Laboratorio Número 3.

Anexo a la introducción:
Se realizó además una extracción a libre elección, utilizando el protocolo de
extracción de ADN proporcionado por Cerda y Díaz (2013) para Pino Pátula,
además de la valiosa ayuda del profesor, se acortaron los tiempos de los
procedimientos, utilizando una metodología un poco reestructurada. En este caso
se utilizaron diferentes lisis y compuestos químicos, que comúnmente no se
utilizaron para las extracciones anteriores, como es el caso del Beta-
mercaptoetanol, entre otros que más adelante se describen.
A modo de conclusión, los tres laboratorios se llevaron a cabo sin mayores
problemas, siguiendo el procedimiento del profesor con las diferentes
extracciones, acertando en los resultados esperados (suspensión final), donde se
apreciaba a contra luz las hebras de información genética de la sangre, siete
cueros y pino pátula.

Marco teórico:
Pino patula
Árbol de porte mediano a grande, que en ejemplares longevos puede alcanzar
alturas de hasta 40 m y 120 cm de diámetro. El tronco es recto, cilíndrico en un
comienzo y bastante cónico en casi toda su longitud. En árboles jóvenes,
inicialmente la corteza es lisa y rojiza, y luego, ésta se torna marrón, áspera y se
desprende en escamas. La distribución de las ramas es des-uniforme, aunque en
general son verticiladas, las ramas pequeñas son escamosas y rojizas. Los
rebrotes con algunos nódulos glabros, son verdes pálidos hasta pardo rojizos. La
copa es extendida con ramas largas y colgantes. Esta especie desarrolla un buen
sistema radical, pivotante y profundo. (Ospina et al, 2011)
Se le explota principalmente por su buena calidad de papel que proporciona y se
le ha introducido en diversas partes del mundo. Se ha plantado en grandes
altitudes en Ecuador (3500 m),
Bolivia, Colombia (3300 m), Kenia, Tanzania, Angola, Zimbabue, Papúa Nueva
Guinea, Hawái (3000 m). En Hawái está reemplazando a los herbazales alpinos
nativos. Es cultivado en más bajas altitudes que en su país de origen: Sur
de Brasil, Sudáfrica, India, y en las provincias argentinas de Córdoba y San Luis
es plantado con fines de forestación para crear bosques artificiales en tierras que
anteriormente estaban cubiertas por matorrales. Ha sido introducido cerca del
nivel del mar: Nueva Gales del Sur, Australia, donde se expande naturalmente por
el viento y es muy favorecido por las lluvias que son más abundantes en verano.
También ha sido introducido en Nueva Zelanda con propósitos comerciales y está
totalmente naturalizado. También se le ha introducido en el Reino Unido como
ornamental y crece bien. (Richardson, 2005)

