Guia de Practicas Micro General

2019
MICROBIOLOGIA GENERAL
GUIA DE PRACTICAS
DE MICROBIOLOGIA
GENERAL
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTIN

FACULTAD DE INGENIERÍA DE PROCESOS
ESCUELA PRO FESIONAL DE INGENIERIA
DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
Mg. Mariel
MG. MARIEL Alvarez Rodríí
VERONICA guez
ALVAREZ RODRIGUEZ Paí gina 0
INDICE
CONTENIDO PAG.
 PRESENTACIÓN ………………………………….……….…………………………….....02
 RECOMENDACIONES AL ALUMNO
Normas especiales del Laboratorio de Microbiología ………………………………………. 03
Normas de Trabajo en el Laboratorio …………………………………………………………04
 PRACTICA N°01: Reconocimiento, preparación y esterilización
Del material para microbiología………………………………………...............................…. 05
 PRACTICA N°02: Observación de microorganismos:
Coloración simple y coloración compuesta …………………………………………………. 12
 PRACTICA N°03: Método microbiológico: preparación de Medios
de Cultivo …………………………………………………………………………………… 17
 PRACTICA N°04: Métodos de siembra de microorganismos ……………………………….
23
 PRACTICA N°05: Esterilización por el Método Físico:
Rayos Ultra Violeta …………………….………………………… ……………………… 28
 PRACTICA N°06: Características Culturales ……… …………………………………...
33
 PRACTICA N°07: Pruebas Bioquímicas para Enterobacterias …….. ……………...…….
40
 PRACTICA N°08: Aislamiento y Cultivo de Bacterias Lácticas …………………..………
46
 PRACTICA N°09: Aislamiento y Cultivo de Levaduras …………………………..…….. 50
 PRACTICA N°10: Microbiología del Agua ……………………………………..…….
54
 PRACTICA N°11: Microbiología de Alimentos:
Cultivo de Bacterias Aerobias Mesófilas………………….….………………………….…. 61
 PRACTICA N°12: Microbiología de Alimentos:
Cultivo de Bacterias Anaerobias ………..…………………………………….……….……. 67
 PRACTICA N°13: Microbiología de Suelos…………………………………….….……….
72
 PRACTICA N°14: Microbiología Industrial…………………………………….…………...
76
 ANEXO N°01: Manejo y uso del Microscopio ………………………………….…….……
81
 ANEXO N°02: Técnicas Básicas ……………………………………………….………….. 83
 ANEXO N°03: Preparación de Soluciones y Colorantes ….…………………………….….
85
 B IBLIOGRAFIA GENERAL …………………………………………………………….. 86
Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 1

PRESENTACIÓN
La Microbiología es una ciencia relativamente reciente, con respecto a otras

ramas de la Biología. El estudio de los microorganismos se inició a partir de
que Antonie van Leeuwenhoek, en 1670 inventó el microscopio, y que a
partir de los estudios de Luis Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo
y conocimiento de los microorganismos como actores de una gran
diversidad de procesos.
El objetivo general de las prácticas de Microbiología General, es que el

alumno se inicie en el conocimiento de la biología básica de los
microorganismos y que adquiera habilidades necesarias para su
manipulación en el laboratorio.
Ante la amplia diversidad de microorganismos existente sobre nuestro

planeta no resulta fácil comprender los fenómenos del medio ambiente que
rodea al hombre sin un conocimiento de la ciencia de la Microbiología. En
esta Guía de Prácticas, se va llevando al alumno mediante la
experimentación y la descripción de las técnicas y modelos, siempre de
forma sencilla y clara, hacia el conocimiento de las características básicas
de los seres vivos más pequeños y su significado en el medio ambiente.
Las prácticas de laboratorio cumplen un rol muy importante y se ofrecen

para motivar a los estudiantes al interés por el desarrollo de experimentos
de investigación, tratando en lo posible de promover el razonamiento en
base a la discusión y conclusión de los resultados que se obtendrán en cada
una de las prácticas y, junto con la información teórica, complementar su
formación profesional; cultivando en cada uno de ellos el juicio y criterio
necesario para el éxito en su carrera profesional como futuros Ingenieros
de Agroindustriales.

Esta Guía contiene 12 prácticas, diseñadas para que el estudiante se

familiarice gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación
de bacterias y hongos. El orden de presentación corresponde al programa
de la parte teórica del curso de Microbiología General, que forma parte del
Plan de Estudios de la carrera de Ingeniería de Industrias Alimentarias.
RECOMENDACIONES AL ALUMNO
NORMAS ESPECIALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
El laboratorio de microbiología es un lugar convenientemente habilitado

donde con las debidas precauciones se pueden manejar y examinar
microorganismos. Cuando manejamos cualquier tipo de muestra debemos
tener en cuenta la posibilidad de riesgos, estos pueden ser biológicos, del
ambiente del Laboratorio o riesgos asociados como el manejo substancias
químicas, eléctricos, fugas de gas.
Todos los microorganismos que se manipulen deben ser manejados con
precaución por su potencial patogenicidad.

Normas de Trabajo en el Laboratorio
1) Es obligatorio el uso de bata larga de algodón, destinada exclusivamente

para el Laboratorio de Microbiología. (Solo podrá retirarse para su aseo
protegiéndola en una bolsa de plástico. Se recomienda lavar
individualmente con jabón). En caso que el profesor lo indique se deberá
usar guantes y/o mascarilla.
2) Al iniciar y finalizar la práctica el estudiante lavara sus manos
escrupulosamente con agua y jabón.
3) El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Al inicio y al
finalizar cada práctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo
con alcohol de 70, solución de fenol o benzol.
4) Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el Laboratorio. Los
microorganismos deben manejarse cerca de la flama del mechero.
5) Está prohibido comer, beber, fumar y maquillarse. Cuando se manipulen
microorganismos evite hablar sin necesidad o llevarse las manos a la nariz,
boca, ojos etc.

6) Utilice los recipientes adecuados para depositar los residuos peligrosos

biológico infecciosos que se generen en la realización de la práctica. No
tirar nada en los lavabos. El material de desecho no contaminado como
papeles de envoltura depositarlos en los recipientes de basura común.
7) Cuando se utilice luz ultravioleta debe tomarse en cuenta que la
exposición a esta radiación es peligrosa.
8) En caso de contaminación bacteriología o accidentes en el Laboratorio
notificar inmediatamente al instructor o al personal técnico para tomar las
medidas higiénicas y de seguridad apropiadas, así como su registro.
9) Incubar el material el tiempo que se indique, en caso contrario este será
desechado.
10) No almacenar material en el refrigerador. Esta estrictamente prohibido
retirar del Laboratorio cultivos o cepas a menos que así lo indique el
profesor. Al finalizar la práctica entregar el material empleado debidamente
separado.
PRACTICA N°1
RECONOCIMIENTO, PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL PARA

MICROBIOLOGIA
I.- OBJETIVOS:
Dar a conocer al estudiante el materia de uso frecuente y las técnicas y equipos de

esterilización más empleados en un laboratorio de microbiología general, así como
adquirir buenas costumbres en el manejo, preparación y esterilización de dichos
materiales.
II.- REVISION BIBLIOGRAFICA
El uso de microorganismos exige cuidados especiales en el laboratorio debido a la

facilidad con que ellos pueden dispersarse y difundirse, lo cual puede provocar la
contaminación de los medios de trabajo con la consiguiente alteración del
comportamiento de los microorganismos benéficos, e incluso puede provocar la
infección del operador; es por tanto necesario conocer y practicar rigurosamente

métodos adecuados para la preparación y esterilización de los materiales en un

laboratorio de microbiología.
III MATERIALES Y EQUIPOS:
Equipos.
 Autoclave.
 Horno Pasteur.
 Incubadora para cultivos.
 Refrigerador.
 Baño maría.
 Centrífuga.
 Microscopio, Esteroscopio
 pH metro
 Balanza analítica.
 Lámparas de UV
 Jarras para anaerobios
Materiales.
 Tubos de ensayo,
 Placas de Petry.
 Matraces Erlenmeyer.
 Pipetas, probetas, embudos.
 Vasos de precipitado.
 Láminas portaobjetos y cubreobjetos.
 Luna de reloj.
 Mortero.
 Gradillas, Canastillas.
 Mecheros de Bunsen.
 Termómetro.
 Algodón, Gaza.
 Asas de Kolle.
 Espátula de Drigalsky
IV.- PROCESOS DE ESTERILIZACIÓN.
Consiste en preparar los materiales y medios de cultivo, y posteriormente eliminar

totalmente los microorganismos presentes, para dejarlos en condiciones optimas de
uso.
Existen muchas formas de esterilización, entre ellas tenemos:

Esterilización por calor seco:

 Flameo o Llama Directa: consiste en poner a los materiales a esterilizar (asas, y
agujas de kolle, espátulas , pinzas tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero
para eliminar rápidamente los microorganismos del entorno.
 Aire Caliente: Para ello se utiliza una estufa bacteriológica u horno Pasteur; en ella
se esteriliza el material a temperaturas de 170°C-180°C por 2 horas.
Esterilización por calor Húmedo:

 Por Ebullición: Se coloca el material a esterilizar en agua hirviente (100°C) por 15 a
35 minutos.
 Vapor de Agua sin Presión (Tindalización): Se coloca el material a esterilizar a la
acción del vapor de agua y a temperaturas no mayor de 100°C; para ello se puede
hacer uso del autoclave con la espita abierta.
 Vapor de Agua con Presión: en el autoclave a 121°C, 15 lbs de presión durante 20
minutos.
Esterilización por Filtración:

Se usan membranas y filtros diversos y son útiles para líquidos termolábiles.
Esterilización por Radiaciones:

 Radiaciones Ionizantes: Rayos Gamma y Rayos Catódicos.
 Radiaciones No Ionizantes: Luz Ultravioleta.
Esterilización por Agentes Esterilizantes Químicos:

Se pueden usar ácidos o bases en soluciones concentradas, así como sales,
halógenos y alcohol.
IV.- METODOLOGÍA.
Cada estudiante preparará el siguiente material de vidrio:

 Tubos de ensayo:
1. Colocar a cada tubo una tapa plástica o de metal o una torunda de algodón
siguiendo las instrucciones dadas por el profesor.
2. Colocar los tubos preparados en una cesta destinada para tal fin.
3. Cubrir la cesta con papel Craft y sujetar el mismo con pabilo.
 Balón, Fiola o Matraces Erlenmeyer.

