MICROBIOLOGÍA EXPERIMENTAL

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Resumen

Se identificó un método de bajo costo y de buen rendimiento para la obtención de

una proteína bajo una purificación simulada, tomando en cuenta las propiedades
físico químicas de la proteína.

Introducción
Las técnicas de separación y purificación de proteínas son de gran importancia en el
área de las ciencias biológicas y de la biotecnología, pues de esta manera se
puede conocer la función que éstas poseen en las células (ya sea estructurales,
enzimáticas, de transporte, entre otras). Las técnicas de purificación se basan en las
propiedades físicas y químicas de estas moléculas, e implican la separación de una
proteína de una mezcla de moléculas con características similares.
Las técnicas que sirven para separar y purificar proteínas pueden ser de
precipitación, adsorción, electroforéticas, y cromatográficas; cada una de estas tiene
sus variantes, que se basan y se eligen dependiendo de las propiedades de la
proteína que se desee purificar.

MATERIAL
La técnica de purificación se llevó a cabo mediante el uso del software Protein
Purification,disponible online en la dirección http://www.agbooth.com/pp_ajax/.

MÉTODOS

Se tiene una mezcla de proteínas con

las siguientes características :

Se examina la mezcla mediante

electroforesis en gel de poliacrilamida
bidimensional (2D-PAGE) ,esto separa
las proteínas a través de una solución
o un gel que tiene un gradiente de pH
estable que aumenta desde el ánodo
al cátodo, y cada proteína migra
donde el pH coincida con su pI
Se observan tres puntos que
corresponden a cada una de las
proteínas en la mezcla, en base a esto
se quiere realizar la purificación de la
proteína de 20K de pH 7.5
aprovechando sus propiedades
fisicoquímicas.
Para realizar la purificación de la
proteína con base a las propiedades
observadas se realiza una
cromatografía por intercambio iónico
utilizando un medio de DEAE-celulosa
Se utiliza esta técnica debido a las
interacciones electrostáticas entre las
proteínas de la muestra y los grupos
cargados de la columna,p​ara poder
conocer qué columna utilizar es
necesario conocer el punto isoeléctrico
de la proteína para saber a qué pH
trabajar en la columna y de esta
manera predecir si la proteína se
encontrará carga positiva o
negativamente, y así, si la columna a
utilizar será intercambiadora de
aniones o cationes.
Mi proteína de estudio es estable a
valores de pH de entre 2.5 y 11.5, por
lo que el valor de pI debía encontrarse
en ese rango, y posiblemente en un
valor intermedio.
Entonces, se trabajó a un pH de 7,
pues la proteína se encontraría
cargada negativamente, utilizando así
una columna intercambiadora de
DEAE – Celulosa ya que al contener
una amina terciaria como grupo
ionizable a pH neutro se encontrará
cargada positivamente y podrá cumplir
la función de intercambiador de
aniones.
La gráfica muestra la absorbancia de
cada fracción a 280 nm y se observa
que en en la fracción 32 empieza a
observarse el gradiente de
sal,observando asimismo que en la
fracción 105 se lleva a cabo la
interacción con una de las proteínas
Para corroborar la separación de la
proteína se observa su actividad
enzimática, separando las fracciones
donde resultó positivo dicha actividad
realizado posteriormente una
electroforesis.
La electroforesis realizada se llevó a
cabo mediante un gel de
poliacrilamida (PAGE),La primera
electroforesis realizada fue de una
dimensión, donde se separan las
proteínas en base a su peso
molecular.
Al observar que se tiene únicamente
una banda, no podemos asegurar que
es la única proteina en la muestra por
ello, se realiza la electroforesis en dos
dimensiones y se observa que
realmente se obtiene la purificación de
la proteína con un rendimiento del
99.9% y un costo de 0.60
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Se verifica con western blot en una

dimensión y se concluye que se
obtuvo exitosamente la proteína
purificada.

CONCLUSIONES
Este método se utilizó ya que es el
más fácil de utilizar debido a las
propiedades físicas y químicas de mi
proteina, ya que a partir de éstas se
seleccionaron los métodos más
adecuados para su separación y
purificación a partir de una mezcla
proteica, obteniendo así un bajo costo
y el mayor rendimiento posible.
REFERENCIAS
Voet, Donald; et. al. “Fundamentos de
Bioquímica. La vida a nivel molecular”.
2ª Edición. Editorial Médica
Panamericana. España, 2009. Págs.
98, 101- 103, 105-107.
- Software utilizado:
http://www.agbooth.com/pp_ajax/