INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA

QUÍMICA E INDUSTRIAS EXTRACTIVAS
DEPARTAMENTO DE FORMACIÓN BÁSICA
PERIODO 20/1

PRACTICA 3:
CROMATOGRAFIA EN
COLUMNA

Alumno: Lopez Ruiz Leonardo

Grupo: 2IM33
Profesora: Murillo Villagrana Apolonia
 LABORATORIO DE QUIMICA DE LOS HIDROCARBUROS

PRACTICA 1: MODELOS MOLECULARES

Objetivos:
1.- Describir las técnicas cromatograficas de: elución, análisis frontal y
desplazamiento, tomando como ejemplo la cromatografía en columna.
2.- Desarrollar la cromatografía en columna empleando un solo eluyente o
mezcla de varios
3.- Purificar por columna el naranja II y controlar su separación por placa fina.
4.- Distinguir los distintos tipos de cromatografia
5.- Representar lo ocurrido en la experimental mediante fotografías.
6.- Diferenciar los distintos tipos de purificación.
7.- Establecer la importancia de la cromatografía en la industria.
8.- Analizar muestras de resultados
9.- Interpretar los resultados
10.- Relacionar los conceptos vistos en teoría en la experimentación

Alcances:
1.- Lograr los objetivos de la práctica.
2.- Aplicar la metodología correcta al realizar la experimentación.
3.- Establecer las representaciones de distintos tipos de cromatografía.
4.- Relacionar los distintos tipos de cromatografía.
5.- Conocer el material con el que trabajaremos a lo largo del laboratorio.
6.- Hacer las implementaciones de lo visto en teoría.
7.- Establecer los usos de la cromatografía.

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Metas:
1.- Lograr la purificación de naranja II
2.- Realizar un claro análisis del procedimiento para realizar una cromatografía
3.- Resolver correctamente los ejercicios propuestos para la práctica.
4.- Establecer los pasos a realizar para la resolución de problemas.

Investigación bibliográfica sobre el tema de la práctica.

Cromatografia

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de

mezclas complejas cuyo objetivo es separar los distintos componentes, la cual
tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia; en el principio de retención
selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.
Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos dan como
resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y, por tanto, una
separación efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente
de la mezcla.
La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que se excluyen
mutuamente:
 Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que
puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
 Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica).
En este caso, las cantidades de material empleadas suelen ser muy
pequeñas.

La cromatografía, (proviene del griego χρῶμα chrōma y γράφω gráphō, que

significan respectivamente "color" y "escribir, registrar", literalmente "escritura

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de color", o "registro de color") , fue empleada originalmente con sustancias

coloreadas.
Ya en 1850, Runge describió la formación de zonas coloreadas cuando se
depositaban gotas de sustancias colorantes sobre papel secante, pero el
desarrollo más importante vino con los experimentos de Mijaíl Tsvet (1872-
1919), que empleó por primera vez en 1906 el término "cromatografía". A
comienzos del año 1903, Mijaíl Tsvet, botánico ruso, logró separar una mezcla
de pigmentos de plantas (clorofilas) en una columna de carbonato de calcio. Más
tarde, en 1910, cromatografió un extracto de yema de huevo en una columna
de inulina. Sus investigaciones, sin embargo, no fueron utilizadas por otros
investigadores hasta 1931. Esta demora quizá se debió al hecho de que los
trabajos de Tsvet fueron publicados en ruso y en una revista que no tenía amplia
circulación.
El rápido desarrollo de la cromatografía como herramienta analítica sensible no
ocurrió hasta 1931, cuando Kuhn, con Lederer y con Winterstein, empleó la
técnica para el análisis de pigmentos de plantas, confirmando los primeros
trabajos de Tsvet y su predicción de que el caroteno no era una sola sustancia,
sino una mezcla de varios homólogos estrechamente relacionados. Al mismo
tiempo, el tamaño de las columnas empleadas fue aumentando para poder
recuperar los componentes separados. La técnica, por lo tanto, no era solo
analítica sino preparatoria.
La cromatografía en columna por estos tiempo tenía aplicaciones limitadas, dado
que los componentes que se podían separar eran invariablemente lípidos.
Pasaron 10 años antes de que Martin y Synge desarrollaran una técnica mediante
la cual se pudieran separar compuestos acuosos o hidrofílicos. Esto marcó un
nuevo interés en la técnica y en 1944 Consden, Gordon y Martin lograron separar
mezclas complejas de aminoácidos en papel y fueron premiados con el Premio
Nobel por sus trabajos. Al poco tiempo, en 1947, en Estados Unidos de
Norteamérica, la Comisión de Energía Atómica dio a conocer información sobre
el uso de la cromatografía de intercambio iónico para la separación de productos
de fisión nuclear.
El desarrollo más reciente en el campo de la cromatografía se deriva de los
trabajos de Stahl, quien en 1956 presentó una técnica práctica mediante la cual
una capa delgada sílice gel, celulosa o alúmina era diseminada sobre una placa
de vidrio. Esta técnica, llamada cromatografía de capa fina, resultó en un análisis
más rápido y más sensible para el examen de mezclas complejas y, en muchos