1. Colocar un tapón o una torunda de algodón siguiendo las instrucciones dadas por
el profesor.
2. Cubrir el algodón con una porción de papel Craft y sujetar el mismo con pabilo.
NOTA: Cuando se utiliza algodón para cubrir tubos, fiolas o balones se debe tomar la
precaución de que éste pueda ser manipulado con facilidad, para ello no debe quedar

ni muy apretado ni muy flojo y debe alcanzar aproximadamente 3 cm. Dentro del
material de vidrio.
 Pipetas:
1. Colocar un pequeño trozo de algodón en el extremo superior de la pipeta
2. Envolver completamente con papel Craft, siguiendo las instrucciones dadas por el
profesor.
 Placa de Petri:
a) Envolver con papel Craft siguiendo las indicaciones del profesor.
NOTA:
Las pipetas, así como las placas de Petri, se pueden envolver individualmente de la
manera indicada, o se pueden colocar en grupos, en recipientes metálicos
especialmente diseñados para tal fin, denominados pipeteros y plaqueros
respectivamente.
Una vez preparado todo el material de vidrio:
Esterilizar siguiendo las instrucciones sañaladas:

 Pipetas, Placas Petri, Matraces, Tubos, Fiolas y rascos: Calor seco a 180°C por 20
minutos.
 Bujías filtrantes: Se someten a ebullición en hervidores metálicos o bien se
desinfectan por medios químicos.
 Medios de cultivo: Se esterilizan con calor húmedo a 120°C por 20 a 30 minutos y 15
libras de presión.
Una vez que el material ha sido sometido al proceso de esterilización se pueden

realizar ensayos muy sencillos para verificar su esterilidad. Generalmente estos
ensayos consisten en colocar una muestra del material esterilizado en contacto con
un medio de cultivo estéril, el cual, después de ser incubado a 35°C±2°C x 24 – 48
horas, se observa para determinar si hay o no evidencia de crecimiento microbiano.
V.- RESULTADOS
Dibujar los equipos y materiales observados en su laboratorio de microbiología y

anotar otras observaciones.
VI.- CUESTIONARIO:
1) Describa los usos y ventajas de las láminas de Petrifilm.

2) Describa el funcionamiento de un autoclave de laboratorio.

3) Mencione las sustancias químicas usadas en un laboratorio de microbiología, con

fines de esterilización.
4) Dibuje y explique el funcionamiento de las pipetas automáticas de uso
microbiológico.



PRACTICA N°2
OBSERVACIONES DE MICROORGANISMOS: COLORACION SIMPLE Y

COLORACIÓN COMPUESTA.
I.- OBJETIVOS:
 Observar las diferentes formas, tamaños y agrupaciones que presentan los
microorganismos aplicando azul de metileno.
 Observar el distinto comportamiento químico de la célula bacteriana frente a los
colorantes cristal violeta y zafranina; que las clasifica en Gram (+) y Gram (-).
II.-REVISION BIBLIOGRAFICA
La tinción en los microorganismos es una técnica sencilla y directa que nos permite
contrastar y diferenciar los microorganismos (bacterias, hongos, levaduras etc.).
Debido a que las bacterias son incoloras y no tienen suficiente contraste con el agua o
medios solidos es necesario teñir su pared para poder observar su forma y sus
estructuras internas (capsulas, flagelos, esporas)

Los métodos de tinción en microbiología más usados son:
Métodos de Tinción Simple.

Usados para comprobar presencia de microorganismos, utiliza colorantes básicos.
(Azul de metileno al 1%,)
Métodos de Tinción Diferencial.

Se utiliza para distinguir tipos de microorganismos debido a que estos difieren
químicamente entre sí, reaccionando por ello de manera distinta frente a un
determinado procedimiento de tinción, como es el caso de la Tinción Gram, muy
empleada en bacteriología, separa las bacterias en dos grupos: Gram positivas (+) y
Gram negativas (-).
III.- MATERIALES Y EQUIPOS:

 Láminas fijadas de microorganismos
 Aceite de inmersión
 Azul de metileno
 Cristal violeta
 Lugol.
 Zafranina.
 Alcohol cetona.
 Mechero Bunsen
 Pizeta de agua
 Asa de Kholle.
 Microscopio
IV.- METODOLOGÍA.
a) Coloración Simple.
 Realizar un frotis delgado en las láminas porta objetos.
 Fijar la muestra a la llama del mechero suavemente y colocar sobre el soporte para
tinción.
 Agregar 5 o 6 gotas de azul de metileno (1%) o carbolfucsina. con la finalidad de
cubrir la muestra fijada, dejar que actúe por 3-5 minutos
 Lavar cada lámina con agua (chorro suave).
 Dejar secar las láminas al aire.
 Examine las preparaciones teñidas, con el objetivo de inmersión (100-150x) de un
microscopio compuesto.
b) Coloración Diferencial.
 Realizar un frotis delgado en las láminas porta objetos.

 Fijar la muestra a la llama del mechero suavemente y colocar sobre el soporte para
tinción.
 Cubrir el frotis con cristal violeta, dejar actuar 3-5 min. Luego lavar con un chorro
suave de agua.
 Cubrir con gotas de lugol, dejar actuar durante 3-5 min., lavar con un chorro suave
de agua.
 Decolorar con alcohol cetona 1-5 segundos, lavar con un chorro suave de agua.
 Aplicar Zafranina como colorante dejar actuar 3-5 min., lavar y secar al aire.
 Colocar una gota de aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de
inmersión (100X).
V.- RESULTADOS
Dibujar y rotular los microorganismos observados con la coloración de azul de

metileno y la coloración de Gram
CUESTIONARIO:
1. Cuáles son las diferencias entre un microscopio óptico y un microscopio electrónico?

2. Describa la coloración de Loeffler
3. Describa la coloración para los microorganismos que presentan esporas.
4. Mencione los métodos convencionales para observar las levaduras y hongos con
micelio.
5. Qué importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes
empleados?
6. Cuáles son los errores más comunes que se cometen en los métodos de tinción?



PRACTICA N°3
METODO MICROBILOGICO: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.
I.- OBJETIVO:
Preparar y esterilizar medios de cultivo de diferentes características para el cultivo de
microorganismos.

Los medios de cultivo son preparaciones estériles de sustancias nutritivas necesarias
para el desarrollo y crecimiento de los microorganismos.
Estas sustancias nutritivas pueden ser liquidas o sólidas, similares a los sustratos
naturales, en los cuales estos crecen normalmente.
Un medio de cultivo incluye agua, nutrientes como fuente de nitrógeno (sal de
amonio), fuente de carbono (azúcar), vitaminas y otros como restos de levadura. Se

consideran además necesidades de oxigeno (aerobios), bióxido de carbono parcial o

total (microaerofilas y anaerobias), condiciones de pH y temperatura de incubación.
En los primeros tiempos de la Bacteriología sólo se conocía como sustancia

gelificante incorporable a los medios la gelatina. Sin embargo, presenta muchos
inconvenientes, ya que funde a 25 oC (por encima de esta temperatura el medio se
licua), y además, muchas bacterias presentan gelatinazas que hidrolizan la gelatina.
El gelificante más usado es el agar-agar, extraído de algas rojas (Gelidium), del cual
existen versiones más o menos purificadas (las más puras están más enriquecidas en
el polisacárido agarosa; son las que se emplean para los medios definidos, con objeto
de evitar la introducción de sustancias "contaminantes" inadvertidas que falseen las
interpretaciones sobre el comportamiento nutricional de la bacteria).
El agar presenta la gran ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de
los 100oC, lo que permite su uso para la inmensa mayoría de bacterias, que son
mesófilas.
Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioautotrofos) se suele recurrir a un
gelificante inorgánico, el silicagel o gel de sílice.
Los medios de cultivo se utilizan con los siguientes fines:
 Aislamiento de microorganismos a partir de productos naturales en microbiología
especial.
 Conservación de cepas.
 Identificación y tipificación de microorganismos según la forma de crecimiento y
características de las colonias.
 Clasificación y tipificación de microorganismos mediante la observación y estudios
de sus propiedades biológicas.
Los medios de cultivo se clasifican de la siguiente manera:
a) Según su naturaleza:
 De origen animal
 De origen vegetal
 De origen mineral
b) Los medios comunes: permiten el crecimiento indiscriminado de todo tipo de

microorganismos
 Líquidos: Caldo simple, suero de leche.
 Sólidos: agar-agar, gelatina, albúmina, papa, caña de azúcar.
c) Los medios especiales: se preparan teniendo en cuenta sus exigencias

nutricionales diversas, características bioquímicas determinadas y estos pueden ser:

 Medios enriquecidos o mejorados: se les agrega determinadas sustancias nutritivas

(sangre, yema de huevo, suero) que favorecen a un grupo de microorganismos
inhibiendo a otros. Ejm. Agar sangre, agar suero, caldo selenito.
 Medio selectivo: Se caracteriza por que se incluye sustancias que favorecen el
crecimiento de determinadas especies, favorece a una sola cepa pura, todos ellos
son medios sólidos. Ejm. Agar bismuto sulfito, EMB, MC, SS.
d) Los medios sintéticos:

 Simples: contienen carbono como fuente de energía (glucosa o
lactosa)
 Complejos: Para el desarrollo de microorganismos exigentes, se les
incorpora AA, purinas, pirimidinas. Ejm. LMA.
 Diferenciales: Sirven para determinar reacciones bioquímicas,
diferenciando a los grupos de géneros o especies microbianas. Ejm. TSI, LIA.
III.- MATERIALES Y EQUIPOS.
 Medios de cultivo o ingredientes deshidratados.

