UNIVERSIDAD CATOLICA

DE SANTA MARIA

FACULTAD DE CIENCIAS
FARMACEUTICAS, BIOQUIMICAS Y
BIOTECNOLOGICAS

GUIA DE PRACTICAS INMUNOLOGIA

PRIMERA EDICION

Preparada por:
.
Dra. Karin J. Vera Lopez
Dra. Rita Nieto Montesinos

AREQUIPA-2019
 Practica N° 1

Separación celular y viabilidad celular

I. Objetivos

 Aislar la fracción linfomonocitaria de sangre.

 Hacer el recuento celular y el reconocimiento de las células viables mediante
el uso de Azul de tripan.

II. Introducción

La sangre es un tejido fluido, que cumple una serie de funciones vitales en

nuestro organismo, permite el transporte de nutrientes y de células
importantes para la defensa, así mismo tiene un rol importante en el
intercambio gaseoso (oxígeno y CO2). La sangre está constituida por una
fracción liquida y una celular, la fracción liquida compuesta por el plasma,
(líquido amarillento conformado por agua, sales y glucosa) y la fracción celular
compuesta por grupos celulares, dentro de las cuales tenemos a las
plaquetas, los glóbulos rojos (hematíes o eritrocitos) y glóbulos blancos
(leucocitos o glóbulos blancos)

Los leucocitos (mononucleados o polinucleados), son los efectores celulares

de la respuesta inmunológica, a diferencia de los eritrocitos, no contienen
pigmentos y son verdaderas células con núcleo, mitocondria y organoides,
cabe recalcar que solo un pequeño porcentaje de leucocitos se encuentra
circulando en el torrente sanguíneo, la mayor cantidad se encuentra en la
medula ósea, tejidos y órganos, donde cumplen funciones especiales.

Dentro de los leucocitos se encuentra los linfocitos, quienes los cuales son
responsables de la respuesta inmune específica, estos de acuerdo a su
función se dividen en Linfocitos T, que son los encargados de las reacciones
inmunidad celular y Linfocitos B que son los mediadores de la respuesta
inmunitaria humoral.

Para poder analizar y estudiar a los linfocitos, estos primero deben ser
aislados de las otras células sanguíneas, la sangre periférica es la principal
fuente de células linfoides para realizar investigaciones del sistema inmune
humano, el aislamiento de estas células es el paso previo a otra serie de
técnicas más complejas como por ejemplo la inmunocitotoxicidad mediada por
el complemento, con fines de trasplantes de órganos, etc.

Uno de los métodos más usados es el de centrifugación en gradiente de

densidad de Ficoll – Hypaque (densidad 1,077 ± 0,001 g/ml), un método
simple y rápido de purificación de células mononucleares, que incluyen tanto
a los linfocitos como a los monocitos, los primeros superan ampliamente en
número a los segundos, cuando se trabaja con muestras de sangre periférica.
Este método de aislamiento se fundamenta en las diferentes densidades que
presentan cada uno de los tipos celulares de la sangre (Figura 1).

Al colocar una muestra de sangre con sobre el Ficoll – Hypaque y centrifugar,

las células mononucleares (linfocitos y monocitos) se separan de las demás
quedando bajo una capa de plasma y flotando sobre el Ficoll, esto debido a
su menor densidad, en contraste con los eritrocitos que se aglutinan y, pasa
a través del Ficoll, formando un sedimento al fondo. Los granulocitos también
sedimentan por su tamaño, densidad y por su tendencia a formar agregados
(figura 2).

Este procedimiento permite recuperar alrededor de un 50% de los linfocitos

presentes en la muestra, con una viabilidad mayor del 90% (determinada
mediante exclusión del azul tripán)

Fig. 1- Distribución de las células sanguíneas de acuerdo a su densidad

 Figura 2.- Centrifugación En Gradiente De Densidad De Ficoll – Hypaque

Determinación de Viabilidad por azul de tripán

La membrana plasmática de las células vivas no permite el paso de sustancias

que no sean electrolitos, mientras que las células muertas las dejan pasar y se
colorean. Este fenómeno se utiliza para distinguir células vivas de células
muertas (Viabilidad), con el fin de corregir los valores obtenidos en un simple
recuento de células, para su determinación se utiliza el colorante azul tripán (se
puede utilizar también azul de metileno).

