UNIVERSIDAD DEL DESARROLLO PROFESIONAL

JESUS ADAN GRIJALVA MATUS

LIZA SARAI GALLARDO MONREAL

TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

ELISA Y PCR

1G
31/08/2016
 Fundamentos y Tipos de ELISAs.
El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima,
de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como
enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con
una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción
antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada
mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un
color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotómetro o un colorímetro.
Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuación:
• Anticuerpos marcados:
* ELISA Directo
* ELISA Indirecto
* ELISA sándwich
- Doble (DAS)
- Heterólogo (HADAS)
- Antígeno marcado
* Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado para
eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los
anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará
solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
ELISA INDIRECTO.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto
de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán
específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con
los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados
a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. ELISA competitivo
Pasos generales de un ELISA.
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en
el pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adición del substrato
9. Unión del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color
ELISA Sándwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de
tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno),
reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no
fijados.
• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con
una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra
problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
ELISA Sándwich “HADAS”.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de
tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno),
reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para
eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no
fijados.
• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales
reaccionan con los antígenos añadidos con la muestra problema y que se
encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no
hayan reaccionado.
• Adición de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados
en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no
hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
ELISA Competitivo.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del anticuerpo
utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antígenos desconocidos
objeto de estudio. Paralelamente, añadir únicamente antígenos del anticuerpo
usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los
antígenos que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.
Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado de ambas pruebas y
comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son análogas, el
antígeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para
tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antígeno
objeto de estudio, está relacionado serológicamente con el anticuerpo empleado
para tapizar el soporte y la diferencia de densidad óptica, es proporcional a la
concentración del antígeno problema en la muestra.
Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos:
• ELISAs para detectar antígenos: ELISAs sándwich.
• ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos.
La fase sólida debe ser de un tipo que permita un fácil manejo (especialmente en
los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unión de antígenos o anticuerpos
sobre su superficie. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350µL son
especialmente ventajosas para procesar un elevado número de muestras y una vez
tapizadas, el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que
se mantenga seco y a baja temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de
poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estériles y con o sin tapa.
Las técnicas de ELISA se realizan mediante la adición secuencial de todos los
reactivos necesarios separados por etapas de lavado. Cada una de las operaciones
puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la
automatización de todas y cada una de las etapas.
Esta completa automatización se justifica por la necesidad de procesar y analizar
un gran número de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados.
http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-protocolos.pdf
Origen de la técnica de PCR
La PCR surgió en 1971 cuando Gobind Khorana describe la técnica al explicar la
replicación de un fragmento de ADN usando dos iniciadores (Kleppe et al.1971).
Pero fue en 1983 cuando Kary Mullis y sus compañeros de la compañía californiana
Cetus Corporation la llevaron a cabo por primera vez mientras trabajaban en la
fabricación de oligonucleótidos y en el uso de iniciadores para la secuenciación de
ADN. Mullis y colaboradores usaron dos iniciadores que se alineaban con cada una
de las hebras del ADN, adicionaron ADN polimerasa I de Escherichia coli y
nucleótidos trifosfatados. Como resultado obtuvieron la replicación exponencial del
fragmento de ADN flanqueado por los iniciadores (Mullis y Faloona 1987). En un
