AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCIÓN E IMPUNIDAD

DOCENTE CARLOS ESQUECHE ANGELES

CURSO INSTRUMENTOS DE MICROSCOPIA

ALUMNO BARDALES DIAZ JHIMMY

ESPECIALIDAD LABORATORIO CLINICO

CICLO III

TURNO TARDE
 CAJAMARCA, JUNIO DEL 2019
INTRODUCCION
Microscopía de fluorescencia: Descubierto en 1908 por Köhler y Siedentopf, y se basa en
que una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es
estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas
luminosos.
Siendo escasas las moléculas autofluorecentes, su aplicación más difundida es para
revelar una fluorescencia agregada, como en la detección de antígenos o anticuerpos.
También se puede inyectar moléculas fluorescentes específicas en un animal o
directamente en células y usarlas como marcadores.
Microscopía de fluorescencia es una herramienta analítica muy poderosa que combina las
propiedades de aumento de la microscopia ligera con la visualización de la fluorescencia.
La fluorescencia es un fenómeno que implica la absorción y la emisión de una pequeña
gama de ondas de luz por una molécula fluorescente conocida como un fluoróforos.
Microscopía de fluorescencia se logra en conjunto con el microscopio óptico básico
mediante la adición de una fuente de luz potente, filtros especializados y un medio de
fluorescencia de etiquetado una muestra. La microscopía de fluorescencia como el
mecanismo de fluorescencia, cambió. También da ejemplos de las numerosas formas de
fluorescencia una muestra incluyendo el uso de fluorescencia etiquetados anticuerpos y
proteínas, ácidos nucleicos tintes fluorescentes con y la adición de proteínas naturalmente
fluorescentes a una muestra de la etiqueta. Los principales componentes del microscopio
de fluorescencia como una fuente de luz de xenón o mercurio, filtros de luz, espejo
dicroico y uso de la persiana para iluminar la muestra.
 OBJETIVO

Fluorocromos: Pueden usarse directamente, aprovechando la propiedad de unirse a

determinadas moléculas u orgánulos. Pero lo más habitual es que estos colorantes se
empleen conjugados a otras moléculas, como anticuerpos, que son capaces de unirse de
modo específico a estructuras concretas de la célula. Algunos colorantes denominados
fluorocromos tienen la propiedad de ser excitados (pasar a un nivel superior de energía)
cuando absorben luz ultravioleta (luz de longitud de onda corta).
Problema: La utilización de fluorocromos pierde grandes intensidades de luz empleadas,
entonces no pueden observadas durante largos periodos de tiempo debido a la
desaparición de la fluorescencia.
Fluorescencia: A medida que las moléculas excitadas regresan a su estado normal liberan
el exceso de energía en forma de luz visible de mayor longitud de onda que la radiación
excitante. Los objetos fluorescentes aparecen brillantemente iluminados contra un fondo
oscuro, según el color del colorante usado.
Epifluorescencia: Hoy día se utiliza mucho un microscopio de fluorescencia en el cual la
luz es emitida desde arriba del preparado. Por lo tanto, el objetivo del microscopio actúa
como lente iluminadora y de imagen.

CONSTITUCION FUNDAMENTAL:

Fuente luminosa (lámpara de mercurio o halógena): Debe emitir la mayor cantidad de luz
ultravioleta en el límite del espectro visible, que atraviesan el material de la preparación de
la misma forma en que lo hace un microscopio óptico común
Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta.
Filtros: Retienen la radiación ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar
solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número de juegos de
filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos:
*El de excitación: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas
de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado
exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.
*El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser
causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico. Corta completamente la
luz de excitación no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisión del
fluorocromo.
*Espejo Dicroico: Permite la separación de la luz de excitación y la fluorescencia.
Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda más corta es reflejada y la
longitud de onda más larga lo atraviesa.
 COMPARACION CON MICROSCOPIO CONVENCIONAL

Este microscopio es similar al microscopio convencional, a excepción de que la luz

incidente que procede de una potente fuente atraviesa un primer filtro que selecciona la
longitud de onda capaz de excitar al fluorocromo.
Otra diferencia radica en que la luz de iluminación (excitación) no está involucrada en la
formación de la imagen. En este sentido la microscopía de fluorescencia difiere de la
microscopía normal en la cual la imagen es formada por la luz de iluminación.