Las técnicas moleculares requieren el aislamiento de ADN genómico de pureza

apropiada para la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) y digestión
enzimática (Katterman & Shattuck, 1983; Peterson, Boehm & Stack, 1997). El
crecimiento del número de protocolos de extracción de ADN para especies de
plantas específicas sugiere que la extracción de ADN no es siempre simple y los
protocolos publicados no son necesariamente reproducibles para todas las
especies (Porebski, Bailey & Baum, 1997). El problema a menudo encontrado
durante la extracción de ADN es separar el ADN de los contaminantes que existen
naturalmente en la célula de la planta, tales como polisacáridos y compuestos
fenólicos (Pandey, Adams & Flournoy, 1996; Porebski et al., 1997). Estos
compuestos en sus formas oxidadas se enlazan covalentemente a los ácidos
nucleicos durante la extracción y los inutilizan para la mayoría de las aplicaciones
en investigación (Katterman & Shattuck, 1983; Peterson et al., 1997). Los
polisacáridos son visualmente evidentes en extracciones de ADN por su textura
viscosa, como de goma, y hacen que el ADN sea no manejable en el pipeteo y no
amplificable en el PCR debido a la inhibición de la Taq ADN polimerasa (Fang,
Hammar & Grumet, 1992).
Técnica RAPD
La técnica de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD) es un método simple
para detectar el polimorfismo genético del ADN. La habilidad de detectar regiones
altamente variables en el ADN a partir de un método rápido tiene una gran
importancia en las investigaciones biomédicas, en la detección de varios tipos de
daños y mutaciones en el ADN, en la caracterización de aislamientos, en el mapeo
de genes, en el estudio de poblaciones, en la identificación de cepas, en estudios
epidemiológicos y taxonómicos, así como en el análisis de rasgos simples y
complejos del fenotipo como es el fenómeno de la resistencia. (Fraga, 2004)
Los RAPDs son una técnica que consiste en la amplificación de segmentos de
ADN con iniciadores pequeños (generalmente de 10 nucleótidos de longitud) de
secuencias aleatorias no-palindrómicas, con un contenido de G + C entre 50 y
80%, (Lynch y Milligan 1994). La secuencia del iniciador es elegida a priori de
manera arbitraria y sólo se utiliza un iniciador por reacción, que actuará al mismo
tiempo como iniciador sentido y antisentido. Los fragmentos obtenidos se
visualizan como un patrón de bandeo característico del individuo y cada banda
observada se considera un locus. La presencia o la ausencia de las bandas entre
individuos se deben a cambios en la secuencia (o a la pérdida) de los sitios a los
que se alinea el iniciador. La inserción o eliminación de nucleótidos en la
secuencia intermedia entre los dos sitios de acoplamiento, aumentará o disminuirá
el tamaño de la molécula amplificada. (Navarro, 1999)
Resultados:
Bibliografía Citada
 Ospina. C.M., Hernández R.R, et al (2011). El pino pátula. Serie de cartillas
divulgativas. 05-15.
 Fraga J., Pelayo L. La técnica de RAPD: Obtención de marcadores
genéticos de patogenisidad en Trichomonas vaginalis y Giardia lamblia.
Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología v.24 n. Sup 1. 1
Caracas Noviembre 2004.
 Navarro Q. A. 1999. Estructura genética y procesos de especiación de
Agave cerulata (Trel) y Agave subsimplex (Trel.) en el desierto sonorense a
partir de RAPDs. Tesis de licenciatura. Facultad de Ciencias, UNAM.
México D.F. 96 pp
 Fang, G., Hammar, S. & Grumet, R. (1992). A quick and inexpensive
method for removing polysaccharides from plant genomic DNA.
Biofeedback, 13(1), 52- 54
 Katterman, F. R. H. & Shattuck, V. I. (1983). An effective method of DNA
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amounts of phenolic terpenoids and tannins. Prep Biochem, (13), 347–359.
 Pandey, R. N., Adams, R. P. & Flournoy, L. E. (1996). Inhibition of random
amplified polymorphic DNAs (RAPDs) by plant polysaccharides. Plant Mol
Biol Rep, (14), 17-22
 Porebski, S., Bailey, L. G. & Baum, B. R. (1997). Modification of a CTAB
DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and
polyphenol components. Plant Mol Biol Rep, 15(1), 8-15.
 Peterson, D. G., Boehm, K. S. & Stack, S. M. (1997). Isolation of milligram
quantities of nuclear DNA from tomato (Lycopersicon esculentum), a plant
containing high levels of polyphenolic compounds. Plant Mol Biol Rep,
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 Katterman, F. R. H. & Shattuck, V. I. (1983). An effective method of DNA
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 Lynch M. y B.G. Milligan. 1994. Analysis of population genetic structure with
RAPD markers. Molecular Ecology 3:91-99.
 Richardson D.M. (Ed) 2005. Ecology and biogeography of Pinus.
Department of Conservation. South Island Wilding Conifer Strategy. New
Zealand.