principio, para llevar a cabo el ciclo de PCR, se calentaba la mezcla en baño María,
pero cuando llegaba a más de 90 ºC para desnaturalizar la doble hélice, el ADN
polimerasa de E. coli se inactivaba. Por este motivo, cada que se calentaba a estas
temperaturas se tenía que adicionar nueva enzima a la mezcla. El proceso original
era poco eficiente, utilizaba grandes cantidades de ADN polimerasa y necesitaba
de supervisión durante todo el proceso (Mullis y Faloona 1987).
El elemento que mejoró la técnica fue el descubrimiento del ADN polimerasas
termoestables y termoactivas (que no pierden su actividad con temperaturas altas).
En 1976 se aisló la primera polimerasa termoestable conocida como Taq
polimerasa, a partir de la bacteria Thermus aquaticus que vive en ambientes
acuáticos con temperaturas cercana a los 100 °C. Esta nueva enzima permitió la
simplificación y automatización de la PCR, sin necesidad de adicionar polimerasa
en cada uno de los ciclos (Saiki et al. 1988). La Taq polimerasa es la enzima más
utilizada en la PCR, pero presenta la desventaja de que no tiene actividad
“correctora” (actividad nucleasa 3´ →5´), por lo que existe la probabilidad de
introducir errores durante el copiado del ADN. Afortunadamente, se han encontrado
ADN polimerasas termoestables, termoactivas y de alta fidelidad (con actividad
“correctora”) provenientes de bacterias del dominio Archaea, como el ADN
polimerasa Pfu de Pyrococcus furiosus (Robb et al. 2001).
En la actualidad, para llevar a cabo la PCR, únicamente se necesita mezclar en
microtubos el ADN molde, el ADN polimerasa; los desoxirribonucleótidos adenina
(dATP), guanina (dGTP), citosina (dCTP) y timina (dTTP); una solución
amortiguadora; un co-factor de la polimerasa (regularmente se usa magnesio) y los
iniciadores. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés
Polymerase Chain Reaction) es, sin lugar a dudas, la técnica más importante y
revolucionaria en biología molecular, debido a que permite obtener in vitro millones
de copias de un fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) a partir de una sola
molécula.
La PCR se basa en la replicación celular en la que actúan varias proteínas para
sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona como molde. En
procariontes se han encontrado al menos 12 proteínas involucradas en la
replicación. Estas proteínas actúan en diferentes actividades, como:
1) La identificación del sitio de origen de la replicación.
2) El desenrollamiento de la doble hélice.
3) La estabilización de la estructura desenrollada.
4) La generación de cadenas iniciadoras complementarias con un extremo 3’ libre
que sirve de iniciador para que el ADN polimerasa comience su actividad
catalizadora.
5) El avance de la bifurcación replicadora por desenrollamiento.
6) Los pasos finales del ensamblaje de dos cadenas complementarias.
7) La identificación de los sitios de terminación.
8) El súper enrollamiento de las dos nuevas moléculas de ADN.
Sin embargo, la enzima más importante en la replicación es la polimerasa del ADN
dependiente de ADN, comúnmente conocida como ADN polimerasa, porque es la
encargada de incorporar nucleótidos durante la síntesis de las nuevas cadenas de
ADN (Bohinski 1991).
En la PCR se simula en un tubo lo que ocurre durante la replicación celular. La
síntesis de nuevas cadenas de ADN se lleva a cabo mezclando: el ADN que
contiene el o los fragmentos que se van a amplificar; la polimerasa; los iniciadores
(fragmento de ADN de 15-30 nucleótidos que flanquean la región a amplificar y que
aportan el extremo 3’ libre para que inicie la transcripción); desoxinucleótidos
(dNTPs); cloruro de magnesio (MgCl2) u otro co-factor necesario para que trabaje
la polimerasa PCR: reacción en cadena de la polimerasa 55 y una solución
amortiguadora que mantenga el pH apropiado para que se lleve a cabo la síntesis.
Esta mezcla se somete a la repetición de varios ciclos a diferentes temperaturas
(ciclo de PCR) que sustituye a la mayoría de las proteínas que actúan en la
replicación celular.
Generalmente, la PCR inicia con la desnaturalización o separación de la doble
hélice de ADN mediante el calentamiento de la muestra a una temperatura entre 94
y 96 °C para romper los puentes de hidrógeno que las unían, de esta manera cada
cadena queda como molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria
de ADN. Una vez separadas las cadenas del ADN, se alinean los iniciadores a sitios
específicos complementarios de las cadenas sencillas de la región que se va a
amplificar, para que esto suceda se baja la temperatura entre 40 y 60 °C lo que
permite la unión (alineamiento) de los iniciadores.
Finalmente, se sintetiza una nueva cadena en sentido 5’ a 3’ para lo cual se
incrementa la temperatura, por lo general a 72 °C, porque es la temperatura óptima
a la cual el ADN polimerasa se une a los iniciadores y comienza la replicación. Estas
tres etapas: 1) desnaturalización, 2) alineamiento y 3) extensión del ADN, se repiten
sucesivamente, en cada nuevo ciclo se amplifica simultáneamente la región de
interés de las dos cadenas complementarias. Los productos generados aumentan
su concentración de manera exponencial porque cada nueva copia sirve de molde
en los ciclos subsecuentes, dando origen a millones de copias del fragmento
seleccionado.
 Bibliografías

http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-ELISA-
protocolos.pdf

http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/pcr.pdf