Por otra parte en seguida se añade una solución 25:24:1 de fenol, cloroformo y alcohol isoamílico

para la separación de los ácidos nucleicos y las proteínas. De acuerdo a Red Biobancos (2011) la
adición de fenol y cloroformo da lugar a la aparición de 2 fases: una fase acuosa superior que
contiene los ácidos nucleicos y una fase orgánica que contiene las proteínas disueltas en el fenol y
los lípidos disueltos en el cloroformo. Para la purificación de ADN el fenol debe tener un pH≈7-8.

En esta etapa se separa el ADN de las proteínas y lípidos mediante solventes orgánicos y ciclos de
centrifugación. Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos fosfato para separarlos en
medios acuosos, mientras que las proteínas y los lípidos se separan en solventes orgánicos
(Sambrook et al. 1989). La fase acuosa y la orgánica se separan por centrifugación lo que permite
aislar al ADN. Los solventes que se usan frecuentemente son el fenol, el cloroformo y el alcohol
isoamílico (Stulnig y Amberger 1994). De acuerdo a el cloroformo se emplea para desnaturalizar
nucleasas y el alcohol isoamílico reduce la formación de espuma y facilita la formación de las fases.
Estos reactivos contaminan fácilmente el ADN, por lo que se debe evitar acarrearlos en el proceso
de purificación.

Posteriormente se precipita el ADN de la fase acuosa con isopropanol o etanol absoluto. Para ello,
se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de sodio o amonio que se unen
a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas repulsivas entre las cadenas y permite que el
ADN se pliegue sobre sí mismo haciéndolo insoluble.

En presencia de cationes monovalentes como el Na+, y a temperatura de -20°C, el etanol absoluto

o el isopropanol precipita eficientemente los ácidos nucleicos poliméricos dejando atrás ácidos
nucleicos monoméricos y de cadena corta, incluyendo los ribonucleótidos del tratamiento con
RNAsa en solución. Como menciona, el Isopropanol (CH3 CHOHCH3) es un líquido transparente,
volátil e incoloro empleado en el laboratorio químico para extraer y disolver lípidos y en histología
se usa como solubilizante de los colorantes de grasas y como agente deshidratante. El isopropanol
precipita el DNA porque compite con este por el agua, deshidratándolo y llevándolo al fondo del
tubo.

Esto permite la precipitación de un gran volumen inicial en un solo tubo de

microcentrífuga. El isopropanol es menos volátil que el etanol y tarda más en eliminarse
por evaporación. Algunas sales son menos solubles en isopropanol (en comparación con
el etanol) y se precipitarán junto con los ácidos nucleicos. Pueden ser necesarios lavados
adicionales para eliminar estas sales contaminantes.
El ADN se sedimenta después de la etapa de precipitación, se lava con etanol al 70%
para eliminar sales y pequeñas moléculas orgánicas, y se resuspende en tampón a una
concentración adecuada para la experimentación adicional. Se usan volúmenes iguales
de isopropanol y solución de ADN en la precipitación

Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN.
Clor.: elimina trazas de fenol y desnaturaliza nucleasas; Alcoh.Isoa.: reduce ,formación de espuma,
facilita fases)