 Agua destilada.
 Algodón, gasa.
 Balanza.
 Erlenmeyer de 250 y 500 mL.
 Espátulas.
 Lápiz marcador de vidrio.
 Papel aluminio y papel corriente.
 Pipetas graduadas.
 Probetas de 100 mL.
 Tubos de ensayo.
IV.- METODOLOGÍA.
Agua de peptona al 0,1 %

 Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente el medio.
 Coloque el polvo en un erlenmeyer de 250 mL. limpio y seco y agregue
cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta.
 Mezcle la preparación con movimientos giratorios hasta la completa disolución.
 Elabore tapones de algodón para los tubos.
 Distribuya el medio líquido con una pipeta graduada a razón de 9 mL. en cada tubo.
 Coloque en los tubos los tapones de algodón, evitando que queden flojos o muy
compactos.

 Disponga los tubos en una canastilla de metal resistente al calor, envuélvalos con
papel, identifíquelos con el nombre del medio, la fecha de preparación.
 Esterilizar los tubos en autoclave a 121°C ,15 lb. de presión, durante 20 minutos.
Plate count agar

 Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente el medio.
 Coloque el polvo en un erlenmeyer de 250 mL. limpio y seco y agregue
cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta.
 Mezcle la preparación con movimientos giratorios hasta la completa disolución.
 Colocar en una cocinilla hasta disolver el medio.
 Disponga el erlenmeyer en una canastilla de metal resistente al calor, envuélvalos con
papel, identifíquelos con el nombre del medio, la fecha de preparación.
 Esterilizar los tubos en autoclave a 121°C ,15 lb. de presión, durante 20 minutos.
 Colocar de 15 a 20 mL. del medio a cada placa de Petri previamente esterilizadas.
 Dejar enfriar, luego guardar en refregiración en posición invertida hasta el momento
de su uso.
En el caso de colocar el medio con agar en tubos, después de fundir el medio se

colocara a cada tubo de 10 a 15 mL. , luego se esteriliza en autoclave. Dejar enfriar en
posición horizontal o inclinada.
Es conveniente observar los frascos de los distintos medio deshidratados, porque no
todos los medios deben ser llevados al autoclave.
V.- RESULTADOS
Dibujar el método utilizado en la práctica.
VI.- CUESTIONARIO
1. Mencione y explique porque algunos medios de cultivo no deben ser esterilizados
en el autoclave.
2. Que función cumple los medios que contienen colorantes.
3. Cómo se realiza la eliminación de material contaminado en laboratorios de
microbiología?
4. Mencione 10 medios (líquidos y sólidos) usados en su especialidad.
5. Por qué es necesario ajustar el pH en algunos medios de cultivo?



PRÁCTICA Nº 4
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
I.-OBJETIVO:
Conocer técnicas de siembra y manipulación de microorganismos
II.- REVISIÓN BIBLIOGRAFICA

La siembra o inoculación es la operación que consiste en depositar un germen
asépticamente en un medio de cultivo. Es decir, la introducción de células microbianas
en un medio nutriente estéril, Si el microorganismo de este primer, medio sembrado
se pasa a sucesivos medios de cultivo, la operación se llama resiembra o repique

Los microorganismos se pueden cultivar en medio industriales y en laboratorio. En

laboratorio los microorganismos se cultivan en medios nutrientes sólidos o líquidos,
que se pueden encontrar en tubos, Erlenmeyer, o Placas Petry.
Tipos de siembra
a) Siembra en tubos con medio sólido en plano inclinado, o recto.- Se usan tubos de
ensayo con medio previamente enfriados en posición inclinada o recta, y se procede a
extender la siembra por toda la superficie del medio. Esto se puede hacer de varias
formas. Siembra por estrías, siembra en línea recta, o siembra a profundidad o,
punción.
b) Siembra en placas.- Cuando se necesita una gran superficie de medio. La siembra
en placas se puede hacer, por estrías, por diseminación o agotamiento.
c) Siembra en caldo o medios líquidos. Se hace cuando se desea transferir
microorganismos a un medio líquido, el microorganismo se puede transferir con asas
o con pipetas estériles.
Cualquiera que sea el tipo de siembra a realizar debe cumplirse los siguientes
requisitos:
 Se debe trabajar en un cuarto de siembra o cámaras.
 Los materiales de trabajo deben estar cerca de la persona y al mechero.
 El mechero debe permanecer encendido, pues, alrededor de la llama se crea una
zona de esterilidad, que es donde debemos efectuar la manipulación.
 No hablar durante la siembra, ya que se puede contaminar el cultivo.
 Esterilizar la mesa de zona de trabajo, con alcohol, hipoclorito de sodio al 0.3%, o por
flameado.
III.-EQUIPOS Y MATERIALES.
 Mechero
 Estufa de cultivo
 Asas de kholle
 Placas de Petry con medio estéril.
 Tubos con caldo nutritivo.
 Alcohol, algodón, lápiz cristalográfico
IV.- METODOLOGIA
Siembra en medios líquidos.

- Se flamea el asa y con la mano izquierda se coge el tubo con medio líquido, se le
quita el tapón y se flamea, la boquilla.
- Se introduce la muestra en el tubo que contiene el medio líquido.
- Se coloca el tubo en posición vertical entre las manos imprimiéndole un ligero
movimiento como de rotación.
- Se incuba.

Siembra en placas con medio sólido (Siembra por estrías)

- Se toma la muestra con el asa de kholle.
- El inóculo se extiende sobre una pequeña zona de la placa
- Se esteriliza el asa, y se repite la operación dos veces mas, procurando no tocar las
anteriores estrías.
V.- RESULTADOS
Dibujar los métodos de siembra en placa de Petri, tubos, e indicar para que casos se
usa cada uno de ellos.
VI.- CUESTIONARIO
1- Cuáles son los métodos de siembra de microorganismos más usados en su

especialidad?
2.- Cuales son los métodos más usados para aislar un microorganismos de un cultivo
axenico ?
3.- En que consiste una cabina de flujo laminar para siembra de microorganismos?
4.- Mencione los métodos rápidos para identificar y cultivar microorganismos en
diferentes plantas industriales (agua, suelo, alimentos,)
5.- Describa el método de siembra de microorganismos por incorporación.



PRÁCTICA Nº 5
ESTERILIZACIÓN POR EL METODO FISICO: Rayos Ultra Violeta
I.- OBJETIVO
Estudiar el efecto de la luz ultravioleta sobre las bacterias y saber aplicar esta
radiación como forma de control del crecimiento bacteriano.

Algunas radiaciones electromagnéticas son capaces de producir un efecto
letal sobre las células por lo que pueden ser utilizadas como medidas de
control microbiológico. Entre otras se incluyen aquellas con una longitud de
onda por debajo de 300 nm como son: la luz ultravioleta, los rayos gamma

y los rayos X. Las radiaciones con una longitud de onda mayor no tienen
suficiente energía para destruir las células.
La luz ultravioleta es capaz de producir un efecto letal cuando se irradian
las células con un rango comprendido entre 210-300 nm. Los componentes
celulares capaces de absorber la luz UV son los ácidos nucleicos con el DNA
como diana más importante. Dentro de sus componentes son las
pirimidinas las que absorben especialmente la luz UV, resultando como
efecto a esta acción, la formación de dímeros de timina (unión covalente de
dos moléculas adyacentes de timina). La formación de estos dímeros
distorsiona la configuración de la molécula de DNA y esto interfiere con la
replicación y transcripción del DNA durante la síntesis de las proteínas.
El efecto bactericida puede verse influido por:
 Densidad de la suspensión bacteriana (+ densidad, menor efecto).
 Naturaleza del medio donde se encuentra (soluciones acuosas son mas
penetrables frente a medios mas complejos).
 Tipo y estado fisiológico de la célula (Cepa, especie, y fase de
crecimiento).
Algunos microorganismos poseen sistemas enzimáticos de reparación del

daño inducido por radiaciones. Existen dos mecanismos de acción:
 la reparación a oscuras o en ausencia de luz (Respuesta SOS).
 la reparación con luz: que se induce al iluminar las células. irradiadas con
luz visible a una longitud de onda entre 420 y 540 nm.
La radiación UV debido a su baja penetrabilidad no puede ser usada como

un medio de esterilización por lo que su aplicación se limita a su uso en
superficies y para la desinfección del aire, fundamentalmente en centros
sanitarios e industrias alimentarías.

 Cultivo de 24 horas en caldo nutritivo de Serratia marcescens
 Placas de Agar nutritivo
 Torunda de algodón estéril o asa de platino.
 Lámpara de luz UV
IV.-METODOLOGIA
1. Tomar el tubo que contiene el cultivo de 24 horas del microorganismo.

2. Inocular completamente y de modo uniforme sobre la superficie del agar

de cada una de las placas Petri usando la torunda de algodón humedecida
con el cultivo líquido o la espátula de drigalsky.
3. Rotular una de las placas como control. No recibirá ningún tratamiento.
4. Exponer las placas restantes a la luz UV, durante 10 seg, 30 seg, 1
minuto y 2 minutos.
1. Incubar todas las placas a 28ºC durante 24-48 horas.
RECORDARLES QUE RETIREN LA TAPA DE LA PLACA PETRI DURANTE LA

EXPOSICIÓN
V.- RESULTADOS
Anotar las variaciones que se producen en el crecimiento de los cultivos, según el

tiempo de exposición a la fuente de luz UV.
VI.- CUESTIONARIO
1. Qué otras aplicaciones tienen los Rayos U.V..en la Industria de Alimentos?

2. Cuáles son las ventajas, desventajas de la esterilización por rayos U.V.?
3. Qué riesgos implica el empleo de las radiaciones U.V.?
4. Qué medidas de prevención se deben tener en cuenta al emplear lámparas
U.V.?
5. Qué tipos de radiaciones se emplean en la Industria de Alimentos además de
los rayos U.V.?