El azul tripán es un colorante vital, que está cargado negativamente y no puede

interactuar con la célula a menos que la membrana este dañada, de esta forma
todas las células que excluyan el colorante, están viables y las que se tiñen están
muertas o muriendo.

III. Material

Biológico
Sangre

Soluciones y Reactivos
Buffer fosfato salino - PBS pH 7.4
Medio de separación de linfocitos Ficoll – Hypaque
Muestras de sangre
Azul de tripan
Equipos
Tubos falcon
Tubos eppendorf
Pipeta Pasteur
Pipetas de 10 mL
Micropipeta y puntas de 50uL
Centrífuga
Cámara de Neubauer
Cubreobjetos
Microscopio óptico

IV. Procedimiento

1. Extraer 0.5 mL de sangre por veno punción y depositarlos en un tubo

conteniendo anticoagulante, agitar para homogenizar.
2. Diluir la muestra de sangre heparinizada con suero fisiológico o PBS (pH
7.4) a una proporción 1:1 y reservar.
3. En un tubo de centrifuga colocar 0.5 mL del medio de Ficoll – Hypaque.
4. Añadir la sangre diluida (1mL) dejándola resbalar suavemente por las
paredes del tubo conteniendo el Ficoll – Hypaque.Ficoll (no mezclar).
5. Centrifugar a 2000rpm durante 30min a temperatura ambiente.
6. Tras la centrifugación se observarán capas, la superior correspondiente
al suero, segundo las células mononucleares (formando un anillo
blanquecino), tercero el Ficoll-Hypaque y finalmente los glóbulos rojos y
polinucleares.
7. Con cuidado de no mezclar las capas, sacar el tubo de la centrífuga y
aspirar el plasma (capa superior) con una pipeta, delicadamente, dejando
intacto el anillo blanquecino de células mononucleares.
8. Aspirar el anillo blanquecino de células mononucleares, haciendo un
movimiento circular dentro del mismo, sin recoger plasma o ficoll.
Depositar las células en un tubo limpio.
9. Lavar las células con 1.5 ml de suero fisiológico o PBS y centrifugar 10min
a 1500rpm.
10. Decantar o aspirar el sobrenadante y repetir el paso 9.
11. Resuspender el pellet en 1mL de PBS o medio de cultivo posteriormente
realizar el contaje y viabilidad de celular.
12. Preparar una dilución 1/10 (90 µl de azul tripán en un tubo eppendorf y
10 µl de suspensión celular previamente agitada)
13. Coger con la micropipeta 10 ul de esta dilución y ponerla en la cámara de
Neubauer.
14. Llevar la cámara al microscopio para el conteo, enfocar con aumento 10X
y luego contar con 40X.
15. Observar cada cuadrado (A, B, C y D), anotando el número total de células
y el número de células teñidas de azul (Debe realizarse en menos de 5
min, pues pasado este tiempo la mortalidad aumenta por el propio
colorante.)
16. Calcular número de células totales/ml y el porcentaje de viabilidad.
 % de viabilidad = Células vivas x 100
Células totales

Nota: Normalmente la suspensión celular se mezcla con el azul tripán en una

dilución 1:10. Si se cuentan más de 200 células se puede hacer otra dilución
1:100 y si se cuentan muy pocas se puede hacer una dilución menor (1:2, 1:5).
Se hace un recuento de células totales y de células teñidas (células muertas) y
se calcula el porcentaje de viabilidad.

V. Resultados

Hacer un esquema de los pasos seguidos para desarrollar la práctica y sacar sus
conclusiones de los resultados obtenidos

VI. Cuestionario

1. ¿Cuál es la composición del Ficoll-Hypaque y cual la función de cada uno

de sus componentes?
2. ¿Existen otros métodos de separación de linfocitos además del método
de centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll – Hypaque?
Mencione cuáles.
3. ¿Por qué es necesario diluir la sangre antes de realizar el procedimiento
de separación con Ficoll-Hypaque?
4. ¿Qué factores podrían alterar la separación linfocitos con Ficoll-Hypaque?
5. Explique alguna técnica para la separación de Linfocitos T.
6. Mencione diferentes técnicas que necesiten del aislamiento de linfocitos
como paso previo a su desarrollo.
7. ¿Por qué se usa el azul de Tripán para la determinación de la viabilidad?
8. ¿Qué otros colorantes pueden ser usados para determinar la viabilidad?
9. ¿Qué es un cultivo celular primario?

