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Método 1 Adsorción y elución para determinación de subgrupos de A y B

Principio y aplicación Aunque algunos eritrocitos con subgrupos débiles de A o B no aglutinan en las pruebas convencionales para grupo ABO, pueden adsorber y eluir el correspondiente anticuerpo.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Antisuero comercial (anti-A o anti-B)

2.

1-2 mL de GRs a estudiar

3.

GRs reactivos de grupos A 1 , A 2 , B y O

4.

Albúmina sérica bovina (ASB) al 6%

5.

Suero Antiglobulina humana (AGH)

6.

Solución salina

7.

Pipetas

8.

Tubos de ensayo

9.

Centrífuga apropiadamente calibrada

10.

Incubador/baño térmico

11.

Heladera/baño de hielo

Procedimiento

1.

Lavar los GRs a estudiar 3 veces con salina.

2.

Concentrar los GRs a estudiar por centrifugación a 1000 g durante 10 minutos y remover todo el sobrenadante.

3.

Diluir el antisuero comercial (anti-A o anti-B) al 1:2 con salina.

4.

En un tubo, mezclar volúmenes iguales de GRs a estudiar con el anti-suero diluido.

5.

Incubar a temperatura ambiente ó a 4 °C por 30 minutos.

6.

Concentrar los GRs en estudio y descartar el antisuero. Lavar los GRs 4-6 veces con salina.

7.

Trasladar a un nuevo tubo y lavar 3 veces más con salina. Guardar el último lavado.

8.

Concentrar los GRs en estudio.

9.

Agregarles un volumen igual de ASB al 6% a los GRs lavados y compactados.

10.

Mezclar bien e incubar a 56 °C durante 10 minutos agitando frecuentemente.

11.

Centrifugar durante 5 minutos. Recoger el sobrenadante teñido de hemoglobina (eluato).

12.

Estudiar el eluato y el sobrenadante del último lavado con 3 testigos conocidos, como mínimo, de GRs del correspondiente grupo ABO (A 1 , A 2 , y/o B) y con GRs de grupo O para control. Estudiar a temperatura ambiente, a 37 °C y finalizar en prueba antiglobulínica (PAG).

Interpretación Negativo: Si las células no tienen suficientes antígenos A, B o ambos, el eluato no reaccionará con las células A y/o B. Positivo: Si las células estudiadas tienen suficiente expresión antigénica de A, de B o de ambos, el eluato puede reaccionar con las células testigo A y/o B. Inválido: cuando las células de grupo O reaccionan con el eluato.

Notas

1. Si el sobrenadante del último lavado reacciona con los GRs en estudio en el paso 12, se invalidan los resultados de la prueba. El procedimiento de adsorción y elución se debe repetir con lavados adicionales.

2. Algunos subgrupos muy débiles sólo pueden ser detectados a través de la adsorción con anti-A, B.

Referencias

1. Landsteiner K, Miller CP. Serological studies on the blood of primates. II. The blood groups in

anthropoid apes. J Exp Med 1925;42:853.

2. Schwedfeger D, Heal J. A novel weak subgroup of A (abstract) Transfusion 1989;29:14S.

Método 2 Aglutinación secuencial

Principio En algunas reacciones de aglutinación en campo mixto, los GRs aglutinados pueden ser removidos y los GRs no aglutinados pueden ser tratados con antisueros específicos para producir la aglutinación. El proceso se repite hasta que la mayoría de los GRs hubieren sido aglutinados.

Aplicación La aglutinación secuencial es usada para determinar si los GRs en una reacción de campo mixto tienen una simple o doble especificidad. La técnica es usada mayormente para definir GRs A 3 , A bantu , o A mos .

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Antisuero comercial anti-A.

2.

GRs testigo de grupo A 1 , suspendidos al 5% en salina.

3.

GRs a estudiar

4.

Solución salina

5.

Pipetas

6.

Tubos de ensayo

7.

Centrífuga apropiadamente calibrada

8.

Portaojetos

9.

Cubreobjetos (opcional)

10.

Microscopio

Procedimiento

1. Preparar una suspensión al 5% en solución salina de los GRs a estudiar.

2. En un tubo agregar 10 gotas de los GRs en estudio a 10 gotas de anti-A. Mezclar y centrifugar a 1000 g durante 15 segundos. Dispersar el botón de GRs y centrifugar nuevamente a la misma velocidad y por el mismo tiempo.

3. Dispersar el botón nuevamente en forma delicada, llenar el tubo con salina, inclinando el tubo a 45º durante 30 segundos, luego colocarlo derecho durante otros 30 segundos. Los GRs aglutinados, más pesados, caerán hacia el fondo más rápidamente que los GRs no aglutinados.

4. Aspirar los GRs no aglutinados. Colocar estos GRs en un tubo limpio. Centrifugar durante 1 minuto. Decantar completamente la solución salina.

5. Agregar 8-10 gotas del antisuero al botón de GRs y repetir los pasos 1-3.

6. Repetir el proceso completo hasta que todos los GRs hayan sido aglutinados o hasta que la aglutinación no ocurra más y queden los GRs remanentes. Lavar 3 veces los GRs y hacer una suspensión al 2-3 %.

7. Agregar a una gota de la suspensión de GRs no aglutinados 1 gota de GRs detectores de grupo A 1 . Incubar 5 minutos a temperatura ambiente agitando frecuentemente.

8. Centrifugar 15 segundos, resuspender suavemente, y entonces repetir una vez más.

9. Observar microscópicamente en busca de rosetas. Si aún hay GRs libres visibles, considerar la posibilidad de una doble o múltiple población de GRs.

Interpretación Si aún hay GRs libres, entonces debe considerarse una población de GRs doble o múltiple. Si no se observan GRs libres, entonces los GRs expresan el mismo antígeno en grado variable, tal como puede ser visto en algunos subgrupos débiles de A o B.

Referencias

1. Beattie KM. Identifying the causes of weak or “missing” antigens in ABO grouping tests. In:

Investigation of typing and compatibility problems caused by the red cell. Washington, DC:

AABB Workshop, 1977.

Método 3 Investigación del carácter secretor ABH

Principio y aplicación Los antígenos ABH son secretados en forma hidrosoluble por alrededor del 80% de los individuos. Estos antígenos solubles ABH pueden neutralizar las reacciones con el antisuero específico de los GRs que poseen los variados antígenos ABH. Se pueden usar las pruebas basadas en este hecho para determinar el estado secretor. En la mayoría de los casos, los secretores de grupo O secretan sustancia H, los de grupo A secretan A y H, los de grupo B secretan B y H, y los secretores de grupo AB secretan A, B y H.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Saliva.

2. Albúmina sérica bovina (ASB) al 6%.

3. Anti-A y/o anti-B de donantes no hiperinmunizados (ver Nota 1)

4. Lectina anti-H de Ulex europaeus (disponible comercialmente de E-Y Laboratories, o preparada de semillas obtenidas de compañías de semillas) (ver Nota 2 y M98, M99)

5. GRs testigos de grupo A 2 , B y O (ver Nota 3)

6. Solución salina

7. Pipetas

8. Tubos de ensayo

9. Centrífuga debidamente calibrada

Preparación de reactivos

1. Seleccionar la mejor dilución de anti-A, anti-B, y/o anti-H para realizar una doble dilución en ASB

al 6% (ver M123). Estudiar las diluciones con los GRs adecuados. La dilución siguiente al último tubo que con una reacción de 2+ es la dilución del antisuero a ser usada para la prueba. Es de buena práctica reservar alícuotas de los anticuerpos estandarizados ya probados en el freezer ya que ellos pueden ser diluidos cuando sean necesarios para estudios de neutralización.

Procedimiento

1.

Recolectar 2-3 mL de saliva (ver Nota 4). Hervir la saliva 10 minutos para destruir la actividad enzimática. Centrifugar la saliva a 1000 g durante 10 minutos. Remover el sobrenadante (ver Nota

5).

2.

Diluir la saliva 1:2 o 1:4 en salina (ver Nota 6).

3.

Lavar los GRs 3 veces con salina y resuspender al 3%.

4.

Diluir en ASB al 6% el antisuero previamente estandarizado para obtener una reacción de 2+ con los GRs testigos.

5.

Rotular 3 tubos para cada antisuero: “prueba de neutralización”, “dilución de control” y “control negativo”.

6.

Agregar 2 gotas del antisuero diluido a los tubos apropiados.

7.

Agregar 2 gotas de la saliva diluida a estudiar a los tubos. Mezclar y centrifugar por 1 minuto.

8.

Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

9.

Agregar 1 gota de GRs testigos a los tubos “prueba” y “control”.

10.

Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

11.

Centrifugar por 15 segundos. Leer macroscópicamente.

Controles

1. Control del reactivo: 2 gotas de salina en lugar de saliva. Estudiar en paralelo con la saliva. Estos

controles deben ser positivos con los GRs testigos.

2. Estudiar la saliva de un secretor y una de un no secretor conocidos en paralelo con saliva a prueba.

Interpretación Ver Tabla 3-1.

1. Secretor- la ausencia de aglutinación indica que en la saliva hay sustancias grupo específicas.

2. No secretor- la aglutinación indica que en saliva no hay sustancias grupo específicas.

Tabla 3-1.: Interpretación de la Investigación del Carácter Secretor

Prueba en saliva

Control: saliva de

Control: saliva de

Control

Dilución

Interpretación

un

secretor

un

No

secretor

salina

conocido

conocido GRs Testigos de Grupo 0 y Anti-H

 

Negativo

negativo

2+

2+

Secretor H

2+

negativo

2+

2+

No Secretor H

 

GRs Testigos de Grupo A 2 y Anti-A

 

Negativo

negativo

2+

2+

Secretor A

2+

negativo

2+

2+

No Secretor A

 

GRs Testigos de Grupo B y Anti-B

 

Negativo

negativo

2+

2+

Secretor B

2+

negativo

2+

2+

No Secretor B

Notas

1.

Es preferible utilizar sueros anti-A o anti-B de donantes no hiperinmunizados a los sueros comerciales porque estos contienen más anticuerpos IgG, lo que dificulta la neutralización.

2.

Excepto en casos de subgrupos débiles de A o B, la investigación sólo de sustancia H es usualmente suficiente para determinar si la persona es secretora de ABH.

3.

Para la neutralización de los GRs A 2 , son más sensibles los GRs A 1 ,. Se usan GRs de grupo O para determinar la neutralización del anti-H.

4.

Para acelerar la producción de saliva se aconseja masticar parafina. Advertencia: masticar goma de mascar u otros elementos que con sustancias proteicas o azucaradas pueden neutralizar el antisuero.

5.

La saliva hervida puede conservarse congelada en alícuotas.

6.

La saliva no diluida contiene glicoproteínas no específicas, las que pueden neutralizar el antisuero y conducir a interpretaciones erróneas acerca del estado secretor.

Referencias

1. Beattie KM. Identifying the causes of weak or “missing” antigens in ABO grouping tests. In:

Investigation of typing and compatibility problems caused by the red cell. Arlington, VA: AABB,

1977.

2. Race RR, Sanger R. Blood groups in man. 6 th ed. Oxford: Blackwell, 1975.

3. Widmann FK, ed. Technical manual. 8 th ed. Arlington, VA: AABB, 1981.

4. Mollison PL. Blood transfusion in clinical medicine. 7 th ed. Oxford: Blackwell, 1983.

Método 4 Detección de transferasas de los genes de A y B

Principio y aplicación Los genes del grupo A y B en las personas con fenotipos A o B, producen respectivamente N-D- galactosaminil o α-D-galactosil-transferasas, en sus GRs y en el plasma. Estas transferasas son capaces de transformar los GRs de grupo O en GRs de grupo A o B activos. La detección de las transferasas puede ayudar en la resolución de discrepancias ABO.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Sustratos de nucleótidos de azúcares, para las transferasas A, difosfato de uridin-N-acetil-D- galactosamina (UDP-GalNac), Sigma Chemical Co., número de catálogo U5252; para transferasas B, difosfato de uridin galactosa (UDP-Gal), Sigma Chemical Co., número de catálogo U4500.

2.

Cloruro de manganeso (MnCl 2 )

3.

GRs de grupo O

4.

Suero a estudiar

5.

Suero de grupo A o B y de grupo O como controles positivos y negativos

6.

Anti-A o anti-B comerciales

7.

Solución salina

8.

Pipetas

9.

Tubos de ensayo

10.

Centrífuga apropiadamente calibrada

11.

Incubador/baño térmico

12.

Salina normal o tamponada con fosfato (PBS)

13.

Varillas

Procedimiento

1. Lavar los GRs O 3 veces con salina y resuspender al 50%.

2. Agregar a 0.5 mL del suero a estudiar, 0.05 mL de la suspensión al 50% de GRs O, la cantidad de sustratos de azúcares nucleótidos (UDP-GalNac o UDP-Gal) que quede adherida a la varilla al remojarla, y la cantidad de MnCl 2 que se adhiera al remojar la varilla. Remojar la punta de la varilla con salina normal o PBS (ver Nota 1).