PRÁCTICA Nº 6
CARACTERISTICAS CULTURALES
I.- OBJETIVOS
Reconocer y familiarizarse con las formas y caracteres que presenta un
microorganismo cuando se desarrolla en los medios de cultivo preparados en
laboratorio

La gran mayoría de los microorganismos pueden identificarse observando su

crecimiento en el medio o sus formas en los diferentes medios de cultivo.
En un medio líquido los microorganismos, crecen y se manifiestan cuando el medio se
torna turbio, decoloración (cuando este contiene un colorante de contraste); o con un
reactivo (Kovacs) formando un anillo en la superficie.
En los medios sólidos el crecimiento de las colonias, nos denotará características
culturales tales como: forma, borde, elevación, superficie, consistencia, opacidad,
color, tamaño y hemólisis. Estas características varían de acuerdo en el medio en que
se encuentra a pesar de tratarse de una misma especie microbiana.
Para determinar las características de desarrollo de un cultivo puro es costumbre
observar los siguientes aspectos del cultivo:
 Tipo de colonias en agar (cultivo en placa)

 Desarrollo en agar inclinado.
 Desarrollo en caldo
 Desarrollo en gelatina por picadura.

 Esteroscopio
 Microscopio
 Medio de cultivo (de la práctica anterior)
 Bacteria de Gram
 Asa de Kholle
 Mechero
IV.-METODOLOGIA
Observar los tubos y placas sembrados de la práctica anterior y anotar:

CRECIMIENTO DE COLONIAS EN PLACA DE AGAR
Tamaño Muy pequeña (punta de alfiler), hasta colonias muy grandes.
Margen o borde Entero, ondulado, lobulado, crenado, filamentoso, enrollado.
Forma de crecimiento Puntiforme, circular, filamentosos, amiboideo, rizoide, fusiforme.
Elevación Plana, elevada, convexa, pulvinada, embonada.
Pigmentación Coloración de cultivo.
CRECIMIENTO EN ESTRIAS SOBRE AGAR INCLINADO

Cantidad Escasa, moderada, abundante.
Distribución de la Uniforme o irregular.
superficie

Forma de crecimiento Filiforme, equinulada, perlada, difusa, arborescente, rizoide.

Consistencia del Butirosos, viscosos, fibroso.
crecimiento
CRECIMIENTO EN AGAR VERTICAL POR PICADURA PROFUNDA

Forma de crecimiento Filiforme, perlada, papilar, vellosa, arborescente.
Crecimiento Limitado a la línea de inoculación o picadura con prolongación
fuera de la línea de inoculación. Superficial o en profundidad o
ambas a la vez.
CRECIMIENTO CALDO NUTRITIVO

Distribución en medio Uniforme o irregular.
Forma de crecimiento Floculenta, anillada, peliculada, membranosa..
Apariencia o tipo Turbidéz, aparición de opacidad en el medio.
Sedimento, depósito de células en el fondo del tubo, si el tubo
se agita, el sedimento se resuspende en el caldo.
Formación de película, masa de células en la superficie del
caldo.
Mucosidad: depósito de células que permanecen adheridas y
no disgregan aún si el tubo se agita.
CARACTERISTICAS DE LOS CULTIVOS DE BACTERIAS
COLONIAS

ESTRIA EN AGAR – FORMA DE CRECIMIENTO
PICADURA EN GELATINA
CALDO DE NUTRIENTES – SUPERFICIE DE CRECIMIENTO
V.-
RESULTADOS
Observar las placas con gérmenes y anotar sus características culturales de las
colonias formadas

 Forma:
 Borde:
 Elevación:
 Superficie:
 Consistencia:
 Opacidad:
 Color:
 Tamaño:
VI.- CUESTIONARIO
1) En qué y por qué algunos microorganismos desarrollan una característica de
crecimiento en forma de película?
2) Cuándo se utiliza tubos de agar inclinado para el estudio de las características
bioquímicas porque es preferible inocular con aguja de kholle y no con asa?
3) Como reconocería un cultivo puro, joven, injuriado y envejecido?
4) Qué factores influenciarán en la abundancia de crecimiento en caldo, agar inclinado
y agar vertical?
5) Cuáles son las ventajas y desventajas de usar medios de cultivo líquidos y sólidos?



PRÁCTICA Nº 7
PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA ENTEROBACTERIAS
I.- OBJETIVOS
Conocer las manifestaciones de los microorganismos al realizar pruebas bioquímicas.

Las colonias sospechosas de E. coli, Salmonella, Shiguella, etc. que se encuentran en
placas de siembra directa (VRBA, EMB, XLD) serán transferidas en su oportunidad a
los medios de diferenciación bioquímica primaria. Las pruebas son numerosas. En los
laboratorios hospitalarios no se justifica el empleo de muchas pruebas bioquímicas,
puede utilizarse el uso de medios como: el TSI (triple azúcar fierro), LIA (agar Lisina
fierro) y el indol; para el caso de un laboratorio de microbiología de alimentos se usan

el INVIC (indol, rojo de metilo, Voges Proskauer y citrato de Simons); para confirmar la
presencia de E. coli. Otras pruebas que superan los 50 deben ser hechas a otros
niveles, tales como, en un laboratorio de Referencia.
TSI.- Este medio está compuesto por tres azúcares que son: la glucosa, lactosa y
sacarosa.
El fierro es el indicador para poner en evidencia, la producción de sulfuro de
hidrógeno (H2S).
El color original de este medio es rojo ladrillo (pH 7.4).
 La producción de sulfuro de hidrógeno (H 2S) se manifiesta por el color negro en el
medio. Se simboliza de acuerdo a su intensidad de 1+ a 4+.
 La presencia de gas se manifiesta por el resquebrajamiento del medio. Se simboliza
según su intensidad de 1+ a 4+.
 La acidez se pone de manifiesto por su cambio de color amarillo y se simbolizará
con la letra A.
 La alcalinidad en este medio se manifiesta por su cambio al color grosella y se
simboliza con la letra K.
 El ataque de glucosa se manifiesta por la alcalinidad en la parte inclinada (K) y
acidez en el fondo (A). Se simboliza K/A.
 El ataque de la lactosa y/o sacarosa se manifiesta por el cambio total o medio al
color amarillo. Se simbolizará A/A.
LIA.-Puede utilizar la lisina, del medio LIA, por los mecanismos de descarboxilación,
desaminación, o bien ser negativos frente a este aminoácido. Para diferenciar estas
reacciones el medio tiene en su composición glucosa y el indicador azul de
bromocresol.
El color original del medio es ligeramente azulado (pH 6.7)
La descarboxilación de la lisina produce alcalinidad en todo el medio, por lo tanto el

color azulado se intensifica. Se simboliza K/K. Este tipo de reacción se considera
como LISINA POSITIVA.
La desaminación empieza en la parte inclinada, variando esta porción al color rojo

ladrillo. El fondo del medio se tornará amarillo. Esta reacción se interpreta por motivos
prácticos como LISINA NEGATIVA. Se simbolizará R/A.
En los casos en que no se produce ninguna de las dos reacciones descarboxilación o
desaminación, el medio LIA se observará azulado en la parte inclinada y amarillo en el
fondo por fermentación de la glucosa. Esta reacción se simboliza K/A., a veces el
medio puede presentarse amarillo en su totalidad, simbolizándose A/A. Estas dos
lecturas así simbolizadas se interpretarán, como LISINA NEGATIVA de tal manera que
la reacción negativa a la lisina se simbolizará: R/A; K/A o A/A.

La reacción del indol se interpretará como positiva por la aparición del color rosado en
la tira del papel filtro, colocado en la boca del tubo. El símbolo positivo (+) o negativo
(-) correspondiente a la lectura del indol, se simbolizará en la reacción en LIA.
En los casos en los que el color del medio LIA no haya variado sustancialmente a
pesar del crecimiento bacteriano, se representará N/N.
Esto se puede presentar por que la acidez producto del ataque a glucosa, se
neutraliza por la alcalinidad producida por la descarboxilación, o bien, por que el
germen ha sido incapaz de utilizar la glucosa. En este último caso, el germen
mostrará un TSI igualmente N/N y por lo tanto, no corresponderá a
ENTEROBACTERIACEAE.
Prueba de Indol.- Se investiga después de incubar a 37˚C por 24 horas, el indol

formado en caldo peptonado o triptonado, agregando gotitas del reactivo de Kovacs,
agitar por unos minutos.
La reacción es (+) si se forma un anillo constante, coloreado de rojo claro u oscuro.
Reacción (-): no se forma el anillo
Prueba del Rojo de Metilo.- después de haber incubado a 37˚C por 72 horas,
adicionar 5 gotas de una solución al 0,04% de rojo de metilo
Reacción (+): si se presenta coloración roja.
Reacción (-): aparición de color amarillo.
Prueba de Voges - Proskauer.- Se incuba el medio sembrado a 37˚C por 72 horas,

luego se adiciona 05mL. de una solución de KOH al 40%; agitar vigorosamente
durante 3 minutos, observar la coloración luego de 10 minutos.
Reacción (+): si se presenta coloración rojo carmín.
Reacción (-) : no hay aparición de color.
Asimilación de Citrato.- Luego de sembrar el inóculo por estría superficial en agar

inclinado, se incuba a 37˚C por 48 horas observar la coloración.
Reacción (+): viraje del medio de cultivo del verde al azul intenso.
Reacción (-): no hay viraje.
Luego del triple número obtenido (confirmado según resultados del IMViC), se logra el
valor de la Tabla del NMP, para después calcular la población de Escherichia coli, en
la muestra problema de manera similar a los anteriores.
 Medio TSI, LIA e INDOL

 Reactivo de Kovacs.
 Incubadora bacteriológica.

 Medio de cultivo con colonias de microorganismos (de la práctica anterior)

 Aguja de Kolle
 Mechero
IV.- METODOLOGIA
De las placas sembradas de la práctica anterior sembrar con aguja de Kolle por
punción profunda a los tubos que contienen el medio TSI y LIA, también transferir una
pequeña carga microbiana al tubo que contiene el indol, esto debe ser de la misma
colonia, llevar a incubar por 24 horas.
V.- RESULTADOS
Realizar la lectura según el tests bioquímico para la diferenciación de enterobacterias.

Dibujar y colorear.
Realizar las lecturas y comparar los resultados con la tabla de Reacciones
Bioquímicas de Enterobactereceae en TSI - LIA
VI.- CUESTIONARIO
1) Cuál es el fundamento bioquímico de la prueba del TSI, LIA e Indol?