VII. Referencias

CARCIERO, R.; VALERI, C. R. Isolation of Mononuclear Leukocytes in a Plastic Bag System

Using Ficoll‐Hypaque 1. Vox sanguinis, 1985, vol. 49, no 6, p. 373-380.

VISSERS, Margret CM; JESTER, Sherry A.; FANTONE, Joseph C. Rapid purification of human
peripheral blood monocytes by centrifugation through Ficoll-Hypaque and Sepracell-MN. Journal
of immunological methods, 1988, vol. 110, no 2, p. 203-207.

STROBER, Warren. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current protocols in immunology,
2015, vol. 111, no 1, p. A3. B. 1-A3. B. 3.
 Práctica N˚ 2

Localización y aislamiento de órganos linfoides en el ratón.

I. Objetivos:

 Visualizar los principales órganos linfoides en ratón: timo, bazo, médula

ósea y ganglios linfáticos
 Obtener suspensiones celulares a partir de bazo, timo y medula ósea.
 Obtener macrófagos peritoneales.
 Observación de cortes histológicos de órganos del sistema inmunológico
timo apéndice, intestino, adenoides

II. Introducción

Los linfocitos se encuentran en gran cantidad infiltrados en una forma difusa en

la dermis de la piel, mucosas y submucosas del árbol respiratorio, tubo digestivo
y tracto genitourinario, los podemos encontrar libres en la sangre y linfa, o
reunidos formando los ganglios o nódulos linfoides. Los nódulos forman masas
densas de forma esférica, en donde podemos encontrar células plasmáticas, así
como los macrófagos y linfocitos.

Los linfocitos se producen en la medula ósea a partir de las células madre

(totipotenciales) y circulan por la linfa y la sangre por donde pueden llegar a todos
los tejidos. La mayoría de los linfocitos (95%) se encuentran en los ganglios
linfáticos, el bazo y el timo.

Los órganos linfoides son los responsables de la formación de los linfocitos y se

diferencian en dos tipos:

Órganos linfoides centrales: también llamados primarios (timo y medula ósea),

son necesarios para que se lleve a cabo la producción y maduración de las
células del sistema inmune.

El timo se localiza en el tórax, situado anterior al corazón, donde se generan los

linfocitos T, que median la inmunidad celular. Las células progenitoras que
provienen de la médula ósea o bien del hígado fetal (en el periodo fetal), llegan
al timo y sufren procesos de maduración y selección hasta generar linfocitos T
funcionales, los que podrán salir a la periferia y llevar a cabo las respuestas
efectoras.

Órganos linfoides periféricos: también llamados secundarios (bazo, ganglios

linfáticos, apéndice, amígdalas, tejido linfoide asociado al intestino (GALT),tejido
linfoide asociado a bronquiolos (BALT) y tejido linfoide asociado a mucosas
(MALT)), se caracterizan por su proximidad a los antígenos. En estos se lleva a
cabo la respuesta inmune adaptativa, produciendo linfocitos antígeno-
dependientes.
El bazo está situado en el hipocondrio izquierdo, encima del riñón izquierdo y del
colon descendente y detrás del fondo gástrico. Presenta múltiples funciones
siendo las más conocidas las que se refieren a la linfopoyesis (formación de
glóbulos blancos), eritropoyesis (formación de glóbulos rojos) y hematólisis
(destrucción de los glóbulos rojos), ósea se encarga de la limpieza de la sangre.

ESQUEMA DE LOS DIFERENTES ORGANOS Y GANGLIOS LINFOIDES EN

RATON

III. Materiales

Ratón
Alcohol
Medio RPMI + 2% FCS
Buffer de Lisis (NH4CL, KHCO3, EDTA)
Azul de tripán 0.4% en PBS 1X.
Tijeras, pinzas
Jeringas de 10 ml y agujas
Pipetas Pasteur
Micropipetas y puntas de 50 ul
Tubos Eppendorf
Tubos de 15 ml
Placas Petri
Cámara de Neubauer
Cubreobjetos
Cubeta con hielo
Azul de tripan
Microscopio
Centrifuga

IV. Procedimiento

Sacrificar al ratón por inhalación. Colocar un trozo grande de algodón en un

recipiente de cristal y empapar con formol (¡Evitar su inhalación directa!).
Introducir al ratón dentro del frasco y tapar. Sacar al ratón cuando este “dormido”,
ponerlo sobre papel toalla y luego empaparlo con alcohol al 70%.
Colocar al animal de espaldas sobre una base de tecnopor adaptada y sujetarlo
a esta con la ayuda de agujas.