3. Tratar el suero de control de grupo A o B y de grupo O de la misma forma.

4. Incubar la prueba y los controles 3.5 horas a 37 °C.

5. Preparar diluciones dobles, desde 1:2 hasta 1:32, del anti-A o anti-B comercial.

6. Lavar los GRs 3 veces con solución salina después de la incubación.

8.

Incubar con las diluciones del suero anti-A o anti-B apropiado a temperatura ambiente por 20 minutos.

9. Centrifugar a 1000g durante 30 segundos y leer macroscópicamente.

Interpretación

1. En presencia de UDP-galactosa y MnCl 2 , los GRs de grupo O adquieren antígenos de especificidad B durante la incubación con el suero de individuos de grupo B o AB.

2. En presencia de UDP-GalNac y MnCl 2 , los GRs de grupo O adquieren antígenos de especificidad

A durante la incubación con el suero de individuos de grupo A o AB.

Notas

1. Advertencia: El exceso de MnCl 2 no se disolverá en el medio de prueba y puede causar dificultades en la lectura de las reacciones.

Referencias

1. Valko DA, Rolih SD, Moulds JJ, Bridges MA. A simple method for detection of the B-gene specified transferase enzyme. St. Charles, IL: American Red Cross Reference Laboratory Workshop, March 1982.

2. Schenkel-Brunner H, Tuppy H. Enzymatic conversion of human O into A erythocytes and of B into AB erythrocytes. Nature (London) 1969;223:1272.

Método 5 Recuento de Ashby (Método manual modificado)

Principio En una muestra de sangre que contiene una mezcla de dos o más grupos sanguíneos, una población de GRs es aglutinada y la otra población de GRs que queda libre, no aglutinados, es contada por un equipo automatizado. Restando el número de GRs libres del recuento total, se obtiene el número de GRs aglutinados.

Aplicación La aglutinación diferencial puede usarse para determinar la sobrevida de GRs transfundidos o para investigar quimerismo de grupos sanguíneos.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Antisuero aglutinante potente o lectina, ABO o reactivos tipificadores M y N (ver Nota 1)

2. Suero de grupo AB

3. Solución salina

4. Tubos de ensayo

5. Contador automático de células (Couter Isoton)

6. Pipetas (Pasteur y una pipeta automática con punta de 100 ul)

7. Centrífuga apropiadamente calibrada

8. Microscopio

9. Sangre entera a estudiar

Procedimiento

1.

Dispensar 0.1 mL de la sangre entera a estudiar en 5 mL de salina para preparar una suspensión globular al 1:51.

2.

Preparación de un recuento de aglutinación diferencial: Agregar 1 volumen (se sugiere 0.2 mL) de

la

suspensión de GRs al 1:51 a un volumen de suero aglutinante de alto título en un tubo y mezclar

bien. La dilución es ahora de 1:102. Preparar en duplicado.

3.

Preparación del recuento total: Agregar 0.1 mL de la suspensión de GRs al 1:51 a 0.1 mL de suero AB y mezclar bien.

4.

El

recuento total puede hacerse inmediatamente, pero los tubos que contienen el suero aglutinante

deben permanecer durante 15-30 minutos a temperatura ambiente.

5.

Centrifugar los tubos que contienen el suero aglutinante a 1000 g durante 30 segundos, golpear ligeramente los tubos contra la mesada para romper la aglutinación, centrifugar nuevamente durante 15 segundos, golpear el tubo enérgicamente, y permitir que los aglutinatos decanten durante 20 segundos.

6.

Usando una pipeta fina, remover una pequeña cantidad del sobrenadante y usarlo para cargar las placas de las cámaras de recuento. Realizar dos recuentos por cada tubo.

7. Para el recuento total, contar 5 cuadros de la cámara como en un recuento de GRs de rutina. En el recuento de aglutinación diferencial, puede haber tan pocos GRs no aglutinados que deben contarse grandes áreas (25 cuadros) para asegurar la precisión.

Cálculos

1.

10

x 5 (si se cuentan 5 cuadros) x 102 (dilución) x el número de GRs promedio contados en el

recuento duplicado de los tubos por duplicado.

 

o

 

10

x 1 (cuando se cuentan los 25 cuadros) x 102(dilución) x el número de GRs promedio contados

en el recuento duplicado de los tubos por duplicado.

2.

Recuento total recuento de aglutinación diferencial = recuento de aglutinatos.

3.

Recuento de aglutinatos x 100 = % de GRs aglutinatos Recuento total

Interpretación En el caso de una quimera A-O en la cual el recuento diferencial fue realizado con anti-A y se halló un promedio de 459 mientras que el promedio del recuento total fue de 510, la diferencia de 51 entre los dos valores representará los GRs aglutinados. En este ejemplo los cálculos serán:

(10 x 5 x 102 x 510) (10 x 5 x 102 x 459) = 51

51

x 100 = 10% de los GRs totales son de grupo A

510

Aunque existen métodos más sofisticados, puede medirse la sobrevida de los GRs de forma simple luego de la transfusión de GRs seleccionados por poseer un antígeno que estaba ausente en la sangre del receptor. Por ejemplo, puede escogerse sangre M positiva para un paciente M negativo. El recuento de sangre tomada 10 minutos después de la transfusión, a la hora y a las 24 horas puede ser indicativo. Los cálculos se deben hacer en la misma forma que en el ejemplo anterior. El recuento de células aglutinadas (GRs M positivos con anti-M) representará los GRs transfundidos sobrevivientes.

Notas

1. Si el antisuero o la lectina no producen una aglutinación completa de todos los GRs antígeno positivos o no se unen lo suficiente en forma firme como para resistir una agitación enérgica, no se obtendrán resultados precisos.

2. Se pueden obtener recuentos en blanco de menos de 20.000 por mm 3 con el antisuero aglutinante. Por ejemplo, el recuento de GRs libres después de la aglutinación de GRs de grupo A 1 o A 2 conocidos con anti-A brindará información sobre la efectividad del antisuero en producir una aglutinación completa.

3. El coeficiente de variación esperado en este método es del 5%, el mismo que se encuentra con el método de recuento de GRs manual.

Referencias

1. Ashby W. The determination of the length of life of transfused blood corpuscles in man. J Exp Med 1919;29:267.

2. Mollison PL. Blood transfusion in clinical medicine. 3 rd ed. Oxford: Blackwell, 1961.

Método 6 Recuento de Ashby (Método automático modificado)

Principio En sangre que contiene una mezcla de dos o más grupos sanguíneos, una población de GRs es aglutinada y la otra población de GRs libres, no aglutinados es contada por un aparato de recuento automático (Coulter Counter). Restando el número de GRs libres del recuento total, se obtiene el número de GRs aglutinados.

Aplicación La aglutinación diferencial puede usarse para determinar la sobrevida de GRs transfundidos o para investigar el quimerismo de grupos sanguíneos.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Antisuero aglutinante potente o lectina, ABO o reactivos tipificadores M y N (ver Nota 1)

2. Coulter Isoton

3. Pipetas (Pasteur y una pipeta automática con punta de 100uL)

4. Tubos de ensayo (16 x 100 mm)

5. Coulter Counter

6. Frascos de Coulter Counter

7. Sangre entera a estudiar

8. Centrífuga adecuadamente calibrada

Procedimiento

1. Diluir 0.01 mL de sangre entera en 10 mL de Isoton para obtener una dilución de 1:500 de GRs.

2. Hacer en duplicado.

a. Prueba: Usando una pipeta automática, colocar en un tubo de 16 x 100 mm 0.1 mL de antisuero (o lectina) y 0.1 mL de GRs diluidos (dilución 1:500) .

b. Control: Usando una pipeta automática colocar en un tubo 0.1 mL de Isoton y 0.1 mL de GRs diluidos.

c. Mezclar y dejar los tubos 15 minutos a temperatura ambiente.

3. Centrifugar todos los tubos a 1000 g durante 15 segundos, resuspender el botón y centrifugar nuevamente durante 15 segundos. Agitar el botón de GRs “control” para remover todos los GRs del fondo. Resuspender el botón de GRs “control” lo suficientemente fuerte como para asegurarse

que los aglutinatos permanezcan siempre luego de posteriores diluciones y que sedimentarán

rápidamente.

4. Agregar 10 mL de Isoton al “control” y a la “prueba”. Mezclar con cuidado por inversión. No sacudir.

5. Dispensar el tercio superior de cada tubo “control” en frascos de Coulter Counter y contar en el Coulter Counter de la misma forma que se cuentan los GRs de rutina.

6. Dejar los tubos “control” aproximadamente 15 minutos. Acortar o alargar el tiempo de acuerdo a cómo aparezcan de limpio de aglutinatos en el sobrenadante.

7. Pipetear el tercio superior (ver Nota 2) de cada tubo “prueba” en frascos de Coulter Counter y contar en el Coulter Counter de la misma forma que se cuentan los GRs de rutina.

Cálculos

Recuento de la prueba = % de GRs no aglutinados Recuento del control

Notas

1. Si el antisuero o la lectina no producen una aglutinación completa de todos los GRs antígeno positivos o no se unen lo suficiente en forma firme como para resistir una agitación enérgica, no se obtendrán resultados precisos.

2. Puede ser necesario pipetear un volumen ligeramente mayor (posiblemente después de un ligero aumento en el tiempo de decantación de los aglutinatos) para permitir que la sonda del Coulter aspire en una muestra adecuada. Alternativamente, la prueba puede prepararse en cuadruplicado y la capa superior de dos tubos se pueden mezclar para el recuento.

Referencias

1. Ashby W. The determination of the length of life of transfused blood corpuscles in man. J Exp Med 1919;29:267.

2. Bowdler AJ, Swisher SN. Electronic particle counting applied to the cuantitative study of RBC agglutination. Transfusion 1964;4:153-68.

Método 7 Técnica de rosetas para detectar una población menor de GRs utilizando un antisuero salino

Principio Es posible detectar poblaciones menores, tales como GRs de grupo A o B, recubriendo GRs con anticuerpos reactivos salinos, tales como anti-A o anti-B; luego retirando el anticuerpo libre a través de lavados, y finalmente agregando GRs testigos, los cuales formarán rosetas con la población menor de GRs recubiertos por anticuerpos.

Aplicación Esta técnica puede ser utilizada para detectar una población menor de GRs que representen menos del 1% del total.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Antisuero, e.j., anti-A o anti-B

2. Suspensiones al 5% de GRs de grupo A y B

3. Solución salina

4. Pipetas

5. Tubos de ensayo

6. Portaobjetos de vidrio y cubreobjetos

7. Microscopio

8. Centrífuga adecuadamente calibrada

9. Suspensión al 2-3% de GRs testigo

Preparación de reactivos

1. GRs control positivo: Agregar 1 gota de suspensión en salina al 3% de GRs de grupo A (o de

grupo B si lo requiere el caso) a 8 mL. de una suspensión al 3% de GRs de grupo O.

2. GRs control negativo: Suspensión salina al 3% de GRs de grupo O.

Procedimiento

1. Colocar 1 gota del suero tipificador específico para la población menor sospechada en un tubo de ensayo y agregar 1 gota de la suspensión al 2-3% de los GRs a estudiar. Mezclar bien.

2. Rotular 2 tubos más y agregar a cada uno 1 gota del suero tipificador específico para la población menor sospechada. Al tubo rotulado “control positivo”, agregar 1 gota de GRs de control positivo y mezclar. Al tubo de ensayo rotulado “control negativo”, agregar 1 gota de GRs de control negativo y mezclar.

3. Incubar los tubos problema y control durante 15 minutos a temperatura ambiente.

4. Lavar los GRs 3 veces con salina.

5. Agregar 1 gota de suspensión al 5% de GRs detectores A o B, específicos para el suero tipificador. Mezclar bien.

6. Dejar los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente. Agitar frecuentemente.

7. Centrifugar 15 segundos a 1000 g , resuspender suavemente, y repetir la centrifugación y la resuspensión.

8. Colocar una alícuota de la suspensión en un portaobjetos, cubrir con el cubreobjetos, y examinar microscópicamente. Las rosetas en medio de GRs no aglutinados indican la presencia de una población menor de GRs.

Interpretación En una mezcla de GRs, la aglutinación directa de la población menor con suero tipificador puede no ocurrir porque las células están tan extensamente distribuidas entre la población mayor de GRs que la aglutinación puede no llevarse a cabo. No obstante, estos GRs están cubiertos por el anticuerpo. Cuando se agrega un gran cantidad de células detectoras, ellas son atraídas por el anticuerpo fijado en la población menor de GRs y se forman las rosetas.

Si el control positivo no muestra rosetas, los resultados deben ser invalidados porque:

Hay muy pocos GRs de la población menor en la mezcla o,

El antisuero no es específico para el antígeno de los GRs de la población menor o, alternativamente, de los GRs detectores. Si el control negativo muestra rosetas, esto puede ser:

Coágulos simulando rosetas, o

Contaminación de los GRs.

Notas

1. Es importante usar una suspensión al 5% de los GRs detectores porque debe haber bastantes GRs para buscar y unirse al anticuerpo que está unido a los GRs de la población menor.