2) Cuál es la composición de los medios usados en el INVIC y cómo reaccionan frente
al microorganismo?
3) Describa métodos modernos de pruebas bioquímicas para análisis de alimentos.
4) Que reactivos se pueden emplear en la prueba de Indol?,.Esquematice los
resultados de interpretación.
TABLA
REACCIONES BIOQUIMICAS DE ENTEROBACTERIACEAE EN TSI – LIA
GRUPO I HIDROGENO SULFURADOS (H2S) POSITIVOS GRUPO II HIDROGENO SULFURADOS (H2S) NEGATIVOS
ANAEROGENICOS (GAS NEGATIVO) ANAEROGENICOS (GAS NEGATIVO)
TSI GAS H2S LIA INDOL ENTEROBACTERIA TSI GAS H2S LIA INDOL ENTEROBACTERIA
K/A _ ± ó + K/K _ Salmonella Typhi K/A _ _ K/A -- ó + Shigella
AEROGENICOS (GAS POSITIVO) A/A ó K/A _ _ K/K ó K/N + Escherichia
TSI GAS H2S LIA INDOL ENTEROBACTERIA A/A ó K/A _ _ K/A -- ó + Enterobacter
K/A 2+ _ 4+ K/K _ Salmonella A/A _ _ K/K -- Serratia
K/A ó A/A 2+ _ 4+ K/K _ Arizona K/A _ _ R/A + Proteus
K/A ó A/A 2+ _ 4+ K/A _ Citrobacter K/A _ _ R/A + Providencia
K/A ó A/A 2+ 4+ R/A _ Proteus A/A _ _ A/A ó K/A -- ó + Yersinia

K/A 2+ 4+ K/K _ Edwardsiella AEROGENICOS (GAS POSITIVO)

TSI GAS H2S LIA INDOL ENTEROBACTERIA
A/A ó K/A 2+ _ K/K ó K/A + Escherichia
K = alcalino
A/A 4+ _ K/K -- ó + Klebsiella
A = ácido A/A ó K/A 3+ _ K/K ó K/A -- Enterobacter
R = rojo K/A ó A/A 2+ _ K/K -- Serratia
K/A (+) _ K/A ó R/A + Proteus
N = neutro K/A + _ K/A ó A/A -- Paratyphi A


PRACTICA Nº 8
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE BACTERIAS LACTICAS
I.- OBJETIVOS
Conocer los medios utilizados para cultivar las bacterias lácticas
Aislar bacterias lácticas.

Las bacterias lácticas tienen la capacidad de fermentar los glúcidos produciendo ácido
láctico Son homofermentativas (ac. láctico), y heretofermentativas (ac. láctico, ac.
acético, etanol CO2). Gram positivas, inmóviles, no esporulan, catalasa negativa,
oxidasa negativa, reductasa negativa. Son anaerobios facultativos, microaerofilos,
únicamente fermentan en aerobiosis o anaerobiosis.
Streptococcus lácticos: su reservorio natural es la leche, vegetales, y del rumen (10 4
ce/g), se pueden aislar utilizando los medios MRS (DE MAN y col; 1960), el medio
M17 (TERZAGHI y SANDINE, 1775), que tiene un pH de 7,15; aquí el crecimiento es
rápido y las colonias son de gran tamaño.

Streptococcus thermophylus, se aísla de leche calentada a 45-50ºC o leche

pasteurizada, yogurt. Se puede utilizar el medio M17 a un pH de 6,8; también el medio
TPPY de BRACQUART con ericromo como colorante.
Genero leuconoctoc: Son coco o en cadenas, es heterofermentativos, producen D
(-) láctico, etanol, CO2 El medio mas utilizado es el MRS, pero puede utilizarse el
medio KCA (NICKEL Y LEESMENT) con citrato de calcio se mejora con la adición de
Mn 2+ (10 mM).
Genero lactobacillus: Se aíslan del queso, kefir, choucroute, ensilados, carnes
frescas o fermentadas y del intestino humano. El más utilizado es el MRS con acetato,
citrato y Tween 80 como fuente de oleato; su pH esta ajustado a 6,5; pero con
frecuencia se utiliza a 5,5 para seleccionar mejor este grupo.
Para aislar L. acidophilus intestinal se utiliza el medio Rogosa, con la adición de una
sal biliar como el oxgall (bilis de ternero deshidratado) al 5%
El medio MRS con 0,2% de oxgall al 0,2% se obtiene un mejor crecimiento de L.
acidophilus.
Pediococcus: Se desarrollan en el medio MRS con un pH de 6,2 o en presencia de
ácido sórbico o acetato de talio, no son selectivos. Otro medio es el ATP o medio
Elliker. Estas bacterias pueden liofilizarse o mejor congelarse en presencia de
diversos crioprotectores.
Bifidobacterium. B. longun se desarrolla mejor en el medio LSD con sal de
tetrazoleo. El ácido propionico añadido en proporción de 5 g/L al medio comercial
Columbia (Pasteur Production) acidificado hasta 5,0; no inhibe las distintas especies
de Bifidobacterium y permite aislar en presencia de otros géneros. Las colonias
aparecen a los 3 días a una temperatura de 37ºC.
Para el aislamiento de cepas a partir de material fecal es preferible el ácido propionico
a una concentración de 10 g /L.
III.- MATERIAL Y EQUIPOS

 Medio MRS (de MAN ROGOSA y col; 1960
 Cultivo de Lactobacillus acidophylus
 Incubadora bacteriológica.
 Asa de Kholle
 Mechero
IV.- METODOLOGIA
Realizar la coloración de Gram, para reconocer el L. acidophylus y luego sembrar en
estrías en una placa que contenga el medio MRS, colocar las placas en la incubadora
a 37ºC por 48 horas.
V.- RESULTADOS
Realizar las características culturales de las colonias.
VI.- CUESTIONARIO

1) Cuáles son las bacterias lácticas consideradas como probióticos y porque?

2) Que bacterias lácticas son usadas en los productos cárnicos, productos vegetales y
productos lácteos?
3) Describa la metodología para obtener bacterias lácticas.
4) Cómo pueden afectar los bacteriófagos a las bacterias ácido lácticas?
5) Cuáles son los efectos que tienen las BAL en la salud de los seres humanos?


PRÁCTICA Nº 9
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LEVADURAS
I.- OBJETIVOS
Conocer los medios en que se cultivan las levaduras.

Aislar levaduras de su medio natural
II.- REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Las levaduras son hongos unicelulares que durante siglos ha contribuido al hombre
en fermentar los jugos de frutas, pan, quesos, etc; algunas causan enfermedades a
plantas y animales, descomponen los alimentos o deterioran los materiales. Estas se
encuentran difundidas en la naturaleza y son diseminadas por los insectos o el viento.
Cuando se desarrollan en medios de cultivo (agar Saboraud, agar mosto, Ogy)

adecuados, forman colonias que varían de aspecto, textura y margen. Algunas son
lisas, otras rugosas, algunas aplanadas, elevadas con bordes bien definidos o

irregulares. Las colonias jóvenes tienen consistencia de pasta que al envejecer se

vuelven más espesa y seca. Algunas colonias en medio líquido se desarrollan al fondo
como sedimento, otros en la superficie como una película y otras se desarrollan
uniformemente.
Las levaduras se desarrollan en un pH de 4,5; la temperatura puede variar siendo la

más común de 20-25ºC.
Los métodos para conservar levaduras deben efectuarse en función del número de
cepas a conservar, de los medios disponibles y de las inversiones necesarias.
III.- MATERIAL Y EQUIPOS
 Medio OGY
 Cultivo de Saccharomyce cerevisae
 Incubadora
 Asa de Drygalsky
 Mechero
IV.- METODOLOGIA
Realizar la coloración simple para reconocer a Saccharomyce cerevisae, luego

sembrar en estrías en una placa que contenga el medio OGY o agar Mosto, incubar a
25ºC por 3 a 5 días.
V.- RESULTADOS
Dibujar las observaciones y el método desarrollado en la práctica.
VI.- CUESTIONARIO
1) Haga un breve esquema de la clasificación de las levaduras.

2) ¿Cómo metabolizan la glucosa las levaduras.?
3) Cuál es la importancia de las levaduras desde el punto de vista de la industria
alimentaria?
4) ¿A qué se refiere el término “masa madre”?
5) ¿Qué tipo de levaduras intervienen en la elaboración de la chicha de jora?



PRÁCTICA Nº 10
MICROBIOLOGIA DEL AGUA.
I.- OBJETIVOS
Conocer y familiarizarse con los métodos que se usan para el análisis de
microorganismos en el agua.