Obtención de Macrófagos Peritoneales.

1. Inyectar 5 ml de medio RPMI enriquecido al 2% con suero fetal bovino

(FCS) al peritoneo del ratón y realizar un masaje en el abdomen. (el lugar
del medio, se puede utilizar suero fisiológico)
2. Cortar con tijeras la piel por la línea media con cuidado de no cortar la
membrana peritoneal. Retirar la piel tirando de los extremos hacia los
lados.
3. Con las pinzas sujetar la membrana peritoneal. Sin dejar de soltar la
membrana (para evitar que salga líquido) y con la otra mano, hacer un
pequeño corte con las tijeras e introducir una pipeta Pasteur de vidrio por
el orificio. Recoger 3-4 ml de medio y transferirlos a un tubo de 15 ml.
Rotular el tubo como “Macrofagos”.
4. Conservar el tubo con las células en hielo para mantener su metabolismo
al mínimo durante 5 min y luego centrifugar a 1200 rpm durante 5 min
5. Las células se encuentran en un pellet. Descartar el sobrenadante y
resuspender el pellet, sin añadir líquido, dando pequeños golpes con los
dedos en la parte inferior del tubo.
6. Añadir 1 ml de medio RPMI + 2% FCS (o suero fisiológico) y conservar en
hielo hasta realizar el recuento celular y la viabilidad.
7. Realizar tinción Wright con la suspensión y visualizar las células al
microscopio.
Extracción del Bazo y obtención de Esplenocitos.

1. Abrir el peritoneo con las tijeras. Localizar el bazo (de color rojizo) y
extraerlo con unas pinzas, cortando el tejido conectivo.
2. Colocar el bazo en una placa de Petri con 10 ml de medio RPMI + 2%
FCS (o suero fisiológico).
3. Perfundir el bazo para aislar las células. Esto se realiza absorbiendo el
medio de la placa, con una jeringa de 10 ml e introduciéndolo a un extremo
del bazo con ayuda de una aguja y a la vez presionando con unas pinzas,
de modo que las células se liberen y salgan junto con el medio. Repetir
este paso varias veces.
4. Recoger la suspensión celular (10 ml) y transferirla a un tubo de 15 ml.
5. Conservar el tubo con las células en hielo para mantener su metabolismo
al mínimo durante 5 min y luego centrifugar a 2500 rpm durante 5 min.
6. Eliminar el sobrenadante con una pipeta Pasteur y resuspender las
células en 2 ml de Buffer de Lisis durante 5 min a temperatura ambiente.
7. Detener la reacción, llevando el volumen del tubo a 10 ml con medio RPMI
+ 2% FCS (o suero fisiológico) y luego centrifugar a 2500 rpm durante 5
min.
8. Eliminar el sobrenadante con una pipeta Pasteur, resuspender las células
(esplenocitos) en 10 ml de medio RPMI + 2% FCS (o suero fisiológico). y
conservar en hielo hasta realizar el recuento celular y la viabilidad.
9. Realizar tinción Wright con la suspensión y visualizar las células al
microscopio.

Extracción del Timo.

1. Abrir la cavidad torácica del ratón cortando el esternón en su parte media.

Localizar el timo (órgano grisáceo amarillento). Extraer el timo con unas
pinzas y colocarlo en una placa de Petri conteniendo 10 ml de medio RPMI
+ 2% FCS (o suero fisiológico).
2. Aislar las células del timo con el mismo sistema utilizado para los
esplenocitos del bazo.
3. Recoger 15 ml de la suspensión celular y transferirla a un tubo de 15 ml.
Rotular el tubo como “timo”.
4. Conservar el tubo con las células en hielo para mantener su metabolismo
al mínimo durante 5 min y luego centrifugar a 1200 rpm durante 5 min
5. Las células se encuentran en un pellet. Descartar el sobrenadante y
resuspender el pellet, sin añadir líquido, dando pequeños golpes con los
dedos en la parte inferior del tubo.
6. Añadir 1 ml de medio RPMI + 2% FCS (o suero fisiológico) y conservar en
hielo hasta realizar el recuento celular y la viabilidad.
7. Realizar tinción Wright con la suspensión y visualizar las células al
microscopio.