Referencias

1. Jones AR, Silver S. The detection of minor erythrocyte population by mixes agglutinates. Blood

1958;13:763-72.

Método 8 Técnica de roseta para la detección de una población menor de GRs utilizando un anticuerpo IgG

Principio Pueden detectarse poblaciones menores de GRs recubriéndolos con un anticuerpo IgG, lavando el anticuerpo libre, y luego agregando suero antiglobulina y GRs cubiertos con IgG (Control Coombs). Los GRs del Control Coombs formarán rosetas alrededor de los GRs cubiertos por IgG de la población menor.

Aplicación Esta técnica puede ser utilizada para detectar una población menor de GRs que representen menos del 1% del total.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Anticuerpo IgG, e.j., anti-D

2.

Suero Antiglobulina humana (SAGH)

3.

GRs recubiertos por anticuerpo IgG (Control Coombs)

4.

Solución salina

5.

Pipetas

6.

Tubos de ensayo

7.

Portaobjetos de vidrio y cubreobjetos

8.

Microscopio

9.

Centrífuga adecuadamente calibrada

10.

Incubador / Baño

11.

GRs control de grupo O Rh positivo y Rh negativo

Preparación de reactivos

1. GRs control positivo: Agregar 1 gota de suspensión al 3% de GRs Rh positivo a 8 mL de una suspensión en salina al 3% de GRs Rh negativo.

2. GRs control negativo: Suspensión salina al 3% de GRs Rh negativo (ver Nota 1).

Procedimiento

1. En un tubo de ensayo, colocar 1 gota del suero tipificador IgG específico para la población menor sospechada y agregar 1 gota de la suspensión al 2-3% de los GRs a estudiar. Mezclar bien.

2. Rotular 2 tubos más y agregar en cada uno 1 gota del suero tipificador anti-D (ver Nota 1). Al tubo rotulado “control positivo”, agregar 1 gota de GRs de control positivo y mezclar. Al tubo de ensayo rotulado “control negativo”, agregar 1 gota de GRs de control negativo y mezclar.

3. Incubar la prueba y los tubos control durante 15 minutos a 37°C.

4. Lavar los GRs 3 veces con salina. Descartar la salina completamente después del último lavado.

5. Agregar 1 gota de SAGH. Mezclar bien y dejar estar 5 minutos. Agitar frecuentemente.

6. Lavar los GRs 3 veces con salina. Descartar la salina completamente después del último lavado.

7. Agregar 1 gota de GRs recubiertos con anticuerpo IgG y mezclar bien.

8. Centrifugar 15 a 1000g , resuspender suavemente, y repetir la centrifugación y la resuspensión.

9. Colocar una alícuota de la suspensión en un portaobjetos, cubrir con el cubreobjetos, y examinar microscópicamente. Las rosetas en medio de GRs no aglutinados indican la presencia de una población menor de GRs.

Interpretación Si se observan rosetas en la prueba y el control positivo pero no se encuentran en el control negativo, está presente una población menor de GRs antígeno positivos. Si el control positivo no muestra rosetas, los resultados deben ser invalidados porque:

Hay demasiado pocos GRs de la población menor en la mezcla o,

El antisuero no es específico para el antígeno de los GRs de la población menor o, alternativamente, de los GRs detectores.

Notas

1. Aunque esta guía habla del uso de anti-D y de GRs Rh positivo y Rh negativo, si es necesario se pueden usar otros antisueros IgG y los GRs de control apropiados.

2. Jones y Silver afirman que puede ser detectada usando esta técnica, una población menor de GRs que representen tan poco como 1:100.000.

Referencias

1. Jones AR, Silver S. The detection of minor erythrocyte population by mixes agglutinates. Blood

1958;13:763-72.

Método 9 Investigación semicuantitativa de la inhibición de la hemaglutinación

Principio En un fluido como saliva y por titulación puede determinarse la cantidad de sustancia de grupo sanguíneo. Se titulan diluciones dobles del fluido contra una cantidad fija del antisuero que la sustancia es capaz de inhibir.

Aplicación La prueba es utilizada para determinar semicuatitativamente la cantidad de antígeno secretado.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Saliva.

2. Albúmina sérica bovina (ASB) al 6%.

3. Anti-A o anti-B

4. GRs testigo suspensión al 3% de GRs de grupo A 2 o B

5. Solución salina

6. Pipetas

7. Tubos de ensayo

8. Centrífuga apropiadamente calibrada

Procedimiento

1. Recolectar 2-3 mL de saliva (ver Nota 1). Hervir la saliva 10 minutos para destruir la actividad enzimática. Centrifugar la saliva a 1000g durante 10 minutos. Remover el sobrenadante (ver Nota

2).

2. Preparar diluciones dobles estándar de la saliva en ASB al 6% (0.1 mL de saliva en 0.1 mL de diluyente, hacer diluciones hasta 1:512 para cada antisuero que va a ser estudiado).

3. Preparar diluciones dobles estándar de anti-A o anti-B (ver Nota 3) hasta 1:512 (ver M123). Enfrenta cada dilución con los GRs apropiados. Se debe seleccionar el tubo siguiente al último que muestra una reacción de 2+ para usar en la prueba de inhibición. Agregar 2 gotas (0.1 mL) del antisuero diluido a cada tubo con saliva. Mezclar y centrifugar durante 1 minuto.

4. Incubar los tubos de ensayo a temperatura ambiente durante 10 minutos.

5. Agregar 1 gota (0.05 mL) de los GRs testigos apropiados en cada tubo.

6. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

7. Centrifugar los tubos durante 15 segundos. Leer macroscópicamente.

Controles

1. Preparar un control positivo usando 2 gotas (0.1 mL) de diluyente y 2 gotas (0.1 mL) del antisuero

apropiado.

2. Estudiar la saliva de un secretor y de un no secretor conocidos. Ver en la Tabla 9-1 un ejemplo de resultados.

Tabla 9-1: Estudio de Secreto y No Secretor

Dilución

No Secretor

Secretor

1:2

1+

0

4

2+

0

8

2+

0

16

2+

0

32

2+

0

64

2+

0

128

2+

1+

256

2+

2+

512

2+

2+

Interpretación A mayor cantidad de sustancia de grupo sanguíneo presente en la saliva, se necesitan diluciones más altas para eliminar su actividad inhibitoria

Notas

1. Si se mastica parafina puede acelerarse la producción de saliva. Advertencia: masticar chicle u otras sustancias proteicas o azucaradas pueden inhibir el antisuero.

2. La saliva hervida puede conservarse congelada en alícuotas.

3. Es preferible el anti-A o anti-B de donantes no hiperinmunizados al antisuero comercial porque éste contiene más anticuerpo Ig, lo cual dificulta la inhibición.

Referencias

1. Beattie KM. Discrepancies in ABO blood grouping. In: Walker, RH, ed. A seminar on problems encoutered in pretransfusion test. Washington, DC:AABB, 1972:159.

Método 10 Tipificación ABO de GRs tratados con enzimas

Principio El tratamiento enzimático remueve los residuos de ácido ciálico de los GRs, lo cual potencia la aglutinabilidad de los GRs con anti-A o anti-B y destruye los receptores para Tn.

Aplicación Puede evaluarse la causa de campos mixtos y reacciones débiles en la tipificación ABO repitiendo las pruebas con GRs tratados con enzimas.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Ficina o papaína al 1% (ver M42).

2. Anti-A o anti-B

3. GRs a estudiar, en suspensión salina al 5%

4. Controles, suspensión al 5% de GRs reactivos de grupo A, B y O

5. Tubos de ensayo

6. Solución salina

7. Incubador / baño térmico

8. Centrífuga apropiadamente calibrada

Preparación de los reactivos

1. Lavar los GRs a estudiar 2-3 veces con salina, luego preparar una suspensión al 5% en salina.

2. Preparar una batería de GRs no tratados y una de GRs tratados con enzimas (ver M42).

Procedimiento

1. Rotular una cantidad suficiente de tubos de ensayo para los GRs tratados y no tratados.

2. A 1 gota de cada muestra de GRs, agregar 1 gota del antisuero apropiado (anti-A anti-B).

3. Mezclar e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

4. Centrifugar a 1000 durante 15 segundos.

5. Leer, graduar y registrar los resultados.

Interpretación

1. Si la aglutinación de los GRs tratados con enzimas no se potencia o sólo lo hace ligeramente, pero

persiste la aglutinación en campo mixto, pueden estar presentes dos poblaciones eritrocitarias de diferentes especificidades. Las dobles poblaciones resultan más a menudo por transfusiones no isogrupo y menos comúnmente por un trasplante de médula ósea reciente. Otras causas raras de

mosaicismo son el resultado de dispermia o el intercambio intraútero de los GRs primigenios en hermanos gemelos.

2. Si la aglutinación con los GRs tratados con enzimas es potenciada y se elimina la aglutinación en campo mixto en las pruebas con anti-A, esto es indicativo del grupo A 3 .

3. Si la aglutinación con los GRs tratados con enzimas desaparece, debe considerarse una activación Tn. Ver Capítulo VII, Poliaglutinación.

Referencias

1. Beattie KM. Personal communication, 1992.

Método 11 Determinación de anti-A o anti-B por de inhibición de la hemaglutinación usando sustancias grupo específicas (SGE)

Principio Las sustancias solubles grupo específicas A y B (SGEA/SGEB) inhiben fácilmente a las IgM anti-A y anti-B. La variedad IgG de estos anticuerpos también puede ser inhibida, pero requiere de cantidades mucho mayores de SGE.

Aplicación Puede identificarse el anti-A o el anti-B en suero o en eluatos por inhibición de la hemaglutinación usando SGE.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Neutr-AB®, catálogo número B4830, Dade Division, Baxter Diagnostic, Inc. (ver Nota 1)

2. GRs de grupo A 2 o B (los que se requieran)

3. Tubos de ensayo

4. Solución salina

5. Pipetas

6. Centrífuga apropiadamente calibrada

7. Suero o eluato a estudiar

Procedimiento

1. Agregar 2 gotas del suero o eluato a estudiar en cada uno de 2 tubos de ensayo apropiadamente rotulados.

2. Agregar 1 gota de Neutr-AB o SGEA/B de la saliva de un secretor a 1 tubo de ensayo y 1 gota de solución salina al otro tubo como control de la dilución. Mezclar (ver Nota 2).

3. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

4. Centrifugar a 1000 g durante 30 segundos.

5. Leer y registrar los resultados.

Interpretación

1. Si se observa aglutinación en el tubo que contiene el suero o eluato y la solución salina pero no en

el tubo que contiene la SGEA/B, la inhibición de esta última reacción indica que en el suero estudiado estaba presente el anti-A (o anti-B, según sea el caso).

2. Si no se observa aglutinación en ningún tubo, es improbable que el anticuerpo esté presente. Por otro lado, la dilución puede hacer que al anticuerpo sea demasiado débil para dar una reacción observable. En este caso, puede resolver el problema se se duplica la cantidad de suero a estudiar mientras se mantiene la cantidad de SGEA/B en 1 gota, Alternativamente, el suero a estudiar puede ser concentrado (ver M35).

Notas

1. Alternativamente, la SGEA o SGEB puede ser preparada de saliva humana de un

secretor (ver M3).

2. Si se usa saliva como fuente de SGE, centrifugar el tubo de ensayo antes de agregar la

saliva para permitir que la saliva viscosa se mezcle con el suero o eluato a prueba.

Referencias

Método 12 Investigación de GRs sospechosos de ser B adquirido con anti-B acidificado

Principio y aplicaciones Los GRs que tienen los antígenos B adquiridos reaccionarán con el anti-B común o el comercial, pero no

lo harán cuando estos antisueros son acidificados a un pH inferior a 6. Esta prueba es útil para diferenciar

los antígenos B adquirido de los B heredado.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Anti-B comercial

2.

GRs de grupo B, en suspensión salina al 3%

3.

GRs que se sospechan ser B adquirido, en suspensión salina al 3%

4.

HCl 0.1 N

5.

Solución salina

6.

Papel para medir pH

7.

Pipetas

8.

Tubos de ensayo

6.

Centrífuga apropiadamente calibrada

Procedimiento

1. Agregar 1 gota de HCl 0.1 N a 4 gotas de anti-B comercial.

2. Medir el pH. Ajustar el pH a 4.5 agregando HCl 0.1 N o anti-B según se requiera.

3. Control: diluir una segunda alícuota de anti-B con igual cantidad de salina.

4. Agregar 1 gota de GRs sospechados de ser B adquirido a un tubo de ensayo rotulado “ácido” y 1 gota a un tubo rotulado “control”. Agregar 1 gota de células de grupo B a un tubo rotulado “ácido”

y 1 gota a un tubo rotulado “control”.

5. Agregar 1 gota del anti-B acidificado en cada tubo “ácido”. Agregar 1 gota de anti-B control en cada tubo “control”.

6. Centrifugar durante 15 segundos, resuspender suavemente, leer y registrar la aglutinación.

Interpretación La Tabla 12-1 muestra los resultados esperados si los GRs de grupo A han adquirido el antígeno B.