La legislación sanitaria exige que las aguas de consumo tengan una buena calidad
microbiológica que no pongan en peligro la salud del consumidor. El agua empleada
para las industrias deberá cumplir estas características de potabilidad.
Para el traslado de las muestras deberá realizarse en frascos de vidrio neutro o
plástico, no toxico, esterilizado, de boca ancha con tapa protectora y cierre hermético.
La capacidad de los frascos debe ser por lo menos de 120 mL. Con el objeto de poder
tomar una muestra de 100 mL., y dejar un espacio que facilite la agitación del agua
antes del examen.
Si se trata de muestras de agua que contiene cobre, zinc o si son aguas residuales
domesticas o industriales, con alto nivel de iones metálicos pesados, es aconsejable
preparar frascos con un agente de quelacion como el EDTA

El tiempo de transporte al laboratorio no debe exceder de 48 horas y de preferencia

no mas de 30 horas, debiéndose colocar en refrigeración de 4 -10ºC Al llegar las
muestras al laboratorio deben ser refrigeradas y analizadas de inmediato o dentro de
las 2 horas como máximo.
Para las muestras de aguas superficiales, incluyendo fuentes de agua potable,
reservorios y aguas de balnearios, el tiempo de transporte no debe exceder las 6
horas.
Los parámetros microbiológicos que se han de analizar son los que figuran en las
siguientes tablas:
Aguas potables de consumo público

Parámetros Muestra (ml) Concentración
Coniformes y Eschericha coli 100 0
Enterococos 100 0
Clostridium perfringens 100 0
Microorganismos totales a 22ºC 1 100
Aguas embasadas
Parámetros Muestra (ml.) Concentración
Eschericha coli 250 0
Enterococos 250 0
Pseudomonas aeroginosa 250 0
Clostridios sulfito reductores 50 0
 Campanas de Durham
 Tubos con caldo Laurel triptosa doble y simple concentración
 Tubos con agua de peptona al 0,1%
 Agar de recuento
 Asa de Kholle.
 Pipetas de 1, 10 mL
 Placas de Petra estériles
 Mechero

IV.- METODOLOGIA
Determinación de microorganismos aerobios mesófilos viables- método por

recuento en placa.
En los análisis de agua es necesario determinar el recuento total de microorganismos,
para lo cual se utilizara tubos con agua de peptona al 0,1% donde se realizará las
diluciones de 10-1 , 10-2 y 10-3 ; esta diluciones pueden aumentar si la muestra de agua
es de dudosa procedencia con la finalidad de poder cuantificar el numero de colonias
por mL.
Luego de cada dilución se transfiere 1 mL. a una placa de Petry estéril, se colocará en
cada placa de 15 a 20 mL del medio Agar de recuento previamente esterilizado y a
una temperatura de 45ºC., dejar solidificar y llevar a encubar a 37ºC por 24 horas.
Cuantificar el número de colonias de dos placas consecutivas y multiplicar por la
inversa de la dilución, sumar ambas placas y dividir entre 2 para obtener las UFC/mL.
Determinación de los grupos de microorganismos coliformes por la técnica del
número más probable. (NMP)
Tubos con 10 mL. de caldo lactosado o caldo lauril sulfato_triptosa (LST) con tubos de
fermentación (campanas de Durham). Colocar una gradilla tres series de tubos con
LST
 Inocular respectivamente 10mL. 1mL. y 0,1 mL en cada una de las series.
 Incubar los tubos a 37ºC durante 24-48 horas. Estimar el número más probable
de microorganismos como presuntos coliformes mediante la lectura de tablas.
 En los tubos en el que se observa crecimiento característico (turbidez,

producción de gas) se confirma sembrando en tubos de caldo con verde brillante y
bilis e incubado por 24 horas a 37ºC. Se estable en NMP de coliformes mediante
lectura en las tablas.
 A partir de estos tubos positivos sembrar por agotamiento en placas de EMB, que
se incubaran a 37ºC por 18 horas. Las colonias características muestran en centro
oscuro y pueden o no presentar un brillo metálico.
Para determinar el número mas probable de microorganismos coliformes
termotolerables se siembra en EMB y se incuba a 44ºC durante 24 horas.
Determinación de los microorganismos coliformes por la técnica de filtración a

través de membranas.
En esta técnica se hace pasar un volumen de agua (100mL) a través de un embudo
estéril en el que hay colocadas una membrana de filtro de 0,45 µm de un poro que
retiene todos los microorganismos que contiene la muestra de agua, luego se coloca
la membrana sobre un medio sólido selectivo y se incuba a 37ºC por 24 horas.
El medio que se emplea es el EMB, para caracterizar la E. coli se puede utilizar el
medio MUG para observar la producción de fluorescencia

Determinación de -Enterococos.
Se consideran a los microorganismos Gram positivos, aerobios o anaerobios
facultativos, catalasa negativos que fermentan la glucosa con producción de ácido a
37ºC en 48 horas. Se incluyen en este grupo las especies de Enterococo faecium. E.
durans, E. fecales, Streptococos bivis, y S. equinus.
La determinación por el NMP se emplea como medio de cultivo el caldo kanamicina
esculina ácida y se incuba a 37ºC por 24 horas, este medio inhibe a las Gram
negativas, los enterococos son capaces de crecer en presencia de kanamicina y
utilizan la esculina dando un característico color negro al reaccionar con el indicador
de citrato ferrico amonico.
Para determinar los enterococos por la técnica de membrana se utiliza el medio
Stanetz y Barthe y aquí las colonias presentan un color rojo ladrillo.
V.- RESULTADOS
Dibujar el método utilizado en la práctica y reportar los resultados comparando con la

tabla del NMP.


VI.- CUESTIONARIO
1. Cuáles son los análisis presuntivos, confirmativos y complementarios que se realizan
en la microbiología del agua.
2. Que cantidad en UFC/mL debe contener en el agua de consumo humano y que
medios de cultivo utilizaría para cuantificar e identificar a los microorganismos.
3. Cuáles son los parámetros o estándar microbiológico del agua de uso industrial
(cueros, alimentos, farmacéuticos, hospitales)
4. Explique en qué tipo de aguas naturales encontraría menor carga microbiana y
porque.
5. Explique el fundamento del uso de ozono en el agua.



PRÁCTICA Nº 11
MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS
CULTIVO DE BACTERIAS AEROBIAS MESOFILAS
I.- OBJETIVO
Conocer los análisis más importantes que se realizan en los alimentos.

Familiarizar al alumno los métodos de siembra de microorganismos en alimentos.
II.- REVISIÒN BIBLIOGRÁFICA
Hay que tener en cuenta que los alimentos no son productos absolutamente estériles
sino que sus poblaciones microbianas varían, desde un escaso número en la mayoría
de las conservas, a cifras importantes en alimentos fermentados.
Los microorganismos contenidos en los alimentos actúan de diversas formas: unos,
produciendo efectos perniciosos a través de los metabolitos tóxicos resultantes de su
crecimiento sobre los alimentos antes de ser injeridos; como el Cl. botulinum y St.
aureus, ocasionando una enfermedad denomina intoxicación. Otros, dan lugar a
efectos patógenos cuando se injieren directamente con los alimentos ocasionan
trastornos, principalmente gastroentéricos en las personas que lo han consumido.
III.- MATERIALES.
 Licuadora u homogenizador estéril.

 Balanza de precisión.
 Pipetas bacteriológicas de 10mL. y 1mL.
 Diluyente: solución salina peptonada (SSP).
 Placas de Petri estériles.
 Baño maría regulado a 44˚C - 46˚C para mantener el agar licuado.
 Incubadora.
 Agar Plate Count.
 Muestras de alimentos: queso fresco, yogurt, refrescos.
IV.-METODOLOGÍA.
A).MICROORGANISMOS INDICADORES DE HIGIENE INADECUADA: Recuento

total de microorganismos facultativos mesófilos viables.
Método: Recuento Estándar en Placa.

Preparar las muestras según procedimientos recomendados para la preparación y

dilución de muestras.
Pipetear por duplicado a placas de Petri estériles, alícuotas de 1mL. a partir de las
diluciones 10 -1, 10 -2 , 10-3, 10-4.
Agregar inmediatamente a las placas de Petri 15 mL. de agar Plate count licuado y
temperado (45ºC), mezclar rápidamente con movimientos de vaivén y rotación de la
placa; dejar solidificar.
Incubar las placas en posición invertida a 31˚C - 37˚C por 24 horas.
Efectuar el recuento de microorganismos de la siguiente manera:
a) Seleccionar 2 placas correspondientes a una dilución que contenga entre 30-300
colonias utilizando un contador de colonias.
b) Tomar la media aritmética de los 2 recuentos y multiplicar por el factor de dilución
(recíproco de la dilución utilizada). Reportar el resultado como número de m.o.
aerobios mesófilos viables por gramo o mililitro, según el caso.
c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores que
30 y mayores que 300, tomar el promedio de los dos recuentos y computar el
recuento para cada una de las diluciones y establecer la relación de los dos
recuentos.
B).- MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CONTAMINACIÓN FECAL
Coliformes termotolerables: Son un grupo de microorganismos procedentes de la

incubación del inóculo a la temperatura de 44ºC a 45.5ºC, que contiene por lo general
un alto porcentaje de E. coli tipo I y II,por lo que son muy indicativos de la
contaminación fecal.
Escherichia coli: Este microorganismo habita naturalmente en el tracto digestivo del
hombre y de otros animales de sangre caliente. La presencia de este microorganismo
en un alimento se interpreta como contaminación directa o indirecta de origen fecal,
por lo que se considera a la E. coli como el indicador clásico de la presencia
simultánea de bacterias patógenas entéricas, entre ellas Salmonella tiphy, otras
Salmonelas, Shigella sp., Vibrios, parásitos diversos y virus entéricos. Sin embrago, la
presencia de E. coli, en un alimento o indica que exista también necesariamente
patógenos, sino simplemente, advierte el riesgo de que pudieran estar presentes.
En conclusión podemos considerar lo siguiente:
 La E. coli es un buen indicador de la contaminación fecal para la mayoría de los
alimentos.
 Los demás Coliformes son buenos indicadores de una limpieza y desinfección no
adecuadas, o de una industrialización o procesamiento de los alimentos no correctos.
 Los coliformes termotolerables, tienen una mayor probabilidad de contener
organismos de origen fecal, por lo que son organismos indicadores mucho más
seguros de la contaminación fecal.

Método: Numeración de Bacterias Coliformes por el método de Recuento en

Placa.
Preparar las muestras según procedimientos recomendados.
Transferir 1 mL. de cada dilución de la muestra en una placa de Petry estéril,
adicionar 10 – 15 mL. del medio VRBA temperado a 44˚C - 46˚C
Mezclar el contenido de las placas mediante movimientos de vaivén y rotación; dejar
solidificar, luego adicionar 10 mL más del medio como doble capa cubriendo
completamente la superficie del medio solidificado para inhibir la formación de
colonias en la superficie, dejar solidificar,Incubar en posición invertida a 37˚C por 24
horas.
Realizar el recuento estándar en las placas que contengan entre 20 y 200 colonias,
tomando en cuenta únicamente las colonias violetas o rojo oscuro, rodeadas de un
precipitado rojo violeta.
Multiplicar el número de colonias por la dilución para obtener el número de bacterias
coliformes por gramo o mililitro de muestra.
V.- RESULTADOS.
Dibujar y rotular el método utilizado en la práctica.
VI.- CUESTIONARIO
1. Si se quiere investigar las condiciones higiénicas de un queso, embutido,

mermelada, ¿qué análisis realizaría Ud?
2. ¿Qué finalidad tienen realizar diluciones en los análisis de alimentos?
3. Que organismos regulan los estándares microbiológicos para alimentos.
4. Que es el CODEX alimentario?
5. Qué significan las siguientes terminaciones : FAO, FDA, ICMSF y AOAC?