Extracción de la Medula Ósea

1. Se pueden obtener células de médula ósea de un hueso largo del ratón.
2. Para ello, cortar la pata del ratón desde el fémur y limpiar de piel y de
músculo.
3. Cortar el hueso a la altura de la rodilla y a la altura del cotilo.
 4. Pasar una jeringa de 1 ml con medio RPMI + 2% FCS (o suero fisiológico).
por la parte central del hueso para extraer la médula ósea (zona roja).
5. Utilizar un tubo eppendorf para recogerla y resuspender las células con
ayuda de la micropipeta.
6. Realizar tinción Wright con la suspensión y visualizar las células al
microscopio.

V. Resultados
 Hacer un esquema de los pasos seguidos para desarrollar la práctica y
sacar sus conclusiones de los resultados obtenidos.
 Graficar lo observado en los cortes histológicos.
VI. Cuestionario
1. ¿Cuál es el porcentaje de distribución de los linfocitos T y B en los
ganglios linfáticos, el bazo y el timo?
2. ¿Por qué se procedió a “dormir” al ratón con cloroformo, en vez de
sacrificarlo por desangrado?
3. ¿Qué órganos linfoides y nódulos linfocitarios de ratón pudiste reconocer
en la práctica?
4. ¿Qué es y para qué sirve el medio RPMI + 2% FCS? ¿Mencione otros
medios o soluciones que cumplan la misma finalidad?
5. ¿Para qué sirve y de que está compuesto el Buffer de lisis de eritrocitos?
6. ¿Por qué se utilizó en buffer de lisis solo en la extracción del bazo y
obtención de esplenocitos?
7. ¿Qué tipo de células pudiste reconocer en los frotis con tinción Wright
para: liquido intraperitoneal, bazo, timo y Medula ósea?

VII. Referencias

BAR‐EPHRAÏM, Yotam E.; MEBIUS, Reina E. Innate lymphoid cells in secondary

lymphoid organs. Immunological reviews, 2016, vol. 271, no 1, p. 185-199.

Abbas, A., Lichtman, A. y Pober. J. 2014. Inmunología Celular y Molecular. 5ta edición.
Elsevier, España. ISBN: 9788481747102
 Práctica Nº 3

Fagocitosis in vitro e in vivo

I. Objetivos:

 Demostrar la capacidad de los leucocitos de fagocitar.

 Capacitar al alumno para la observación y determinación de la fagocitosis
in vitro e in vivo

II. Introducción

Varias células tienen la capacidad de ingerir partículas, sin embargo, sólo los
leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (PMNs) y los macrófagos (MFs) lo
hacen “de manera profesional” y esta es su principal función.

Las etapas de la fagocitosis comprenden: quimiotaxis, adhesión, ingestión

(endocitosis), digestión y finalmente la expulsión del material de desecho
mediante el proceso de la exocitosis.

Los monocitos y macrófagos son fagocitos eficientes, al contrario de los

neutrófilos, estos pueden permanecer en el tejido por meses y años, actuando
como verdaderos centinelas.

Entre sus funciones destacan:

 Su alta capacidad fagocítica les permite cumplir un rol importante en la

eliminación de microorganismos, tejidos dañados y contaminantes
particulados.
 Procesan y presentan antígenos vía moléculas de MHC, estimulando, así,
la respuesta mediada por LT.

Los macrófagos son activados por gran variedad de estímulos durante la

respuesta inmune. Una vez activados van a presentar un número mayor de
prolongaciones de membrana, vacuolas, lisosomas, fagosomas y cuerpos
residuales.

En la inflamación, los macrófagos actúan como células presentadoras de

antígenos, potencializando la activación LT y LB por la expresión de moléculas
co-estimuladoras, y liberan citosinas pro-inflamatórias como IL-1, IL-6, IL-12,
TNF-α y quimiocinas. También producen especies reactivas de oxígeno, e
intermediarios reactivos de nitrógeno (óxido nítrico).