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casos, ha sustituido a otros métodos similares más antiguos de cromatografía en

papel toche.
En 1959, Porath y Flodin introdujeron una nueva técnica llamada cromatografía
de filtración de gel. Esta se ha convertido en una poderosa y nueva herramienta
para la separación de sustancias de alto peso molecular, particularmente las
proteínas, y ha encontrado muchas aplicaciones en los campos de la
bioquímica, la medicina, la fisiología y la biología. La mayoría de las técnicas
de filtración en gel utilizan columnas y recientemente se han hecho trabajos con
una combinación de filtración en gel y materiales de intercambio iónico,
logrando que las separaciones complejas sean extremadamente rápidas y
eficientes.
Los primeros equipos de cromatografía de gases aparecieron en el mercado a
mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC High Performance Liquid Chromatography, en inglés)
comenzó a desarrollarse en los años 1960, aumentando su importancia en las
décadas siguientes, hasta convertirse en la técnica cromatográfica más empleada.
Sin embargo esto se irá modificando con el paso de los años.

Términos empleados en cromatografía

 Analito es la sustancia que se va a separar durante la cromatografía.

 Fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un
líquido (cromatografía de líquidos o CEC). un gas (cromatografía de gases)
o un fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos). La muestra
que se está separando/analizando (formada de analito/s y el disolvente) se
inyecta en la fase móvil que se mueve a través de la columna. En el caso de
la cromatografía líquida de alta resolución, HPLC, la fase móvil es un
disolvente no polar como el hexano (fase normal) o bien algún disolvente
polar (cromatografía de fase reversa).
 Fase estacionaria es la sustancia que está fija en una posición durante la
cromatografía. Un ejemplo es la capa de gel de sílice en la cromatografía en
capa fina.
 Cromatografía analítica se emplea para determinar la existencia y
posiblemente también la concentración de un analito en una muestra.

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 Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las
partículas de soporte o a las paredes internas de la columa.
 Cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de
separación óptima, los diferentes picos o manchas del cromatograma se
corresponden a los componentes de la mezcla separada.
 Cromatógrafo es el equipo que permite una separación sofisticada. Por
ejemplo, un cromatógrafo de gases o un cromatógrafo de líquidos.
 Cromatografía es el método físico de separación en el cual los componentes
que se van a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es
estacionaria (fase estacionaria) mientras la otra (la fase móvil) se mueve en
una dirección definida.
 Eluyente es la fase móvil que atraviesa la columna.
 Serie eluotrópica es una lista de disolventes clasificados según su poder de
dilución.
 Fase inmovilizada es una fase estacionaria que está inmovilizada sobre
partículas de soporte, o en la pared interior del tubo contenedor o columna
 Cromatografía preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de
sustancia para un uso posterior, más que para análisis.
 Tiempo de retención es el tiempo característico que tarda un analito
particular en pasar a través del sistema (desde la columna de entrada hasta el
detector) bajo las condiciones fijadas. Véase también: Índice de retención de
Kovats
 Muestra es la materia que va a ser analizada en la cromatografía. Puede
consistir en un simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla
es tratada en el curso del análisis, la fase o fases que contienen los analitos
de interés es llamada igualmente muestra mientras el resto de sustancias cuya
separación no resulta de interés es llamada residuo.
 Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.
 Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la
fase móvil líquida en cromatografía de líquidos.
 Capacidad de carga Es la cantidad máxima de muestra que puede ser
separada en una sola carga.
 Capacidad de fraccionamiento Es el número máximo de componentes que
pueden ser separados en una sola operación.
 Selectividad Es la capacidad de poder discriminar y distinguir entre dos
componentes.

