existente entre la velocidad de migración
y la anchura de banda. Está claro que cuanto menor sea la velocidad de migración, las
bandas más se ensancharán. Dicho de otra forma, cuanto más tarde un compuesto en
salir de la columna, la distribución gausiana será más grande.

Además, la anchura de la banda está relacionada con la eficacia de la columna.

Imaginemos un proceso cromatográfico que dura 30 minutos, siendo su cromatograma
el siguiente:

Vemos que la muestra tenía 10 componentes, los cuales se separan a lo largo de

los 30 minutos. Esto implica que la anchura de banda de cada uno de los componentes
no puede sobrepasar ese valor máximo, ya que sino solaparían con otros componentes y
no resolveríamos completamente la muestra. Por tanto, cuanto más estrechas sean las
anchuras de banda, más compuestos podemos separar, y mayor es la eficacia de la
columna.

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 La eficacia se relaciona con el número de platos teóricos. A mayor número de
platos, más equilibrios se producirán, y por tanto, tendremos más posibilidad de
separación. También podemos relacionar la eficacia con la altura del plato, ya que
cuanto más pequeña sea esta altura, más platos teóricos entrarán en una columna. De
esta manera, surge una ecuación para calcular el número de platos que tiene una
columna en función de su longitud y de la altura de cada plato:

L
N 
H

El parámetro estadístico que nos evalúa la anchura de una curva gausiana es la

varianza o la desviación típica. Teniendo en cuenta estos parámetros, podemos definir la
eficacia en términos de varianza por unidad de longitud o ensanchamiento por unidad de
longitud:

2
H 
L

Dado que en cromatografía no medidos longitudes sino tiempo, podemos definir

la siguiente expresión:


L
tr

Si dibujamos la distribución gausiana podemos definir el parámetro W, el cual es

la base del pico:

El valor de W depende de tanto por ciento de confianza. Así, para un 96% de

confianza es de 4τ. Suponiendo este valor, podemos obtener las siguientes expresiones:

W L W2 L
  H
4  tr 16  t r2

Con estas magnitudes podemos concluir:

2
t 
N  16   r 
W 

Esta expresión es la que se usa en química analítica para saber la eficacia de una
columna. Cuantos más platos teóricos obtengamos, más eficaz es. También nos sirve
para ver el deterioro de la fase estacionaria de una columna, ya que al uso el número de
platos teóricos irán disminuyendo.

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