FUNDAMEN TOFISICO

La luz de una fuente de longitud de onda múltiple se mueve a través de un filtro excitador
que solo permite que pase la radiación excitada de la longitud de onda deseada. Esta
radiación es reflejada por el filtro dicromático y enfocada por la lente del objetivo sobre la
muestra, las moléculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por
fluorescencia) de una longitud de onda específica y mayor. Esta luz es enfocada por el
objetivo y la mayor parte pasa a través del filtro dicromático y no se refleja. Un filtro de
barrera final bloquea toda la luz residual con la frecuencia de la radiación de excitación.
Ejemplo:
1. Primer filtro de excitación: selecciona la luz de la longitud de onda incidente. En el
esquema está seleccionando luz de longitud de onda entre 450 y 490 nm (azul)
2. Espejo dicroico: Refleja la luz de ciertas longitudes de onda y de dejar pasar otras. En
este caso refleja luz de longitud de onda menos de 510 nm (por ello refleja la luz incidente
azul) y deja pasar la luz de longitud de onda superior a 510 nm, dejando pasar la luz
verde emitida por el fluorocromo .
3. Segundo filtro de barrera: Es el filtro que selecciona la luz de longitud de onda
fluorescente. En este caso deja pasar la luz de longitud de onda 520 a 560 nm.
Entre otros aspectos o fundamentos, importantes a considerar tenemos:

 El largo de onda de la fluorescencia (emisión) es generalmente más largo que el

largo de onda de la luz excitadora
 Mientras más larga sea la longitud de onda, más baja es la energía de la luz. Por
lo tanto la energía de la fluorescencia es mas baja que la luz absorbida.
 La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho más baja que la de la
luz de excitación
 La fluorescencia se desvanece.
  Cada substancia posee un espectro de fluorescencia característico.

APLICACIONES

1. Autofluorescencia: Detecta la fluorescencia emitida por moleculas de la muestra misma.

2.Fluorescencia inducida: Partes específicas de la muestra pueden ser observadas
selectivamente, mediante métodos de tinción. Ej:substancias específicas como organelos
celulares, proteínas, anticuerpos, DNA, RNA, etc.
3. Sobre objetos bastante más pequeños que la limitación del poder de resolución,
siempre que su emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molécula de DNA, un
virus.

TECNICAS DE TINCION FLUORESCENTE

1.DAPI: tiñe el DNA de color azul brillante. Permite enumerar microorganismos.

Desventaja: No discrimina entre células vivas y muertas.

2. Tinción de Viabilidad: permite discriminar entre células vivas y muertas

Desventaja: solo apropiado para cultivos puros, tintes se pueden pegar a otras
cosas que no son células en muestras ambientales o complejas.

3. Green Fluorescent Protein: Detección y rastreo de organismos introducidos en

ambientes naturales.

4. Autofluorescencia Ej: Vitamina A, clorofila de cianobacterias

5. Fluorescencia inducida

6. Objetos bastante más pequeños que la limitación del poder de resolución de los lentes
ópticos, siempre que su emisión de luz sea lo suficientemente intensa. Ej: molécula de
DNA, virus

FLUORESCENCIA MULTIPLE

Es posible combinar, sobre una misma muestra, dos o más colorantes siempre que
emitan en diferente longitud de onda y nuestro sistema sea capaz de excitar a todos a la
vez y discriminar los fotones emitidos por ellos.
CONCLUSIONES

 El Microscopio es: cualquiera de los distintos tipos de instrumentos que se

utilizan para obtener una imagen aumentada de objetos minúsculos o
detalles muy pequeños de los mismos.

 El microscopio de fluorescencia es muy útil para observar micriopartulos
gracias a las coloraciones de los fluorocromos.
BIBLIOGRAFIA:
 https://ssyf.ua.es/es/formacion/documentos/cursos-
programados/2011/especifica/microscopia-optica/microscopia-optica-y-laser-confocal-2a-
ed/tema-5.pdf
 http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/microscopa-de-fluorescencia.html
 http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia/2017/BioCel/
1504634347.pdf