 

Tabla 12-1 GRs Grupo A con antígeno B adquirdo

Glóbulos rojos

Anti-B acidificado

Control Anti-B

B

Adquirido

O

+ (habitualmente + w o 1+

Grupo B conocido

4+

4+

Referencias

 

1. Gerbal A, Masler C, Salmon CH. Immunologic aspects of the adquired-B antigen. Vox Sang

1975;28:398.

2. Gerbal A, Ropars C. The adquired-B antigen. Rev Fr Transfus and Immunohematol 1976;19:127.

3. Judd WJ. Microbiao-associated forms of polyagglutination (T, Tk and adquired-B). Beck ML, Judd WJ, eds. In: Polyagglutination. Washington, DC: AABB, 1980.

Método 13 Reacetilación de GRs B adquirido

Principio Los GRs de grupo A 1 que tienen el antígeno B adquirido in vivo a través de la deacetilación de sus residuos de N-acetil galactosamina (determinante del grupo A) pueden ser reacetilados in vitro.

Aplicación Esta prueba se usa para confirmar el estado B adquirido de los GRs.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Buffer fosfato (BF) 0.2 M (pH 8.5)

3.

NaOH 1.0 N o Na 2 HPO 4 0.5 M.

4.

Agitador magnético y varilla agitadoras

5.

Agua destilada

6.

Papel para medir pH

7.

Tubos de ensayo

8.

Pipetas

9.

Centrífuga apropiadamente calibrada

10.

Campana química

11.

GRs B adquirido a estudiar

12.

GRs de control de grupo B

Procedimiento

1.

Preparar el buffer fosfato 0.2 M disolviendo 2.84 g de Na 2 HPO 2 , 0.85 g de NaCl, y 2 mL de

glicerol en aproximadamente 80 mL de agua destilada. Diluir hasta un volumen final de 100 mL

con

agua destilada.

2.

Preparar NaOH 1.0 N disolviendo 4.0 g de NaOH en 100 mL de agua destilada, o preparar Na 2 HPO 4 disolviendo 7.1 g de Na 2 HPO 4 en 100 mL de agua destilada. Conservar a 4 °C.

3.

Permitir que el buffer fosfato y el Na 2 HPO 4 0.5 M tomen temperatura ambiente antes de usar (ver Nota 1).

4.

A 0.1 mL de paquete globular de los GRs B adquirido (lavados 3 veces con salina), agregar 3.0

mL

de buffer fosfato 0.2 M.

5.

A 0.1 mL de paquete globular de los GRs B de control (lavados 3 veces con salina), agregar 3.0

mL

de buffer fosfato 0.2 M.

6.

Mientras se agita constantemente las suspensiones de GRs con un agitador magnético y la pequeña barra magnética, agregar 20 ul de anhídrido acético (ver Notas 2 y 3).

7.

Incubar las mezclas a temperatura ambiente durante 10 minutos.

8.

Neutralizar cada mezcla a pH 7.0 con NaOH, o neutralizar las mezclas agregando 2.0 mL de Na 2 HPO 2 0.5 M.

9.

Lavar los GRs 4 veces con solución salina.

10.

Estudiar con reactivos anti-B.

Interpretación

1.

Una marcada reducción de la reactividad de los GRs con los reactivos anti-B después del tratamiento con anhídrido acético es indicativo de un antígeno B adquirido. Los antígenos B heredados no son afectados por este tratamiento.

2.

Si inicialmente no son reactivos o sólo débilmente reactivos con la lectina Dolichos biflorus (anti- A 1 ), los GRs B adquirido mostrarán una expresión normal del antígeno A 1 después del tratamiento

con

anhídrido acético.

Notas

1.

El Na 2 HPO 4 cristaliza al conservarse a 4°C. Disolver calentando a 37 °C si es necesario.

2.

El volumen preciso de anhídrido acético a usarse deberá ser determinado empíricamente, porque la hidratación varía en grado extremo entre las partidas de anhídrido acético. La hidratación extrema puede causar la decoloración o lisis de los GRs.

3.

Usar una campana química cuando utilice el anhídrido acético.

Referencias

1. Gerbal A, Ropars C, Gerbal R, et al. Adquired-B antigen disappearance by in vitro acetylation associated with A 1 activity restoration. Vox Sang 1976;31:64-6.

2. Lisowska E, Duk M. Effect of modification of amino groups of human erythrocyte M, N, and N vg blood group specificities. Vox Sang 1975;28:392-7.

Método 14 Dispersión de la aglutinación causada por la Gelatina de Wharton

Principio La hialuronidasa remueve el ácido hialurónico de los GRs.

Aplicación La sangre de cordón obtenida en forma inapropiada (Ej.: expresión del cordón) puede contener gelatina de Wharton, la cual puede causar falsas tipificaciones ABO/Rh debido al ácido hialurónico en el cual están inmersos los GRs.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Hialuronidasa (c.s.p. 150 unidades), Signa Chemical Co.

2. Suero de grupo AB inerte (libre de anticuerpos)

3. Solución salina

4. Pipetas

5. Tubos de ensayo

6. Centrífuga apropiadamente calibrada

7. Incubador / baño térmico

8. GRs de cordón a estudiar

Procedimiento

1. Lavar los GRs de cordón 3 veces con solución salina a 37 °C. Resuspender al 3% en salina.

2. Por cada gota de los GRs a ser estudiados, agregar 1 gota de hialuronidasa. Mezclar y dejar estar 2 minutos.

3. Así, los GRs pueden usarse para estudiar si el control no muestra aglutinación.

Controles A 1 gota de la suspensión de GRs de cordón, agregar 1 gota de hialuronidasa. Dejar en reposo 2 minutos antes de agregar 1-2 gotas de suero de grupo AB.

Interpretación Si el tubo control muestra aglutinación, el tiempo de incubación con hialuronidasa debe aumentarse o debe obtenerse una nueva muestra de sangre periférica del paciente.

Referencias

1. Flanagan CJ, Mitoma TF. Clumping (false agglutination) of blood from the umbilical cord. Am J

Clin Path 1958;29:337.

Método 15 Investigación de la formación de rouleaux

Principio Los sueros con propiedades para producir rouleaux llevan a que la mayoría de los GRs parezcan aglutinados cuando son estudiados. La observación microscópica de la característica formación en “pila de monedas” o la dispersión por el agregado de salina distinguirá la formación de rouleaux de una verdadera aglutinación.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Centrífuga apropiadamente calibrada

2. Microscopio

3. Portaobjetos

4. Tubos de ensayo

5. Pipetas

6. Solución salina

7. Suero y GRs a estudiar

Procedimiento Técnica de adición de salina para detectar formación de rouleaux

1. Colocar 1 gota de la mezcla de GRs/suero a estudiar en un portaobjeto. Observar microscópicamente para los característicos agregados de GRs semejantes a “pilas de monedas” (ver después de las fases de aglutinación, salina a temperatura ambiente o a 37 °C), en cambio los

agregados de forma irregular resultan de la aglutinación mediada por anticuerpos.

Técnica de reemplazo con salina para detectar anticuerpo(s) enmascarados por rouleaux

1. Después que el suero y los GRs han sido incubados a temperatura ambiente o a 37 °C por 10-15 minutos, centrifugar a 1000 g durante 1 minuto y remover el suero con una pipeta.

2. Reemplazar el suero en estudio con igual volumen de salina y mezclar suavemente.

3. Centrifugar durante 15 segundos y resuspender suavemente mientras se examina en busca de aglutinación.

4. Observar microscópicamente en busca de aglutinación.

Interpretación El agregado de salina dispersa la formación de rouleaux, pero generalmente no revierte una verdadera aglutinación. Sin embargo, en algunos casos de mieloma múltiple los GRs pueden estar tan apretadamente unidos entre sí después de la centrifugación que la salina no los dispersará. En estas circunstancias, repetir la prueba pero no centrifugar antes de examinar microscópicamente.

Notas

1. El rouleaux es un fenómeno del suero y usualmente no ocurre en la fase antiglobulínica

porque los GRs son lavados, y quedan libres de suero.

2. El rouleaux se ve en enfermedades asociadas con alteración de la relación albúmina:

globulina, tales como mieloma múltiple, macroglobulinemia, crioglobulinemia, Sarcoma de Boekc,

cirrosis, hiperfibrinogenemia y en infecciones.

Referencias

1. Schimdt PJ, Kevy SV. Sources of error in a hospital blood bank. Transfusion 1963;3:198-200.

Método 16 Detección de anticuerpos irregulares

Principio y aplicaciones El suero de un paciente o donante es investigado en busca de anticuerpo(s) irregulares enfrentándolo con 2 o 3 muestras de GRs de grupo O seleccionados para los determinantes antigénicos comunes de los sistemas de grupo sanguíneo Rh, MNSs, Lewis, P, Kell, Duffy, Kidd y Luteran. Cuando la incubación de estas pruebas a 37 °C es seguida por la fase antiglobulínica (SAG), serán detectados el 95% o más de los anticuerpos clínicamente significativos.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Tubos de ensayo

2.

Pipetas

3.

GRs reactivos para detección de anticuerpos, en suspensión al 2-4% en salina

4.

Solución salina

5.

Suero Antiglobulina humana (SAGH) (poliespecífica o IgG)

6.

GRs cubiertos con IgG (Control Coombs)

7.

Centrífuga apropiadamente calibrada

8.

Incubador / baño térmico

9.

Albúmina sérica bovina (ASB) al 22 o 30% P/V

10.

Suero a estudiar y células

Procedimiento

1. Rotular 2 tubos de ensayo con el nombre del paciente (o número de dador) y el número de los GRs reactivos (I, II). Rotular un tercer tubo “autocontrol”.

2. Pipetear 0.15 mL (3 gotas) del suero del paciente en cada uno de los tubos.

3. Al suero en el tubo 1, agregar 0.05 mL (1 gota) de GRs reactivos I; al tubo 2, agregar 0.05 mL (1 gota) de GRs II; y al tubo 3 (“autocontrol”), agregar 0.05 mL (1 gota) de suspensión al 2-3% de GRs autólogos.

4. Opcional: Incubar los 3 tubos por 15 minutos a temperatura ambiente, centrifugar a 37 °C 15-20 segundos a 1000 g , y leer si hay aglutinación (ver Nota 1). Registrar los resultados.

5. Opcional: Agregar 0.10 mL (2 gotas) de ASB y mezclar (ver Nota 2).

6. Incubar la mezcla de suero-GRs durante 30 minutos a 37 °C. Centrifugar por 15-20 segundos y examinar para hemólisis y aglutinación. Registrar los resultados.

7. Lavar 3 veces con salina, descartar completamente el sobrenadante después del último lavado.

9.

Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente y examinar para aglutinación. Registrar los resultados.

10. Agregar 0.05 mL (1 gota) de GRs cubiertos con IgG a cada prueba negativa.

11. Centrifugar durante 15 segundos y leer para aglutinación. Si el contenido de algún tubo falla en aglutinar, el procedimiento debe repetirse para ese tubo de ensayo.

Interpretación Ver en la Tabla 16-1 las posibles causas de una prueba de detección de anticuerpos positiva.

Notas

1. Los anticuerpos detectados a temperatura ambiente en la fase salina son usualmente considerados sin significancia clínica.

2. Con la excepción del anti-K, un método más rápido para detectar anticuerpos es utilizando un medio salino de baja fuerza iónica (LISS) (ver M21, M23, y M25).

Referencias

1. Walker RH, ed. Technical manual. 10 th ed. Arlington, VA: AABB, 1990:555-557.

Tabla 16-1: Guía para posibles causas de incompatibilidad durante la Prueba Cruzada Mayor

Fase

Autocontrol

Células Pantalla

Posibles causas

Pre- 37ºC

o

Células del donante +

+

Alo Ac IgM, Alo Ac IgG, (raro)

+

+

+

Rouleaux, crioaglutininas, Auto Ac

+/o

algunos +

+

Caliente Receptor A 1 , A 1 B o B con anti-H o IH

+

algunos +

o

Receptor A sub. A sub B o B con anti- A 1

incidencia

AloAc IgM contra una Ag de baja

 

o

uno +

o uno +

El donante o una de las cél. Pantalla es poliaglutinable

Post-37ºC

o

+

+

AloAc IgG

+

+

+

Potente AloAc IgM Auto Ac caliente

Antiglobulínica

+

+

+

Auto Ac caliente (Idiopático o Droga

+

o

o

Dependiente) Auto Ac frío fijador de complemento Auto + Alo Ac Paciente con PAD positiva

o

uno +

o

Células de donante con PAD +, o es positiva

o

+

+

para un Ag de baja incidencia contra el cual el paciente tiene un Ac. Presencia de uno o más Acs

o

+

+

Alo Ac dirigido hacia un Ag de alta incidencia Presencia de múltiples Acs Anti-H o IH fijadores de complemento

Método 17 Identificación de anticuerpos

Principio y aplicaciones El suero que se sospecha contiene anticuerpos dirigidos contra los GRs es enfrentado con un panel eritrocitario de 8-10 GRs provenientes de donantes con fenotipos seleccionados. Las pruebas son observadas en busca de hemólisis y aglutinación directa y después en fase de antiglobulina indirecta. La interpretación de los resultados de la prueba está basada en la temperatura de reacción, medio de reacción, actividad hemolítica, efecto dosis, habilidad para fijar complemento, y neutralización con sustancias solubles.