En la presente práctica se analizará la fagocitosis in vitro empleando un cultivo

de Candida sp y muestra sanguínea, con el objetivo de analizar la capacidad de
fagocitosis de los neutrófilos y monocitos frente a levaduras. La fagocitosis in
vivo se analizará en ratones, empleando un lisado de E. coli. El cual será
inyectado en el peritoneo del animal. El tratamiento producirá una reacción
inflamatoria que movilizará (y activará) macrófagos al peritoneo. Los ratones
deberán ser adultos (al menos tres meses de edad) y se requerirá varios días
para la correcta activación de los macrófagos.

III. Materiales

Cultivo fúngico (candida albicans)

Cultivo de E. Coli
Ratón
Suero fisiológico (NaCL 0.9%) o PBS
Tijeras, pinzas
Jeringas de 10 ml y agujas
Pipetas Pasteur
Micropipetas y puntas de 50 ul
Tubos Eppendorf
Tubos de 15 ml
Asa de Cohle
Placas Petri
Lamina portaobjetos
Cubreobjetos
Cubeta con hielo
Microscopio óptico

IV. PROCEDIMIENTO

Fagocitosis in vivo:

Preparación del lisado Bacteriano

1. Preparar un tubo de ensayo con 1mL de suero fisiológico y con ayuda del
asa de cohle, tomar una colonia del cultivo de E.coli. (en placa petri con
agar nutritivo) y resuspenderla en el suero hasta obtener una turbidez
correspondiente a la escala N°3 de McFarland.
2. Calentar la suspensión celular a fuego directo con ayuda de unas pinzas,
hasta llegar a ebullición, agitando y evitando que el contenido se proyecte.
3. Dejar enfriar la suspensión celular hasta 37°C.

Infección in vivo de ratones con el lisado bacteriano

1. Con ayuda de una jeringa, inyectar 1mL de suspensión bacteriana

intraperitonealmente al ratón, manteniendo un ángulo de 45°.
2. Realizar masajes suaves al vientre del ratón.
 3. Dejar que el lisado bacteriano incube durante 3 días y volver a inocular la
suspensión bacteriana intraperitonealmente, incubando por 4 días. Anotar
los posibles cambios observados.

Extracción de Macrófagos

1. Inyectar 2mL vía IP de suero fisiológico al ratón.

2. Realizar masajes suaves al vientre del ratón.
3. Sacrificar al ratón.
4. Cortar con tijeras la piel por la línea media con cuidado de no cortar la
membrana peritoneal. Retirar la piel tirando de los extremos hacia los
lados.
5. Con las pinzas sujetar la membrana peritoneal. Sin dejar de soltar la
membrana (para evitar que salga líquido) y con la otra mano, hacer un
pequeño corte con las tijeras e introducir una pipeta Pasteur de vidrio por
el orificio. Recoger todo el líquido posible y transferirlo a un tubo
eppendorf.
6. Realizar la tinción Wright y observar presencia de macrófagos
fagocitando.

Fagocitosis in vitro

1. Preparar una suspensión de C. albicans que se corresponda con el tubo

N°3 en la escala de McFarland.
2. Extraer 2ml de sangre en un tubo con heparina agitar.
3. Posteriormente, en un tubo estéril aparte agregamos 0.5 ml de la sangre
heparinizada y 0.5 ml de la suspensión de C. albicans (relación 1:1).
4. Homogeneizar y colocar en la estufa a 37°C durante 30 minutos.
5. Agitar cada cinco minutos.
6. Sacar el tubo de ensayo de la estufa y realizar un frotis en una lámina
portaobjetos.
7. Colorear la lámina con tinción de Wright.
8. Observar al microscopio óptico bajo lente de inmersión 100X

V. Resultados
 Hacer un esquema de los pasos seguidos para desarrollar la práctica.
 Colocar una foto de la fagocitosis observada.
 Reportar el número de neutrófilos que se vieron fagocitando y el numero
C. albicans en su interior.

VI. Cuestionario

1. Describe a través de un gráfico las fases de la fagocitosis

2. ¿Cómo se pueden clasificar las actividades antimicrobianas en la
fagocitosis?
3. ¿Cómo participan el complemento y los anticuerpos en la opsonización?
 4. ¿Cuál es el objetivo de calentar la suspensión bacteriana hasta ebullición?
5. ¿Por qué se trabaja con un lisado de bacterias y no con bacterias
integras?
6. ¿Qué cambios se observaron en el ratón durante la incubación con el
lisado de bacterias?
7. ¿En qué consiste la escala de McFarland? ¿Cuál es su composición?