PRÁCTICA Nº 12
MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS
CULTIVO DE BACTERIAS ANAEROBIAS
I.- OBJETIVO
Familiarizar al estudiante con el método para determinar microorganismos

anaerobios.
II.- REVISIÒN BIBLIOGRÁFICA
Las bacterias anaerobias se pueden cultivar eliminando el oxígeno del medio

ambiente o estableciendo un potencial redox bajo, mediante la adición de los
suficientes materiales reductores al medio de cultivo.
La protección de los cultivos anaerobios del oxígeno libre se puede conseguir por
varios métodos diferentes, el más empleado en laboratorio es sembrar la bacteria en
placas o tubos de cultivo e introducirlos en las llamadas jarras de anaerobiosis donde
se genera una atmósfera libre de oxígeno.
III.- MATERIALES.
 Licuadora u homogenizador estéril.

 Balanza de precisión.
 Pipetas bacteriológicas de 10mL. y 1mL.
 Diluyente: solución salina peptonada (SSP).
 Placas de Petry estériles.
 Baño maría regulado a 44˚C - 46˚C para mantener el agar licuado.
 Incubadora.
 Agar para anaerobios: TSC, TSN, etc.
 Muestras de alimentos: queso fresco, yogurt, refrescos.
IV.-METODOLOGÍA.
Preparar las muestras según procedimientos recomendados para la preparación y

dilución de muestras.
Preparar las diluciones 10 -1, 10 -2 , 10-3.
Pipetear alícuotas de 1 ml. por duplicado a placas de Petri estériles, que ya contengan
una capa delgada de agar. Agregar inmediatamente a las placas de Petri 15 mL. del
agar empleado licuado y temperado (45ºC), mezclar rápidamente con movimientos de
vaivén y rotación de la placa; dejar solidificar.

Y por último adicionar 5 ml. Más de agar empleado y dejar solidificar.

Colocar las placas en posición normal en una jarra de anerobiosis, donde se genera
una atmósfera libre de oxígeno. Es, tas jarras constan de un soporte para placas
incluido en una cubeta transparente con tapa hermética. Las placas y los tubos
sembrados se colocan dentro del soporte en el interior de la jarra junto al sobre
comercial abierto. Para crear la atmósfera anaerobia se utiliza el sobre comercial que
contiene una tableta de borohidrato sódico, otra de bicarbonato sódico y ácido cítrico
y un catalizador de paladio. Cuando se añade agua al sobre, el borohidrato sódico,
bicarbonato sódico y ácido cítrico reaccionan para formar hidrógeno y dióxido de
carbono. El catalizador de paladio cataliza la reacción entre el hidrógeno y el oxígeno
presente dentro de la jarra. Esta reacción produce agua, que se condensa en las
paredes de la jarra. Para confirmar que la atmósfera es anaerobia se coloca dentro de
la jarra un papel indicador que contiene azul de metileno. Ëste es azul en presencia
de oxígeno y vira a blanco en un ambiente anaerobio.
Incubar la jarra de anaerobiosis conteniendo las placas a 37˚C por 24 horas. Luego
de la incubación, efectuar el recuento de microorganismos de la siguiente manera:
Contar colonias negras en el medio TSN o contabilizar las colonias negras rodeadas
de un halo opaco en el medio TSC. Esto es un recuento presuntivo de Clostridium
perfringens.
PRÁCTICA 3 / 4

EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO. TÉCNICAS DE

INCUBACIÓN
V.- RESULTADOS.
Dibujar y rotular el método utilizado en su práctica, reportar las características de las

placas incubadas y el número de microorganismos anaerobios presentes.
VI.- CUESTIONARIO
1) Cuáles son otros métodos de de siembra para microorganismos anaerobios?
descríbalos.
2) ¿Cómo se clasifican los microorganismos según las necesidades de oxígeno?
3) ¿Cuáles son los microorganismos anaerobios que se encuentran presentes en
alimentos? y ¿qué efectos producen?
4) ¿Cuál es el mecanismo de acción de la toxina botulínica?



PRÁCTICA Nº 13
MICROBIOLOGIA DE SUELOS
I.- OBJETIVO
Colorear y observar las formas de las bacterias del género Rhizobium.
La importancia de conservar el ecosistema de suelo, como los microorganismos que

aquí se encuentran y que cumplen un rol importante en la agricultura como es el caso
del cultivo de leguminosas que son plantas ricas en proteínas. Estas plantas para
desarrollarse necesitan nitrógeno, que le proporciona el Rhizobium mediante un
proceso simbiótico.
Estos microorganismos adoptan formas pleomorficas (X,Y.Z)cuando se encuentran en
los nódulos de las raíces, en cambio cuando se encuentran en un medio de cultivo
son de forma bacilar.
III.- MATERIALES
 Raíz de leguminosas (alfalfa, frejol, haba, trébol etc.)

 Microscopio binocular.
 Láminas porta objetos.
 Laminillas cubre objetos.
 Hipoclorito de Na al 3 %.
 Etanol al 95%
 Agua destilada estéril.
 Coloración Gram.
IV.- METODOLOGÍA.
a).- Recolección.
Recolectar plantas de leguminosas en la etapa vegetativa, de terrenos húmedos, la

recolección deberá ser manual. Si la recolección se realiza en lugares alejados al
laboratorio los nódulos presentes en la raíz se colocaran en frascos que contengan
silicagel.

b).- Aislamiento.
Los nódulos de color rojo se lavan con agua destilada hasta retirar la tierra adherida,
sumergir en etanol al 95% por 1 minuto, luego se desinfectaran con hipoclorito de Na
al 3% por 3 minutos, enjuagar con agua destilada estéril de 4-6 veces. Presionar los
nódulos con una pinza estéril y dejar caer el líquido sobre una lámina porta objeto
dejar secar, realizar la coloración de Gram.
V.- RESULTADOS
Dibuje las formas del Rhizobium, observadas al microscopio.
CUESTIONARIO.
1) Mencione las especies de Rhizobium que nodulan a: alfalfa, trébol, arvejas, fréjol,
soya, tarwi.
2) Que microorganismos son fijadores de N atmosférico no simbiótico, y en que plantas
se presenta.
3) Explique la importancia de las micorrizas en el ecosistema de tierra y que función
cumplen en las frutales.



PRÁCTICA Nº 14
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL:
FERMENTACION (ALCOHOLICA y LACTICA)
I.- OBJETIVO
 Determinar y medir los parámetros que rigen la fermentación alcohólica.

 Evaluar la leche (sustrato) cuando es inoculada con una bacteria probiótica
Los inóculos microbianos, utilizados como auxiliares tecnológicos, tienen en general

un valor más elevado. En este caso el objeto de proceso de producción se basa en la
optimización del rendimiento de células viables con una actividad biológica definida y
con buenas características de supervivencia.
El resultado de los estudio de las levaduras y las bacterias lácticas siguen siendo
aplicadas como auxiliares tecnológicos.
En muchos productos industriales obtenidos predominantemente después de la fase
de crecimiento exponencial, se observa la existencia de una velocidad óptima lineal
de formación de producto durante la fase post- exponencial, por lo que el objetivo
clave consistirá en controlar el medio y las condiciones medio ambientales de forma
que esta fase de producción lineal sea lo más larga posible.
III.- MATERIALES.
 Zumo de fruta (uva, manzana, caña de azúcar, etc.).

 Leche entera fresca
 Quimiostato
 Camara de Neuvawer o Thoma.
 Microscopio.
 Refractómetro de mano
 Láminas porta objeto.
 Laminillas cubre objetos.
 Tubos de ensayo, pipetas.
 pH metro.
 Cocinilla
 Agua destilada.
 Estufa de incubación.
 Azul de metileno.

IV.- METODOLOGÍA.
a) Fermentación alcohólica
Estrujar uvas y extraer el mosto por filtración, medir los grados Brix (ºB), el pH. (3,5 a
3,9); colorear con azul de metileno las levaduras (0.02g. de AM/100 mL de agua + 4 g
de tri-citrato de sodio/100 mL. de agua) y cuantificar en la cámara de Neuvawer, cada
24 horas.
Criterio para el recuento en cámara de Neuvawer
La mejor visión de conjunto se obtiene con una 20 células/cuadrado grande; si el
número es bastante mayor hay que diluir la suspensión. Para cada recuento la
cámara debe estar limpia,
La gota del líquido a contar que va en al placa de recuento debe ser tan grande como
para que ocupe todo el espacio de la misma.
El líquido está diluido en una solución de azul de metileno, que tiene la propiedad de
colorear de azul las células muertas. Por lo tanto no se beben de contar las células
azules.
Se cuentan sólo las células que están sobre los cuadrados grandes que se
encuentran formando una “U” invertida, es decir en 160 cuadrados pequeños; ya que
no están incluidas las células que se encuentran sobre los cuadrados pequeños
divididos, tampoco se cuentan las que se encuentran sobre dos lados continuos de
cada cuadrado grande.
Nro. Células/ mL = Nro Cel. Contadas / 4 (Para una dilución de 10-1)
b).- Fermentación láctica

Pasteurizar leche entera a la temperatura de 72ºC por 15’, enfriar a la temperatura de
40ºC e inocular la bacteria en una proporción del 10%. Tomar el pH inicial. Incubar a
37ºC por 2 horas y evaluar cada 20 minutos la variación de pH, y cuantificar el
desarrollo del microorganismo en la cámara de Neuvawer
V.- RESULTADOS
Dibujar los métodos utilizados en su práctica y construir las curvas de desarrollo de

las levaduras y las bacterias.
VI.- CUESTIONARIO
1) Como realizaría el recuento en placa para las levaduras.
2) Mencione un listado de bacterias probióticas de interés industrial.
3) Que métodos existe para producir metabolitos a partir de bacterias lácticas en un
proceso continuo.
4) Explique cómo obtendría el ácido láctico producido por una bacteria.