Reactivos, materiales y equipamiento

2.

Pipetas

3. Panel de GRs reactivos, suspensión al 2-4%

4. Incubador / baño térmico

5. Centrífuga apropiadamente calibrada

6. Solución salina

7. Suero Antiglobulina humana (SAGH) (poliespecífica o IgG)

8. GRs cubiertos con IgG (Control Coombs)

9. Suero a estudiar y GRs

Procedimiento

1.

Rotular tubos de ensayo según el número viales de GRs del panel y para uno para autocontrol.

2.

Colocar 1 gota de la suspensión de GRs apropiados en cada tubo de ensayo. Agregar 1 gota de la suspensión al 2-4% de los GRs del paciente en el tubo de autocontrol.

3.

Agregar 2-3 gotas del suero del paciente a cada tubo y mezclar bien.

4.

Opcional: Incubar la mezcla GRs-suero a temperatura ambiente durante 15 minutos. Centrifugar a 1000 g durante 15-20 segundos. Examinar el sobrenadante en busca de hemólisis, resuspender el botón suavemente, y observar para aglutinación. Registrar los resultados en la correspondiente tabla del panel.

5.

Incubar los tubos a 37 °C durante 30 minutos.

6.

Centrifugar durante 15-20 segundos. Examinar el sobrenadante en busca de hemólisis, resuspender el botón suavemente, y observar en busca de aglutinación. Registrar los resultados en la correspondiente tabla del panel.

7.

Lavar 3 veces con salina, descartar completamente el sobrenadante después del último lavado.

8.

Agregar 2 gotas de SAGH a cada tubo y mezclar bien.

9.

Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente y examinar para aglutinación. Registrar los resultados.

10.

A todas las pruebas negativas agregar 1 gota de GRs cubiertos con IgG.

11.

Centrifugar durante 15-20 segundos y examinar para aglutinación. Si cualquier tubo careciera de aglutinación, el procedimiento debe repetirse para ese tubo de ensayo.

Interpretación

1.

La aglutinación o hemólisis en cualquier fase de la prueba es considerada como un resultado positivo e indica la presencia de anticuerpo(s) en el suero dirigidos contra los antígenos representados en los GRs de prueba.

2.

Excluir de una consideración inicial los anticuerpos hacia antígenos presentes en doble dosis en los GRs reactivos que no reaccionen con el suero del paciente.

3.

Cuando el autocontrol es no reactivo y el paciente no ha sido transfundido por lo menos en 90 días, excluir los anticuerpos hacia antígenos presentes en los GRs del paciente.

4.

Para los aloanticuerpos, los GRs del individuo que los produce deben carecer del correspondiente antígeno. Si el paciente hubiera sido transfundido recientemente, separar y fenotipar los neocitos del paciente (ver M84, 87).

5.

Por lo menos 3 GRs positivos para el antígeno y 3 GRs negativos para el antígeno deben dar las reacciones esperadas con el suero del paciente para un valor de p de 0.5.

6.

Cuando no hay una especificidad aparente, realizar pruebas usando otras técnicas tales como albúmina-PAG (ver M21), LISS-PAG (ver M23), LIP-PAG (ver M25), PEG (ver M26), o enzimas (ver M42). Considerar aumentar la relación suero-GRs (ver M119), extender el tiempo de incubación, modificar la temperatura o el pH de la prueba (ver M18), o usando sustancias solubles

para pruebas de inhibición (ver M31).

7.

Cuando el problema no puede resolverse satisfactoriamente y el paciente necesita ser transfundido, consultar con otro laboratorio de referencia.

Notas

1.

La fuerza de las reacciones puede ser un indicio de la especificidad del anticuerpo(s) presente en el suero. Evaluar las reacciones como se delinea en el procedimiento para lectura e interpretación de las reacciones (ver M117).

2.

La técnica de LISS es frecuentemente usada en los laboratorios de referencia para la detección e identificación rutinarias de anticuerpos porque es más rápida y eficiente (ver M23).

4.

Ciertos antígenos de grupos sanguíneos son desnaturalizados por algunas o todas las enzimas proteolíticas: M, N, S, Fy a , Fy b , Ch, Rg, Yt a , Xg a , y Pr. El suero que reacciona con los GRs no tratados, pero no con aquellos mismos GRs después del tratamiento enzimático, puede contener anticuerpos dirigidos hacia u o más de esos antígenos (ver M42).

Referencias

1. Issitt PD. Applied blood group serology. 3 rd ed. Miami: Montgomery Scientific Publicacions,

1985.

2. Walker RH, ed. Technical manual. 10 th ed. Arlington, VA: AABB, 1990.

3. Daniels G. Effect of enzymes on and chemical modifications of high-frequency red del antigens. Immunohematology 1992;8:53-7.

Método 18 Acidificación del suero

Principio y aplicaciones Algunos anticuerpos del sistema MN, anti-Pr, y anti-Sd a reaccionan mejor cuando el pH del suero a estudiar es de alrededor de 6.0. La acidificación del suero potenciará las reacciones de muestras débilmente reactivas de esos anticuerpos sensibles al pH.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. HCl 0.1 N

2. Suero a estudiar

3. Agua destilada

4. Tubos de ensayo

5. Pipetas

6. Papel para medir pH

7. GRs reactivos

Preparación de los reactivos

1. Preparar HCl 0.1 N diluyendo 1 parte de HCl 12 N con 119 partes de agua destilada o agregando

0.1 mL de HCl concentrado (12 N) a 11.9 mL de agua destilada.

Procedimiento

1. A 4 partes del suero a estudiar, agregar 1 parte de HCl 0.1 N. Mezclar bien.

2. Estudiar el suero con papel para pH para asegurarse que su pH es 6.0-6.5.

3. Estudiar el suero acidificado contra un panel de GRs reactivos seleccionados, incluyendo por lo menos un GR que carezca del antígeno correspondiente a la especificidad sospechada del anticuerpo.

Interpretación Las aglutininas que son sensibles al del pH del medio ambiente pueden reaccionar débilmente o sólo con GRs que tienen un antígeno fuerte o en doble dosis en el pH normal del suero. La acidificación del suero para reducir el pH entre 6.0 y 6.5 potencia la reactividad de estos anticuerpos. Si las reacciones débiles no se potencian por la acidificación, las aglutininas no son sensibles al

pH bajo.

Notas

1.

El pH debe estar por encima de 6.0 porque pueden ocurrir reacciones no específicas por debajo de este pH.

2.

Los GRs usados en la prueba de suero acidificado deben lavarse para liberarlos de conservantes, porque algunos diluyentes de los GRs pueden tener un nivel de pH tan alto como 7.5.

Referencias

1. Beattie KM, Zuelzer WW. The frequency and properties of pH-dependent anti-M. Transfusion

1965;5:322-6.

2. Marsh WL, Jenkins WJ. Anti-Sp 1 : The recognition of a new cold autoantibody. Vox Sang

1968;15:177-86.

Método 19 Inhibición del anti-M o anti-N con M y N [Aislado de tríptico crudo]

Principio y aplicaciones Es posible inhibir el anti-M con sialoglicoproteína M, y el anti-N con sialoglicoproteína N. La sialoglicoproteína M puede ser separada de GRs M+N- y la sialoglicoproteína N puede separarse de GRs M-N+. Las sialoglicoproteínas preparadas por extracción [tríptico crudo] de GRs pueden usarse en estudios de inhibición.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Suero a estudiar que contenga anti-M o anti-N

2.

Salina tamponada con fosfato (PBS) 0.1 M pH 8.0 (ver M133)

3.

Tripsina, tripsina tipo III de páncreas bovino, Sigma Chemical Co., catálogo número T-8253

4.

Acido clorhídrico (HCl) 0.1 N

5.

Aislado de tríptico crudo

6.

Solución salina

7.

Tubos de ensayo

8.

Pipetas

9.

pHmetro o Papel para medir pH

10.

Agua desionizada

11.

GRs M+N- y M-N+, suspensión al 5%

12.

Columna de diálisis

13.

Ventilador

14.

Centrífuga adecuadamente calibrada

Preparación de los reactivos

1. Preparar PBS 0.1 M pH 8.0 (ver M133).

2. Preparar la tripsina para una concentración final de 1 mg/mL (ver Nota 1).

a.Preparación de tripsina para los GRs: disolver 100 mg de tripsina en 80 mL de PBS pH 8.0. b.Preparación de tripsina para el blanco: disolver 50 mg de tripsina en 50 mL de PBS pH 8.0.

3. Preparar el HCl 0.1 N: Agregar 0.1 mL de HCl 12 N (37%) a 11.9 mL de agua desionizada.

4. Preparar Aislado de tríptico crudo:

a. Recolectar con cualquier anticoagulante 1 tubo de sangre de un voluntario M+N- y 1 tubo de sangre de un voluntario M-N+ (ver Nota 2). b.Lavar por lo menos 2.5 mL de GRs de ambas muestras 3 veces con salina. c.Lavar 1 vez con PBS pH 8.0. d.Preparar una suspensión de GRs al 20% en PBS pH 8.0 de ambas muestras.

e. Agregar 10 mL de cada suspensión de GRs al 20% a 2 alícuotas separadas de 40 mL de PBS

pH 8.0 conteniendo 50 mg de tripsina.

f. En un tercer recipiente, colocar los 50 mL de PBS pH 8.0 con 50 mg de tripsina (blanco). g.Mezclar e incubar a 37 °C durante 30 minutos. h.Centrifugar a 2000 rpm (750 x g) durante 5 minutos.

i. Remover el sobrenadante, colocarlo en 3 recipientes limpios y hervir durante 10 minutos.

j. Concentrar los sobrenadantes y el blanco hasta alrededor de 1 mL. Colocar cada sobrenadante en una columna de diálisis y colgar la columna frente a un ventilador para que tenga lugar la evaporación.

k. Remover los sobrenadantes concentrados y el blanco de las columnas de diálisis y colocar en 3 tubos de ensayo.

l. Agregar 1 gota de HCl 0.1 N por cada mL de sobrenadante concentrado y blanco. Mezclar.

Procedimiento La inhibición se puede realizar como una prueba de 1 tubo o como un procedimiento de titulación.

1. Titular (en salina) 0.5 mL de los sueros a estudiar con la técnica de diluciones dobles (ver M123).

2. Rotular 4 hileras de tubos de ensayo para las diluciones de M, N, blanco y salina.

3. Colocar 2 gotas de cada dilución en el correspondiente tubo en las cuatro filas de tubos.

4. Agregar 2 gotas de extracto tríptico M a la fila 1.

a.

b.

Agregar 2 gotas de extracto tríptico N a la fila 2.

c.Agregar 2 gotas de blanco de control a la fila 3. d.Agregar 2 gotas de salina a la fila 4.

5.

Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.

6. Agregar 1 gota de la suspensión al 5% en salina de los GRs apropiados.

7. Estudiar por técnica de reactividad óptima.

Controles Estudiar en paralelo un reactivo anti-M y anti-N humanos.

Interpretación El anti-M debe ser neutralizado por el extracto de M pero no por el extracto de N o los controles de blanco y salina. El anti-N debe ser neutralizado por el extracto de N pero no por el extracto de M o los controles de blanco y salina.

Notas

1. La tripsina debe prepararse inmediatamente antes de su uso.

2. Las muestras de GRs para aislado tríptico deben ser tomadas dentro de la hora del comienzo del procedimiento.

3. Este método de extracción no es todas las veces exitoso. Los resultados son sólo confiables cuando todos los controles reaccionan como se espera. Si el extracto es inactivo, repetir el procedimiento usando muestras de GRs frescos.

Referencias

1. Issitt PD, Wilkinson SL. Anti-Tm is anti-N polipeptide. Transfusion 1981;21:493-7.

2. Dean W. Inhibition of anti-M o anti-N with M and N crude tryptic isolates. Red Cell Free Press American Red Cross Reference Laboratory Newsletter 1981;6(2):19.

Método 20 Utilización de Albúmina

Principio y aplicaciones La albúmina probablemente incrementa la captación de anticuerpos al disminuir la fuerza iónica del medio. Es posible potenciar la aglutinación de los GRs por anticuerpos débiles, particularmente aquellos del sistema Rh, por la acción de la albúmina a los GRs después que han sido incubados con el suero a estudiar.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Albúmina sérica bovina (ASB) al 30%

2. Suero a estudiar, preferentemente obtenido dentro de las 48 horas

3. GRs a estudiar

4. GRs autólogos

5. Tubos de ensayo

6. Solución salina

7. Pipetas

8. Centrífuga adecuadamente calibrada

9. Incubador / baño térmico

Procedimiento

1. Preparar una suspensión al 3% en salina de los GRs a estudiar y los GRs autólogos.

2. Pipetear 1 gota de los GRs a estudiar en un tubo y la misma cantidad de GRs autólogos en un segundo tubo. Centrifugar ambos tubos a 1000 g durante 1 minuto y descartar completamente la salina para producir un botón seco de GRs.