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Cromatografía en columna

La cromatografía en columna es quizás el método más general, utilizado para

la separación, a la vez que para la purificación, de diferentes compuestos
orgánicos que se encuentren en estado sólido o líquido.
En este tipo de cromatografía, la fase estacionaria utilizada, es decir,
el absorbente, se coloca en el interior de una columna de vidrio, la cual finaliza
con una llave para controlar el paso de sustancias al exterior de la columna. La
fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase móvil. Seguidamente la
mezcla orgánica que nos interesa separar la depositamos por la parte superior de
la fase estacionaria, y así la fase móvil podrá ir atravesando el sistema.
Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase móvil, poco a poco
saldrán de la columna cromatográfica, y se recogen en fracciones. Las fracciones
menos polares, que son por lo general las que se retienen poco o nada en el
absorbente, serán las primeras en salir de la columna. En cambio, las sustancias
más polares, quedan retenidas por más tiempo en el absorbente, y a menudo es
necesario el uso de diferentes disolventes con la finalidad de incrementar su
polaridad para que sean arrastradas por estos.
El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto por la columna, se
conoce con el nombre de tiempo de retención. Este tiempo varía, siendo
característico de cada compuesto en una condiciones cromatográficas
determinadas, que varían según el absorbente usado, el disolvente, la presión, el
diámetro que tenga la columna utilizada, etc.
El absorbente mayormente utilizado para las cromatografías en columna, es el
gel de sílice. A veces, en sustitución del gel de sílice, cuando éste es
incompatible con la mezcla a cromatografiar, se utilizan la alúmina o el florisil
(silicato magnésico). La cromatografía en columna puede realizarse por
gravedad o a media presión. Cuando se realiza a media presión, se conecta la
cabeza de la columna a un compresor o a una línea de aire comprimido.
La medida de las partículas de gel de sílice para realizar las cromatografías a
media presión debe ser más pequeñas que en el caso de la cromatografía por
gravedad. Si en la cromatografía por gravedad utilizásemos un gel de sílice con
un tamaño de partículas más pequeñas, no se produciría elución, pues se

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impediría el flujo del disolvente. Pero en cambio, si aplicamos presión, entonces

debido a la fuerza si se produciría la elución por el disolvente.
A causa de la disminución del tamaño de las partículas del absorbente, se
produce una separación más eficaz. Generalmente la cromatografía a media
presión, produce mejores resultados que la cromatografía por gravedad, y
además, al ser más rápida, es la más utilizada.
Cuando vamos a realizar una cromatografía en columna, lo primero que
debemos hacer es elegir un disolvente adaptado para nuestro caso, para así
optimizar la separación de los componentes de la mezcla. Dicha operación se
produce a través de cromatografía analítica en capa fina. La variante más
influyente en la eficacia de la separación de la cromatografía a media presión
usando gel de sílice es el diámetro de la columna, así como la cantidad de gel
utilizado.
Para elegir el disolvente, primero se lleva a cabo una cromatografía en capa fina
de la muestra a analizar. El disolvente debe producir una buena separación de
los componentes de la mezcla en la placa, colocando el componente menos polar
a un Rf cercano a 0.3. En el caso de columnas pequeñas, lo ideal es usar un
eluyente menos polar que el conseguido en el resultado de la cromatografía en
placa.
A veces se utilizan mezclas de disolventes y se hace una elución en gradiente.
Para esto, la cromatografía se inicia con una mezcla de disolventes de polaridad
adecuada para poder separar el componente que posea mayor Rf, y así, una vez
recogido, se aumentará poco a poco la polaridad para poder ir separando los
componentes más polares. Si cuando se empieza la cromatografía se usa un
disolvente excesivamente polar, los componentes de la mezcla eluirán
conjuntamente, lo que llevaría a que la separación no tenga lugar. Una de las
mezclas de disolventes más utilizadas es hexano/acetato de etilo.

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Cuestionario

1.- ¿Cuáles son los disolventes más utilizados en este método?

Hexano y acetato
2.- ¿Qué se tiene que hacer para elegir un disolvente?
Para elegir el disolvente, primero se lleva a cabo una cromatografía en capa fina
de la muestra a analizar. El disolvente debe producir una buena separación de
los componentes de la mezcla en la placa, colocando el componente menos polar
a un Rf cercano a 0.3. En el caso de columnas pequeñas, lo ideal es usar un
eluyente menos polar que el conseguido en el resultado de la cromatografía en
placa.
3.- ¿Para que se utiliza la cromatografía?
Es utilizado para la separación, a la vez que para la purificación, de diferentes
compuestos orgánicos que se encuentren en estado sólido o líquido.
4.- ¿Cuál es la fase móvil?
Es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un líquido
(cromatografía de líquidos o CEC). un gas (cromatografía de gases) o un fluido
supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos). La muestra que se está
separando/analizando (formada de analito/s y el disolvente) se inyecta en la fase
móvil que se mueve a través de la columna. En el caso de la cromatografía
líquida de alta resolución, HPLC, la fase móvil es un disolvente no polar como
el hexano (fase normal) o bien algún disolvente polar (cromatografía de fase
reversa).
5.- ¿Cuál es la fase estacionaria?
Es la sustancia que está fija en una posición durante la cromatografía. Un
ejemplo es la capa de gel de sílice en la cromatografía en capa fina.
6.- ¿Qué es la cromatografía analítica?
Se emplea para determinar la existencia y posiblemente también la
concentración de un analito en una muestra.
7.- ¿Qué es el analito?
Es la sustancia que se va a separar durante la cromatografía.

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8.- ¿Qué es la fase enlazada?

Es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partículas de soporte
o a las paredes internas de la columa.

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