ANEXO N°01
MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO.
1.- Compruebe que los lentes OCULARES Y OBJETIVOS estén limpios, de no ser así
límpielos cuidadosamente con papel especial para lentes. NO toque los lentes con los
dedos.
2.- Coloque la preparación que se le proporcione sobre la PLATINA, sujetándola con
el dispositivo móvil. Compruebe previamente que el objetivo de menor aumento este
en posición de empleo.
3.- Para bacteriología ilumine la preparación bajando casi totalmente el Condensador,
con el DIAFRAGMA abierto totalmente.
4.- Coloque el OBJETIVO10 X y enfoque, acercando al máximo la lente a la
preparación, empleando el tornillo MACROMÉTRICO (NO haga esta operación
mirando por el ocular, correría el riesgo de destruir la preparación. Suba el tubo
lentamente observando por el ocular hasta que obtenga un enfoque nítido.
5.- Pase al OBJETIVO 40x.Suba ligeramente el CONDENSADOR, la imagen debe
estar casi enfocada, afine el foco con el tornillo MICROMÉTRICO. El objetivo de 40 X
está muy cerca de la preparación y por ello es susceptible de dos tipos de accidente:
Ser "clavado” en la preparación y resultar manchado con aceite de inmersión si se
observa una preparación ya usada con este ultimo. Es preferible enfocar de nuevo
con el objetivo 10X.
Empleo del OBJETIVO DE INMERSIÓN :
a) Gire el revolver hacia el OBJETIVO DE INMERSIÓN dejándolo a medio

camino entre este y el objetivo 40X.
b) Coloque una gota mínima de ACEITE DE INMERSIÓN sobre el punto de
luz.
c) Termine de girar suavemente el REVOLVER hasta la posición del objeto de
inmersión, asegurándose que este no toca la preparación pero sí la gota de
aceite.
d) Enfoque cuidadosamente con el MICROMÉTRICO. La preparación debería
estar prácticamente enfocada si se ha realizado un enfoque cuidadoso con
el OBJETIVO 40x. (De no ser así es preferible volver a enfocar de nuevo un
campo distinto partiendo del objetivo 10 X).La distancia de trabajo desde el
lente frontal del OBJETIVO DE INMERSIÓN a la preparación es mínima por
lo que el riesgo de accidente es ahora máximo.

e) Una vez que haya colocado aceite de inmersión sobre la preparación, ya

no puede volver a colocar el OBJETIVO 40X sobre este campo, correría el
riesgo de mancharlo de aceite. Por tanto si desea enfocar otro campo, debe
retirar el OBJETIVO DE INMERSIÓN girando el revolver hacia el OBJETIVO
10 X.
f) Finalizada la observación de una preparación y antes de retirarla de la
PLATINA, se colocará el objetivo de menor aumento. NUNCA RETIRE LA
PREPARACIÓN CON EL OBJETIVO DE INMERSIÓN EN POSICIÓN DE
OBSERVACIÓN.
g) Retire la preparación y limpie el OBJETIVO DE INMERSIÓN
cuidadosamente empleando un papel especial para óptica .Compruebe
también que el OBJETIVO 40X esta perfectamente limpio.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1.- Si no esta utilizando el MICROSCOPIO este debe estar guardado y

cubierto con una funda de plástico con el fin de evitar que se ensucien y
dañen los lentes.
2.- NO se deben tocar nunca los lentes con las manos. Cuando se necesite
use papel especial para óptica para su limpieza.
3.- Nunca deje una preparación sobre la platina cuando no esta utilizando
el microscopio.
4.- Después de utilizar el objetivo de inmersión, limpie el aceite que queda
en el objetivo con papel especial. Si el aceite ha llegado a secarse y
pegarse en el objetivo se debe limpiar cuidadosamente con una mezcla de
alcohol-acetona (7:3) o xilol. (Una aplicación excesiva de estos disolventes
puede dañar los lentes.
5.- NO fuerce nunca los dispositivos giratorios del microscopio.
(REVOLVER, CONDENSADOR, MACROMETRICO, MICROMÉTRICO).
6.- NO cambie nunca de objetivo mientras está observando a través del
ocular. Dirija su mirada a la preparación y evite el rozamiento del lente con
la muestra.
7.- Cuando finalice el trabajo ponga el Objetivo de menor aumento en
posición de observación.
8.- Es conveniente limpiar, revisar y cubrir los microscopios al Finalizar la
sesión práctica.

ANEXO N°02
TECNICAS BASICAS
Toma de muestras:
Siembra.

Tres Giros

ANEXO N°03
PREPARACION DE SOLUCIONES Y COLORANTES
1. Azul de Lactofenol:
Disolver cuidadosamente 10 gr. de fenol (cristales) en 20 ml. de agua destilada,
agregar 20 gr. de ácido láctico y 40 gr. de glicerol. Posteriormente, disolver 0.05 gr. de
azul de metilo.
2. Azul de Metileno Alcalino:
Disolver 0.3 gr. de azul de metileno en 30 ml. de alcohol etílico al 95% y mezclarlo con
100 ml. de solución de hidróxido de potasio al 0.01%.
3. Cristal Violeta:
Este colorante se prepara en dos partes:
a) Solución (a); en un vaso de precipitados de 50 ml. colocar 10 ml. de alcohol etílico
y disolver 1.0 gr. de cristal violeta.
b) Solución (b): En otro vaso se disuelven 0.4 gr. de oxalato de amonio en 40 ml. de
agua destilada.
c) Mezclar cuidadosamente las soluciones (a) y (b) .
d) Guardar la mezcla en un frasco ámbar en oscuridad durante 24 horas. Filtrar en
papel Watman Nº1 antes de utilizarlo.
4. Verde Malaquita:
Disolver 5.0 gr. del colorante verde de malaquita en 100 ml. de agua destilada.
5. Solución de Lugol :
En un matraz aforado de 50 ml. disolver 0.333 de yoduro de potasio en 20 ml. de
agua destilada y enseguida agregar lentamente 0.166 gr. de yodo, mezclar
completamente y aforar en agua destilada.
6. Solución decolorante alcohol – acetona:
Colocar en una probeta de 50 ml. , 30 ml de alcohol etílico y 20 ml. de acetona,
mezclar perfectamente.
7. Alcohol al 70%.
8. Safranina:
En un matráz aforado de 50 ml. colocar 5.0 ml. de alcohol etílico y disolver 0.125 gr.
de safranina, aforar con agua destilada.
9. Solución de Fenol al 2%:
En un matraz aforado de 100 ml. colocar 2.0 gr. de fenol cristales y disolver con un
poco de agua poco a poco, después aforar con agua destilada.
10. Soluciones amortiguadoras para controlar el pH de medios de cultivo

BIBLIOGRAFIA GENERAL
 Brooks G.F. , Butel J.S., Morse S.A. 1999. Microbiología Médica de Jawetz, Melnick
y Adelberg. Editorial El Manual Moderno, 16 ava Edición.
 Cleiba, 1982. Centro Latinoamericano de Enseñanza e Investigación de

Bacteriología Alimentaria.
 Harrigan W.F. Laboratory Methods In Food Microbiology. 1998 Academyc Press 3 a

Edition-
 Jay, J.M. 1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Tercera Edición. Editorial
Acribia, Zaragoza – España.
 Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods 2001 (4 th

Edition) Edited by Frances Pouch Downes and Kelth Ito. American Public Health
Assosiation.
 Michael J. Pelczar., Roger D. Reid., E.C.S.Chan. Microbiología. Cuarta Edición

.Editorial La Colina, S.A. (España) 1991.
 Cliver, D.O.R. Ellender, and M.D. Sobsey, ¡997. Métodos para detector
microorganismos en alimentos y sus principios generals.
 Nickerson, J Y Sinskey, A. 1998. Microbiología de los Alimentos y sus Procesos de

Elaboración, Editorial Acribia Zaragoza – España.

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Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 1

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métodos adecuados para la preparación y esterilización de los materiales en un

III MATERIALES Y EQUIPOS:

IV.- PROCESOS DE ESTERILIZACIÓN.

Consiste en preparar los materiales y medios de cultivo, y posteriormente eliminar

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 6

Esterilización por calor seco:

Esterilización por calor Húmedo:

Esterilización por Filtración:

Esterilización por Radiaciones:

Esterilización por Agentes Esterilizantes Químicos:

Cada estudiante preparará el siguiente material de vidrio:

 Balón, Fiola o Matraces Erlenmeyer.

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 7

Una vez preparado todo el material de vidrio:

Esterilizar siguiendo las instrucciones sañaladas:

Una vez que el material ha sido sometido al proceso de esterilización se pueden

Dibujar los equipos y materiales observados en su laboratorio de microbiología y

1) Describa los usos y ventajas de las láminas de Petrifilm.

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 8

3) Mencione las sustancias químicas usadas en un laboratorio de microbiología, con

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 9

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 10

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 11

OBSERVACIONES DE MICROORGANISMOS: COLORACION SIMPLE Y

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 12

Los métodos de tinción en microbiología más usados son:

Métodos de Tinción Simple.

Métodos de Tinción Diferencial.

III.- MATERIALES Y EQUIPOS:

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 13

Dibujar y rotular los microorganismos observados con la coloración de azul de

1. Cuáles son las diferencias entre un microscopio óptico y un microscopio electrónico?

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 14

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 15

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 16

METODO MICROBILOGICO: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.

II.- REVISION BIBLIOGRAFICA

Mg. Mariel Alvarez Rodrííguez Paí gina 17

consideran además necesidades de oxigeno (aerobios), bióxido de carbono parcial o

En los primeros tiempos de la Bacteriología sólo se conocía como sustancia

Los medios de cultivo se clasifican de la siguiente manera:

b) Los medios comunes: permiten el crecimiento indiscriminado de todo tipo de

c) Los medios especiales: se preparan teniendo en cuenta sus exigencias