3. A cada tubo de ensayo agregar 2-3 gotas del suero a estudiar.

4. Mezclar e incubar a 37 °C durante 15-30 minutos.

5. Centrifugar durante 10 segundos.

6. Cuidadosamente, dejar correr 2 gotas de ASB al 30% por el interior del tubo para formar una capa sobre el botón de GRs. No mezclar el contenido del tubo.

7. Incubar los tubos de ensayo a 37 °C durante 15 minutos.

Notas

1. Como la albúmina tiende a producir “adhesividad”, una aglutinación verdadera se determina mejor con un examen microscópico.

Referencias

1. Case J. The albumin layering for D typing. Vox Sang 1959;4:403.

2. Garratty G. Personal communication, cited in Mollison PL, Blood transfusion in clinical medicine.

7 th ed. Oxford: Blackwell, 1983:495.

Método 21 Prueba de albúmina-antiglobulina

Principio La albúmina incrementa la captación de anticuerpos por algunos antígenos eritrocitarios, notablemente en el Sistema Rh. Con los anticuerpos de alto título y baja afinidad (HTLA), la albúmina probablemente aumenta la captación del anticuerpo al disminuir la fuerza iónica del medio.

Aplicaciones Este método puede usarse para la detección o identificación de anticuerpos y para las pruebas de compatibilidad. Esta técnica es particularmente útil en el estudio de anticuerpos HTLA.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Albúmina sérica bovina (ASB) al 22% o 30% P/V

2.

Suero Antiglobulina Humana (SAGH) (poliespecífica o anti-IgG)

3.

Suspensiones al 3-5% en salina de GRs reactivos, autólogos y otros GRs de fenotipos

seleccionados

4.

Suero a estudiar

5.

GRs recubiertos con IgG (Control Coombs), suspensión al 3-5% en salina

6.

Solución salina

7.

Pipetas

8.

Tubos de ensayo

9.

Centrífuga adecuadamente calibrada

10.

Incubador / baño térmico

Procedimiento

1.

Rotular tubos de ensayo para el número de muestras de GRs a estudiar y para el autocontrol.

2.

Agregar a cada tubo, 2-3 gotas (0.1 mL) de suero, 2-3 gotas (0.1 mL) de ASB, y 1 gota (0.05 mL) de GRs a estudiar. A la misma cantidad de suero y ASB en un tubo rotulado “autocontrol”, agregar 1 gota (0.05 mL) de GRs autólogos. Mezclar.

3.

Incubar a 37 °C durante 30 minutos.

4.

Centrifugar a 1000 g durante 15-20 segundos. Examinar el sobrenadante en busca de hemólisis, resuspender el botón suavemente, y observar en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

5.

Lavar 3-4 veces con salina, descartar completamente después de cada lavado.

6.

Agregar la cantidad de SAGH especificada por el fabricante a cada tubo y mezclar bien.

7.

Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente y observar en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

8.

Opcional: Examinar todas las pruebas negativas microscópicamente.

9.

Agregar 1 gota de GRs recubiertos con IgG a cada tubo.

10.

Centrifugar durante 15-20 segundos y examinar en busca de aglutinación. Si cualquier tubo carece de aglutinación, el procedimiento debe repetirse para ese tubo.

Referencias

1. Walker RH, ed. Technical manual. 10 th ed. Arlington, VA: AABB, 1990:556.

Método 22 Técnica de salina-antiglobulina

Principio La sensibilización de GRs por anticuerpos es detectada por la adición de suero antiglobulina humana (SAGH).

Aplicaciones Este método puede usarse para la detección e identificación de anticuerpos y para las pruebas de compatibilidad.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. SAGH (poliespecífica o anti-IgG)

2. Suero a estudiar

3. Suspensiones al 3-5% en salina de GRs reactivos, autólogos y otros GRs con fenotipos seleccionados

4. GRs recubiertos con IgG (Control Coombs), suspensión al 3-5% en salina

5. Solución salina

6. Pipetas

7. Tubos de ensayo

8. Centrífuga adecuadamente calibrada

9. Incubador / baño térmico

Procedimiento

1.

Rotular tubos de ensayo para el número de muestras de GRs a estudiar (“prueba”) y para el autocontrol (“auto”).

2.

Agregar a cada tubo, 2-3 gotas (0.1 mL) de suero a estudiar. Agregar 1 gota (0.05 mL) de GRs reactivos a los tubos rotulados “prueba” y 1 gota (0.05 mL) de GRs autólogos al tubo rotulado “auto”. Mezclar.

3.

Opcional: incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.

4.

Centrifugar a 1000 g durante 15-20 segundos. Examinar el sobrenadante en busca de hemólisis, resuspender el botón suavemente, y observar macroscópicamente en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

5.

Incubar a 37 °C durante 30-60 minutos.

6.

Centrifugar durante 15-20 segundos. Examinar el sobrenadante en busca de hemólisis, resuspender el botón suavemente, y observar en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

7.

Lavar 3 veces con salina, descartar completamente después de cada lavado.

8.

Agregar la cantidad de SAGH especificada por el fabricante a cada tubo y mezclar bien.

9.

Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente y observar en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

10.

Opcional: Examinar todas las pruebas negativas microscópicamente.

11.

Agregar 1 gota (0.05 mL) de GRs recubiertos con IgG a cada prueba negativa.

12.

Centrifugar durante 15-20 segundos y examinar en busca de aglutinación. Registrar los resultados. Si cualquier tubo carece de aglutinación, el procedimiento debe repetirse para ese tubo.

Notas

1.

El SAGH anti-IgG puede sustituirse por SAGH poliespecífico para permitir la detección de anticuerpos irregulares, reactivos en frío que fijan complemento.

Referencias

1. Coombs Rra, Mourant AE, Race RR. A new test for the detection of weak and “incomplete” Rh agglutinins. Brit J Exp Path 1945;26:255-66.

Método 23 Prueba de solución salina de baja fuerza iónica-antiglobulina (LISS-PAG)

Principio Con la disminución de la fuerza iónica, aumenta la unión de los anticuerpos con sus correspondientes antígenos. Una solución de baja fuerza iónica 0.03 M es efectiva para la detección de anticuerpos de grupos sanguíneos, manteniendo todavía la sensibilidad de la prueba. Las reacciones positivas debidas al agregado de inmunoglobulinas y/o a la activación del complemento no se observan cuando se usa LISS.

Aplicación La mayor ventaja de este procedimiento es acortar el tiempo de incubación para la detección e identificación de anticuerpos y en las pruebas de compatibilidad.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Solución salina

2. LISS 0.03 M

3. Suero Antiglobulina Humana (SAGH) (poliespecífica o anti-IgG)

4. Centrífuga adecuadamente calibrada

5. Suero a estudiar

6. Suspensiones al 2-4% en LISS de GRs autólogos y reactivos o GRs de fenotipos seleccionados

7. Pipetas

8. Tubos de ensayo

9. Incubador / baño térmico

Preparación de los reactivos Preparar LISS 0.03 M combinando lo siguiente:

180 mL de solución salina 0.17 M

20 mL de buffer fosfato 0.15 M, pH 6.7

800 mL de glicinato de sodio 0.3 M, pH 6.7

Procedimiento

1.

Lavar los GRs por lo menos una vez con salina y descartarla completamente después del último lavado.

2.

Resuspender los GRs al 2-4% en LISS.

3.

En tubos de ensayo apropiadamente rotulados, agregar igual volumen (2 gotas) de suero y de GRs suspendidos en LISS.

4.

Incubar 10-15 minutos a 37 °C.

5.

Centrifugar a 1000 g durante 15 segundos. Leer macroscópicamente en busca de hemólisis y aglutinación. Registrar los resultados.

6.

Lavar los tubos 3-4 veces con salina, descartar el sobrenadante completamente después de cada lavado.

7.

Agregar la cantidad de SAGH especificada por el fabricante a cada tubo y mezclar bien.

8.

Centrifugar durante 15-20 segundos. Resuspender suavemente, y observar en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

9.

Opcional: examinar todas las pruebas negativas microscópicamente.

10.

Agregar 1 gota (0.05 mL) de GRs recubiertos con IgG a cada prueba negativa.

11.

Centrifugar durante 15-20 segundos y examinar en busca de aglutinación. Registrar los resultados. Si cualquier tubo carece de aglutinación, el procedimiento debe repetirse para ese tubo.

Notas

1.

El LISS puede conservarse a 4 °C y, a menos que haya sido esterilizado, debe descartarse a los pocos días. La conservación puede extenderse con el agregado de 0.5 g de ázida sódica como conservante. A esta concentración, la fuerza iónica del LISS es elevada de 0.0355 a 0.043 sin que afecte apreciablemente la reactividad serológica.

2.

Hay disponible LISS comercial y debe ser usado y conservado siguiendo estrictamente las instrucciones del fabricante.

Referencias

1. Low B, Messeter L. Antiglobulin test in low ionic salt solution for rapid antibody screening and crossmatching. Vox Sang 1974;26:53.

2. Moore HC, Mollison PL. Use of a low ionic-strength medium in manual tests for antibody detection. Transfusion 1976;16:91.

3. Widmann FK, ed. Technical manual. 8 th ed. Arlington, VA: AABB, 1985:205-6.

4. Walker RH, ed. Technical manual. 10 th ed. Arlington, VA: AABB, 1990:557.

5. Fritzsimmons JM, Morel PA. The effects of red blood cell suspending media on hemagglutination and the antiglobulin test. Transfusion 1979;19:81-5.

Método 24 Prueba de antiglobulina en medio de baja fuerza iónica (LIM por las siglas en inglés- PAG)

Principio y aplicación El suero y los GRs son incubados a 37 °C en un medio de baja fuerza iónica (LIM), luego son lavados con una solución de baja fuerza iónica y probados usando anti-IgG de baja fuerza iónica (LISS). Las reacciones antígeno-anticuerpo son resaltadas por el mantenimiento de las condiciones de baja fuerza iónica a través del procedimiento. Este método es muy útil para investigar sueros que parecen carecer de anticuerpos con los métodos de rutina. Puede usarse para investigar anemia hemolítica con Coombs negativa o otros problemas de pacientes que se sospechan tienen anticuerpos de baja afinidad.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Suero a estudiar

2.

GRs detectores o de panel, suspensión al 3%

3.

Medio de baja fuerza iónica

4.

Solución de lavado de baja fuerza iónica

5.

Anti-IgG de baja fuerza iónica

6.

Buffer de Sorenson pH 7.0

7.

Incubador / baño térmico

8.

Centrífuga adecuadamente calibrada

9.

Tubos de ensayo

10.

Pipetas

11.

Solución salina

12.

Papel para medir pH o pHmetro

13.

Columna de diálisis

14.

Suero anti-globulina humana anti-IgG

Preparación de los reactivos

1. Preparar el buffer de Sorenson, pH 7.0 combinando 41.3 mL de solución A (9.073 g/L de KH 2 PO 4 ) con 58.7 mL de solución B (9.610 g/L de Na 2 HPO 4 )

a.

b.

Diluir el buffer de Sorenson para hacer buffer de Sorenson 0.004 M, combinando 60 mL de

buffer de Sorenson con 960 mL de agua destilada. Conservar a 4 °C.

2. Preparar solución de lavado LISS disolviendo 15.2 g glicina en polvo y 1.62 g de NaCl en 1000

mL de buffer de Sorenson 0.004 M.

3. Preparar LIM disolviendo 19 g de glicina en polvo en 1000 mL de agua destilada, ajustar el pH a

7.0, conservar a 4 °C.

4. Preparar el anti-IgG de baja fuerza iónica por cualquiera de los siguientes métodos.

Método A: Usando anti-IgG natural Determinar por una titulación (prueba de las diluciones del anti-IgG contra diluciones del anticuerpo) el título óptimo de trabajo para el anti-IgG sin diluir. Usar para esta determinación el diluyente de baja fuerza iónica y varios anticuerpos IgG débiles. El pH del diluyente de baja fuerza iónica debe ser de 7.0. El diluyente de baja fuerza iónica es: 0.18% de NaCl, 0.5% de albúmina bovina y 1,52% de glicina.

Método B: Usando anti-IgG comercial Dializar el reactivo anti-IgG comercial en la solución de lavado durante una noche. Colocar la

cantidad de IgG a ser dializada en una columna de diálisis que está anudado en un extremo. Usar

una columna de diálisis que sea lo suficientemente grande como para alojar un volumen a tratar y

un gran volumen de solución de diálisis. Extraer el aire de la columna de diálisis por enc ima del anti-IgG y hacer un nudo en la parte superior de la columna. Introducir la columna de diálisis en la solución de diálisis hasta que la columna esté totalmente sumergida en la solución. La columna puede rajarse y perder el contenido si se permite que se seque. Después del dializado durante la noche, sacar la columna de diálisis y secarla, entonces cortar para abrirla y drenar el anti-IgG en un frasco limpio y estéril. Este se puede conservar a 4 °C. El anti-IgG debe estudiarse con varios ejemplos de anticuerpos débiles del sistema Kidd para asegurarse que se comporta satisfactoriamente.

Controles

2.

El control negativo puede ser un autocontrol o el suero anticuerpo positivo con GRs antígeno negativos.

Procedimiento

1.

Mezclar 1 gota de GRs al 3% con 4 gotas del suero a estudiar e incubar a 37 °C durante 2 minutos. Preparar los controles positivos y negativos de la misma forma.

2.

Agregar 8 gotas de glicina al 1.9% precalentada a cada prueba y al control.

3.

Incubar a 37 °C durante 20 minutos.

4.

Centrifugar a 1000 x g. Remover el sobrenadante, y lavar 3 veces con la solución de lavado de baja fuerza iónica (LISS), decantar completamente después de cada lavado.

5.

Agregar 2 gotas de anti-IgG LISS, centrifugar, y resuspender suavemente. Leer y registrar los resultados.

6.

Opcional: examinar todas las pruebas negativas microscópicamente.

7.

Agregar 1 gota (0.05 mL) de GRs recubiertos con IgG a cada prueba negativa.

8.

Centrifugar durante 15-20 segundos y examinar en busca de aglutinación. Registrar los resultados. Si cualquier tubo carece de aglutinación, el procedimiento debe repetirse para ese tubo.

Notas

1.

Este método tiene una alta tasa de falsos positivos (hasta el 9% si los resultados son leídos sólo macroscópicamente) y no puede usarse para la detección rutinaria de anticuerpos.

Referencias

1. Ahn JH, Rosenfield RE, Kochwa S. Low ionic antiglobulin tests. Transfusion 1987;27:125-33.

2. Postoway N, Garratty G. Evaluation of newly described low ionic antiglobulin test (abstract). Transfusion 1987;27:516.

Método 25 Prueba de Polybrene® de baja fuerza iónica-antiglobulina (LIP-PAG)

Principio El Polybrene, un polímero de amonio cuaternario, provoca la agregación de los GRs normales, soluciones salinas hipertónicas, tal como el citrato sódico, dispersan esta agregación. En la prueba LIP-PAG, si los GRs son sensibilizados con anticuerpo por la incubación en un medio de baja fuerza iónica y luego tratados con Polybrene, la aglutinación no será dispersada por la subsiguiente adición de citrato sódico.

Aplicación Como que el método es rápido y muy sensible, puede usarse para la identificación de anticuerpos y para la detección de un gran número de unidades antígeno negativo para pacientes cuyos sueros contienen anticuerpos débiles.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Medio de baja fuerza iónica (LIM)

2.

Polybrene, solución almacenada al 10% P/V

3.

Solución de Polybrene (agregación)

4.

Solución de citrato sódico glucosa (resuspensión)

5.

Suero antiglobulina humana Anti-IgG (ver Nota 1)

6.

Solución de lavado

7.

GRs reactivos y autólogos, suspensión al 4-5% en LIM

8.

Suero a estudiar (ver Nota 2)

9.

Centrífuga adecuadamente calibrada

10.

Solución salina

11.

Bromidrato de hexadimetrina, Aldrich Chemical Co.

12.

Citrato trisódico

13.

Dextrosa

14.

Pipetas

15.

Tubos de ensayo

Preparación de los reactivos

1.

Preparar el LIM: disolver 50 g de dextrosa y 2 g de EDTA en 1000 mL de agua destilada. Conservar a 4 °C.

3.

Preparar la solución de Polybrene: disolver 10 g de bromidrato de hexadimetrina en 100 mL de salina. Conservar en una botella plástica a 4 °C (ver Nota 3).

4.

Preparar la solución de resuspensión: disolver 3.52 g de citrato trisódico (Na 3 C 6 H 5 O 7 •2H 2 O) y 2 g de dextrosa en 100 mL de agua destilada. Conservar a 4 °C.

5.

Preparar el citrato trisódico: agregar 5.88 g de Na 3 C 6 H 5 O 7 •2H 2 O a 100 mL de agua destilada. Agregar 50 mL de citrato trisódico 0.2 M a 950 mL de salina.

Controles

1. Negativo: Suero de grupo AB libre de anticuerpos irregulares cuando se prueban contra GRs Rh positivos de grupo O.

2. Positivo: Diluir anti-D comercial modificado para uso en tubo al 1:10.000 agregando 0.1 mL a 100

mL de agua destilada; de esta dilución, dispensar 0.1 mL en 1.0 mL de suero AB libre de

anticuerpos irregulares. Este anti-D al 1:10.000 en suero AB, cuando se prueba con GRs O Rh positivos, deben dar resultados positivos.

Procedimiento

1.

Rotular 4 tubos de ensayo: un para cada autocontrol, prueba, control positivo y control negativo.

2.

Agregar 2-3 gotas (0.1 mL) del suero a estudiar y 1 gota (0.05 mL) de GRs autólogos en el tubo de

autocontrol; colocar la misma cantidad de suero a estudiar en el tubo rotulado “prueba” y agregar 1

gota

(0.05 mL) de GRs reactivos.

3.

Preparar los tubos de control de igual modo (ver Controles).

4.

Agregar 1 mL de LIM a cada tubo, mezclar e incubar 1 minuto a temperatura ambiente.

5.

Agregar 2 gotas (0.1 mL) de solución de Polybrene a cada tubo e invertir para mezclar. Incubar

por

10-15 segundos.

6.

Centrifugar a 1000 g durante 10-15 segundos.

7.

Decantar el sobrenadante, pero no mezclar.

8.

Agregar 2 gotas (0.1 mL) de solución de resuspensión a cada tubo. Mezclar suavemente durante 10 segundos.

9.

Examinar cada tubo macroscópicamente mientras se los mantiene en un ángulo de 45 grados. Registrar los resultados.

10.

Agregar otra gota de solución de resuspensión a cada tubo y mezclar bien.

11.

Lavar los GRs 3 veces con solución de lavado. Decantar completamente.

12.

Al botón de GRs, agregar anti-IgG de acuerdo a las especificaciones del fabricante (ver Nota 5).

13.

Centrifugar durante 15 segundos.

14.

Leer macroscópicamente y registrar los resultados.

15.

Agregar GRs recubiertos con IgG a todos los tubos negativos, mezclar, y centrifugar durante15 segundos. Leer macroscópicamente en busca de aglutinación. Si se obtienen resultados negativos, la prueba debe ser repetida.

Notas

1.

Preferentemente debe usarse suero antiglobulina anti-IgG en lugar del poliespecífico, la fracción C3 puede fijarse en la fase de sensibilización en el medio de baja fuerza iónica.

2.

Para la detección o identificación de anticuerpos y las pruebas de compatibilidad, se usa suero sin diluir. Pero cuando el método es usado para estudiar unidades antígeno negativo, el suero puede ser diluido con suero AB libre de aglutininas frías o calientes.

3.

Ya que el Polybrene se adsorbe al vidrio y se debilita con la conservación prolongada en vidrio, debe colocarse en botellas plásticas.

4.

El Polybrene varía en fuerza de lote en lote; considerar una fuerza de 0.05% como guía.

Determinar la fuerza correcta por ensayo y error.

5.

Cuando se investigan antígenos de los sistemas Ss, Kell y Jka, es necesaria la PAG para evitar las reacciones negativas falsas. Para otros sistemas, las reacciones pueden ser débiles o negativas si se

pasa a la PAG.

Referencias

1. Lalezari P, Jiang AF. The manual Polybrene test: A simple and rapid procedure for detection of

red cell antibodies. Transfusion 1980;20:206-11.

2.

Dembitzer HM, Oberhardt BJ, Duffy JL, Lalezari P. Polybrene-induced red RBC aggregation in vitro. Morphologic aspects. Transfusion 1972;12:94-7.

Método 26 Prueba de polietilenglicol-antiglobulina (PEG-PAG)

Principio El polietilenglicol aumenta la captación de anticuerpos por los antígenos.

Aplicación Esta técnica es particularmente útil para pruebas de detección e identificación de anticuerpos cuando el anticuerpo es débil.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Polietilenglicol, MW3350, al 20% P/V, Sigma Chemical Co., catálogo número P3640.

2.

GRs reactivos y autólogos, suspensión al 4-5% en salina

3.

Suero a estudiar

4.

Suero antiglobulina humana (SAGH) Anti-IgG (ver Nota 1)

5.

Centrífuga adecuadamente calibrada

6.

Tubos de ensayo

7.

Pipetas

8.

Solución salina

9.

Incubador / baño térmico

10.

GRs cubiertos con IgG (Control Coombs)

11.

Salina tamponada con fostato (PBS), pH 7.3 (ver M133)

Preparación de los reactivos

1. Agregar 20 g de PEG a 100 mL de PBS, pH 7.3.

Procedimiento

1.

Rotular tubos de ensayo para el número de muestras de GRs a ser estudiadas. Incluir un autocontrol.

2.

Agregar a cada tubo 2 gotas (0.1 mL) de suero a estudiar, 4 gotas (0.2 mL) de PEG, y 1 gota (0.05 mL) de los GRs reactivos. Agregar el mismo volumen de suero, PEG, y GRs autólogos en el tubo de autocontrol.

3.

Mezclar e incubar a 37 °C durante 15 minutos.

4.

No centrifugar (ver Nota 2).

5.

Lavar los GRs 3 veces con salina y decantar completamente el sobrenadante final.

6.

Agregar SAGH anti-IgG en la cantidad especificada por el fabricante.

7.

Centrifugar a 1000 g durante15 segundos.

8.

Examinar macroscópicamente los GRs en busca de aglutinación. Registrar los resultados.

9.

Agregar GRs recubiertos con IgG a todos los tubos negativos, mezclar, y centrifugar durante 15 segundos. Leer macroscópicamente en busca de aglutinación. Si se obtienen resultados negativos, la prueba debe ser repetida.

Notas

1.

Debe usarse preferentemente SAGH anti-IgG en lugar del poliespecífico, para evitar las reacciones positivas debidas a la fijación de C3 por autoanticuerpos fríos.

2.

Los GRs no serán fácilmente resuspendidos tras la centrifugación.

Referencias

1. Nance S, Garratty G. Polyethylene glyco l: A new potentiator of red blood cell antigen reactions. Am J Clin Path 1987;87:633-5.

Método 27 Tratamiento de los GRs con ZZAP

Principio El ZZAP es un reactivo que combina tiol y proteasa. El tiol remueve las IgG unidas a los GRs y la enzima desnaturaliza los antígenos sensibles a la proteasa.

Aplicación El uso primario del ZZAP es la preparación de GRs de pacientes con anemia hemolítica autoinmune caliente para la autoabsorción autóloga de autoanticuerpos. Un uso secundario es la preparación de GRs que carezcan de los antígenos del sistema Kell (excepto Kx) y otros antígenos sensibles a la proteasa.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Ditiotreitol (DTT) 0.2 M, reactivo Cleland, Calbiochem

2.

Tampón fosfato (TF) 15 M, pH 5.4 (ver M132)

3.

Papaína al 2 %

4.

Papaína activada con cisteína al 1% (ver M42)

5.

Salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.3 (ver M133)

6.

GRs de prueba, autólogos/homólogos

7.

Tubos de ensayo

8.

Solución salina

9.

Pipetas

10.

Incubador / baño térmico

11.

Frasco

12.

Papel de filtro Whatman No. 1

13.

Papaína (papaína tipo II), Sigma Chemical Co.

14.

Centrífuga adecuadamente calibrada

Preparación de los reactivos

1. Preparar el DTT 0.2 M: agregar 1 g de DTT a 32.4 mL de PBS. Dispensar en alícuotas de 2.5 mL y conservar a 20 °C o menos.

2. Preparar L-cisteína HCl : agregar 0.88 g de L-cisteína HCl a 10 mL de agua destilada.

3. Preparar papaína al 2% : agregar 2 g de papaína en polvo a 100 mL de tampón fostato 15 M en un frasco. Mezclar el contenido por rotación durante 15 minutos a temperatura ambiente. Filtar con un filtro de papel Whatman No. 1.

4. Preparar la papaína activada con cisteína: incubar 10 mL de papaína al 2% en PBS 15 M con 10

mL

de L-cisteína HCl 0.5 M por 1 hora. Diluir hasta 200 mL con TF, distribuir en alícuotas de 1

mL,

y conservar a 20 °C o menos.

5. Preparar el reactivo ZZAP : mezclar 0.5 mL de papaína activada con cisteína al 1% con 2.5 mL de

DTT y 2 mL de PBS de pH 7.3. Diluir hasta 5 mL con PBS. Para mejores resultados preparar inmediatamente antes de su uso.

Procedimiento

1. Mezclar 1 volumen de GRs concentrados con 2 volúmenes de reactivo ZZAP.

2. Incubar a 37 °C durante 30 minutos.

3. Lavar los GRs 3 veces con salina.

4. Usar en la detección/identificación de anticuerpos o en pruebas de adsorción.

Referencias

1. Branch DR, Petz LD. A new reagent (ZZAP) having multiple applications in immunohematology.

Am J Clin Pathol 1982;78:161-7.

Método 28 GRs modificados con ditiotreitol

Principio Los antígenos de los grupos sanguíneos Cartwright (Yt a ) y Kell dependen de las uniones disulfuro para mantener su integridad. El Ditiotreitol (DTT) rompe las uniones disulfuro entre los residuos del aminoácido cisteína. Estas uniones disulfuro mantienen la estructura del antígeno necesaria para el reconocimiento por el correspondiente anticuerpo. El antígeno Kx no se es afectado por el tratamiento con DTT.

Aplicación Este método es usado para la preparación in vitro de GRs K o y Yt(a-) a partir de GRs antígeno positivo para utilizarlos en procedimientos de identificación de anticuerpos (ver Nota 1).

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Solución salina

2. DTT 0.2 M, Calbiochem Corp.

3. Incubador / baño térmico

4. Salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.3

5. Centrífuga adecuadamente calibrada

6. Pipetas

7. Tubos de ensayo

8. GRS a estudiar

Preparación de los reactivos

1. Preparar el DTT 0.2 M disolviendo 1 g de DTT en 32 mL de PBS. Dispensar en alícuotas de 2.5

mL y conservar a 20 °C o menos.

Procedimiento

1.

Lavar los GRs una vez en salina.

2.

A 1 volumen de paquete de GRs lavados, agregar 4 volúmenes de DTT 0.2 M.

3.

Mezclar bien e incubar a 37 °C durante30 minutos.

4.

Lavar los GRs 3veces con salina y resuspender al 3-5%.

5.

Estudiar los GRs tratados con anti-k o anti-Kp b para asegurarse la efectividad del tratamiento con DTT. Silos GRs modificados no reaccionan con estos antisueros indica que el reactivo está funcionando.

Notas

1.

Los

GRs modificados con DTT no son capaces de reaccionar los siguientes anticuerpos anti-Kn a ,

anti-McC a , anti-Kn/McC, anti-JMH, y anti-McC d (Ella Toy, 1985 ICII Meeting).

2.

Algunos ejemplos de anti-Ge, anti-Lw a , y algunos anticuerpos HTLA no reaccionan con GRs modificados por DTT.

Referencias

1. Branch DR, Muensch HA, Sy Siok Hian AL, et al. Disulfide bonds are a requeirement for Kell and

Cartwright (Yt a ) blood group integrity. Br J Haematol 1983;54:573-8.

2. Shulman IA, Nelson JM, Lam H, Okamoto M, Meyer E. New approach to antibodies directed at high-frequency Kell and Cartwright antigens using DTT-modified RBCs. Lab Med 1984;15:607-8.

Método 29 Tramiento con AET de los GRs

Principio El bromuro 2-aminoetilisotiourónico (AET) desnaturaliza de tal forma los antígenos del sistema de grupo sanguíneo Kell de los GRs que éstos no son aglutinados, ni adsorben y eluyen anticuerpos de sistema Kell. El antígeno Kx no es inactivado.

Aplicación Este método es usado para la preparación de GRs que parezcan K o homocigotas, para utilizarlos en la identificación de anticuerpos hacia los antígenos de alta incidencia del Sistema Kell.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. AET al 6%, Sigma Chemical Co.

2. Na OH 5 N.

3. Solución salina

4. Incubador / baño térmico

5. Papel para medir pH

6. Tubos de ensayo

7. Pipetas

8. Centrífuga adecuadamente calibrada

Preparación de los reactivos

1. Preparar el AET al 6% disolviendo 0.6 g de AET en 10 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 8.5 con NaOH 5 N. Preparar inmediatamente antes de usar.

Procedimiento

1. A 1 mL de GRs concentrados y lavados, agregar 4 mL de AET al 6%.

2. Mezclar bien e incubar a 37 °C durante 20 minutos.

3. Lavar los GRs 3 veces con salina y preparar una suspensión al 2-5%. Usar en el día de la preparación.

Controles Estudiar los GRs tratados con AET con anticuerpos del Sistema Kell para confirmar la desnaturalización de los antígenos Kell.

Interpretación Si la reactividad con los GRs tratados con AET es igual a la de los GRs no tratados, el anticuerpo no está dirigido hacia un antígeno del Sistema Kell. Si no es reactivo con los GRs tratados con AET, pero si lo son con GRs no tratados, el anticuerpo puede estar dirigido hacia un antígeno del Sistema Kell.

Notas

1. Los GRs tratados con AET fijan componentes del complemento en forma inespecífica en la misma forma que lo hacen los GRs en la hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). Usar reactivos anti- IgG cuando se realice una prueba antiglobulínica (PAG) con los GRs tratados con AET.

2. El antígeno Kx no es inactivado por el AET; las reacciones con anti-Kx son potenciadas con GRs tratados con AET.

3. Existen publicaciones que indican que mientras el AET también puede inactivar los antígenos JMH, Jka, Hy, McC a , Yt a , y Hy a , éstos mantienen su capacidad de absorber el anticuerpo.

Referencias

1. Advanti H, Zamor J, Judd WJ, Johnson CL, Marsh WL. Inactivation of Kell blood group system antigens by 2-aminoethylisothiouronium bromide. Br J Haematol 1982;51:107-15.

2. Widmann FK, ed. Technical manual. 9 th ed. Arlington, VA: AABB, 1985:453-4.

3. Moulds JJ, Moulds M. Inactivation of Kell blood group antigens by 2-aminoethylisothiouronium bromide (letter). Transfusion 1983;23:274.

4. Marsh WL, Johnson CL, Mueller KA. AET-treated red cells (letter). Transfusion 1983;23:275.

5. Levene C, Harel N. 2-aminoethylisothiouronium-treated RBCs and the Cartwright (Yt a ) antigen (letter). Transfusion 1984;24:541.

Método 30 Destrucción del antígeno S por el hipoclorito de sodio (Clorox®)

Principio El hipoclorito de sodio (Clorox) oxida los residuos de metionina en la posición 29 de la sialoglicoproteína Ss, produciendo la pérdida de la expresión del antígeno S.

Aplicación Este método permite la preparación de GRs negativos para el antígeno S de los GRs en estudio cuando no hay disponibles GRs genéticamente antígeno negativo.

Reactivos, materiales y equipamiento

1. Hipoclorito de sodio 0.00075%.

2. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) (ver M133).

3. Solución salina

4. Pipetas

5. Tubos de ensayo

6. Centrífuga adecuadamente calibrada

7. GRS en estudio, S+

Preparación de los reactivos

a.1 parte de Clorox + 69 partes de PBS = 0.075%, entonces

b. 1 parte de Clorox diluido + 99 partes de PBS = 0.00075%.

Procedimiento

1. Lavar los GRs 2 veces con salina.

2. Resuspender al 3% en la PBS con hipoclorito de sodio 0.00075%.

3. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.

4. Lavar los GRs 3 veces con salina.

Controles

1.

GRs tratados con reactivo anti-S.

2.

GRs tratados con el antisuero reactivo correspondiente al antígeno que está siendo probado contra el suero del paciente.

Notas

1.

La expresión de los antígenos Rh también está disminuida por este tratamiento.

2.

Enjuagar a fondo todas las superficies que han sido desinfectadas con Clorox y que pueden llegar a ponerse en contacto con los GRs.

3.

El Clorox no diluido contiene 5.25% de hipoclorito.

4.

Los autores advierten en la publicación original (ver Referencia 1) que a niveles de Clorox al 0.0005% en una suspensión al 3%, los GRs S+s+ se volvían inmediatamente no reactivos y los GRs S+s- requerían aproximadamente 1.5 veces esta concentración para destruir el antígeno S.

Referencias

1. Rygiel SA, Issitt CH, Fruitstone MJ. Destruction of the S antigen by Clorox (abstract). Transfusion

1983;23:410.

Método 31 Inhibición de los anticuerpos de grupos sanguíneos por antígenos solubles

Principio La actividad de los anticuerpos anti Le a , Le b , P 1 , I D , i, Chido (Ch), Rodgers (Rg), Sd a , y los antígenos ABH pueden ser neutralizados por sustancias que se encuentran en los fluidos humanos y animales. (ver Tabla 31-1 más abajo).

Tabla 31-1: Inhibición Específica de algunos Acs por sustancias solubles

Ac Inhibible

Suero Humano

Saliva

Leche

Orina

Quiste

Albúmina de Huevo de Paloma

 

Hidatídico

Anti-A/B/H Anti-I Anti-i Anti-Le Anti-Le Anti-P 1 /Pk Anti-Sd a Anti-Ch Anti-Rg

Anti-HLA2

Anti-

HLAB7,B17,

A28 (Bg b Bg c )

a

b

+

+++

+

O

++

+++

+

+

++

+

+++

+

+

+++

+

O

O

+++

+++

++

+++

++

O

+

++

O

++

0

Las sustancias grupo específicas (SGE) de especificidad A, B y/o H se encuentran en varios fluidos corporales de individuos que son secretores. Existen grandes cantidades en el líquido de quiste ovárico y pequeñas cantidades en el meconio y la saliva; comercialmente, la SGEA se obtiene de la mucosa gástrica porcina y la SGEB de la mucosa gástrica equina. La sustancia Le a se encuentra en grandes cantidades en las secreciones de no secretores con fenotipo Le(a+b-)] y en cantidades mayores en personas de grupo Le(a-b+) que son secretores. Las personas de este último grupo también pueden producir mucha sustancia Le b además de Le a . La goma arábiga (obtenida de la acacia) también neutralizará el anti-Le a y el anti-Le bL , pero no el anti-Le bH .

La orina y en pequeña extensión, la saliva- puede inhibir el anti-Sd a . El anti-Ch y el anti-Rg son inhibidos por el suero de individuos antígeno positivos. El líquido de quiste hidatídico (LQH) y la ovoalbúmina de los huevos de varias especies de pájaros contienen grandes cantidades de sustancia capaz de inhibir el anti-P 1 y el anti-Pk. Algunos ejemplos de anti-I también pueden ser inhibidos por el LQH. La leche humana de mujeres lactantes apropiadamente seleccionadas puede contener sustanciales cantidades de sustancia Le a , ABH e I. Auque la leche humana contiene usualmente sustancia I, no inhibe la mayoría de los ejemplos de anti-I. Dependiendo de la especificidad, el suero humano puede inhibir algunos anticuerpos HTLA.

Aplicación

La inhibición de la hemaglutinación es aplicable a:

1. Pruebas para determinar el estado secretor de ABH.

2. Pruebas para determinar el antígeno Sd a .

3. La cuantificación de la sustancia soluble en suero o secreciones.

4. Determinación de la clase de inmunoglobulina anti-A y/o anti-B. Los anticuerpos IgM son fácilmente neutralizados, mientras que los anticuerpos IgG no lo son.

5. Confirmación de la especificidad del anticuerpo o la identificación de mezclas de anticuerpos.

Reactivos, materiales y equipamiento

1.

Tubos de ensayo

2.

Solución salina

3.

Saliva [hervida y clarificada (ver M3)]

4.

Suero normal libre de anticuerpos

5.

Liquido de quiste hidatídico o ovoalbúmina (paloma)

6.

Orina (mezcla de 3 individuos, seleccionados aleatoriamente)

7.

Leche humana

8.

Anti-A, anti-B [suero de donantes no hiperinmunizados (ver M3)]

9.

Lectina anti-H de Ulex europaeus [disponible comercialmente o preparada de semillas obtenidas de semillas (M3, 98, y 99)]

10.

Salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.3 (M133)

11.

Centrífuga adecuadamente calibrada

PRUEBAS DE INHIBICION ABH

Preparación de los reactivos

Esta técnica es utilizada para la inhibición de anticuerpos ABH con saliva de secretor ABH. Saliva

1. Recolectar 2-3 mL de saliva en un tubo de ensayo.

2. Colocar el tubo en un baño de agua hirviendo por 10 minutos para inactivar las enzimas salivales.

3. Centrifugar la saliva hervida a 1000 g durante 10 minutos.

4. Remover el sobrenadante y conservar a 20 °C si la prueba no va a ser realizada inmediatamente.

Antisuero o lectinas

1. Preparar diluciones dobles de anti-H. Se pueden usar anti-A y anti-B de donantes no hiperinmunizados si está indicado.

2. Mezclar 0.1 mL de cada dilución y 0.1 mL de suspensión al 2-3% de GRs en tubos adecuadamente rotulados. Usar GRs A 2 para la titulación con anti-A. Los GRs de grupo A 2 suministran mayor sensibilidad como GRs indicadores.

3. Centrifugar durante 15-20 segundos y observar macroscópicamente en busca de aglutinación.

4. Seleccionar para la prueba la mayor dilución de cada anticuerpo que de una aglutinación de 2+.

Procedimiento Para pruebas de secreción, debe usarse la saliva de un secretor conocido (grupo A, B y O según sea lo indicado) también la de un no secretor del mismo grupo como controles positivo y negativo. Pueden congelarse alícuotas de saliva de individuos adecuados para usar posteriormente.

1. Agregar 0.1 mL del antisuero apropiadamente diluido (como se determinó en IA.4, más arriba) a cada uno de los 4 tubos rotulados “secretor”, “no secretor”, “control” y “prueba”.