VII. Referencias

DU, Chen; CALDERONE, Richard A. Phagocytosis and killing assays for Candida species.
En Candida albicans. Humana Press, Totowa, NJ, 2009. p. 17-26.

JAMES, Philip E.; GRINBERG, Oleg Y.; SWARTZ, Harold M. Superoxide production by
phagocytosing macrophages in relation to the intracellular distribution of oxygen. Journal of
leukocyte biology, 1998, vol. 64, no 1, p. 78-84.

AL-MOKDAD, Maher, et al. Differential production of chemokines by phagocytosing rat

neutrophils and macrophages. Inflammation, 1998, vol. 22, no 2, p. 145-159.

Abbas, A., Lichtman, A. y Pober. J. 2014. Inmunología Celular y Molecular. 5ta edición. Elsevier,
España. ISBN: 9788481747102
 Práctica N° 4

Reacciones de precipitación: difusión radial de Ouchterlony

I. Objetivos

 Analizar la reacción de precipitación por medio de la técnica de difusión

radial.
 Conocer el fundamento de la precipitación y difusión radial.

II. Introducción

Al agregar una Ag soluble progresivamente a un antisuero potente, se forman

precipitados del complejo Ag-Ac que se insolubilizan, el entrecruzamiento de Ag
y Ac da origen a estructuras enrejadas tridimensionales, las que coleasen, en
gran parte a través de la interacción Fc-Fc, para formar grandes agregados que
precipitan (reacción de precipitación), lo que inactiva a los Ag (Fig. 1).

Figura 1 Precipitación

Para una precipitación máxima es necesario que tanto el Ag como el Ac estén

en concentraciones equivalentes, cuando cualquiera de los reaccionantes esta
en exceso no se pueden formar grandes agregados Ag-Ac. A medida que
aumentamos la cantidad de Ag. aumenta la cantidad de precipitado, llegando a
una zona donde esta es máxima (zona de equivalencia) y representa la
proporción molecular óptima de cada reactivo, al seguir aumentando la
concentración de Ag. la cantidad de precipitado vuelve a disminuir, esto es
debido a que ya no hay una relación de equivalencia y los complejos tienen
menores tamaños (Fig.2).
 Figura 2.-Curva de precipitación

Existen diferentes modalidades en las que observamos reacciones de

precipitación, siendo las principales:

 Técnica de precipitación propiamente dicha.

 Técnica de difusión radial de Ouchterlony.
 Técnica de inmunoelectroforesis.
 Técnica de difusión radial simple de Mancini.

Técnica de difusión radial de Ouchterlony

Se lleva a cabo en placas de agar, en las cuales se hace pocillos, en uno de

estos pozos (pozo central) se coloca la muestra a investigar y en el resto se
coloca el anticuerpos preparados frente a la sustancia que se quiere
identificar(fig. 3). Cuando difunden, ambos sistemas se encontrarán y se formará
el complejo Ag-Ac en la zona de equivalencia, que se evidencia por la presencia
de un precipitado que será visible macroscópicamente.

En una preparación que contenga varios antígenos, se obtendrán múltiples

líneas de precipitado. La técnica de Ouchterlony permite identificar sustancias
según la forma de unirse las líneas de precipitación de dos o varios sistemas.
Para visualizar mejor los resultados también podemos utilizar métodos de tinción
con lo que se logrará diferenciar las bandas de mejor manera.
 Fig.3Placa de agar con pozillos

III. Material
 Placa de Petri
 Cinta aislante
 Pipeta Pasteur
 Tubos eppendorf
 Fiolas de 50ml
 Micropipetas y puntas de 50 y 100ul
 Agarosa
 Anticuerpo
 Antígeno

Procedimiento

1. Se preparan 2% Agarosa.
2. Calentar la preparación en un microondas hasta que la agarosa esté
completamente disuelta. Esto suele producirse cuando la solución
alcanza 100ºC.
3. Colocar 15 ml (aproximadamente) de esta solución caliente en las placas
Petri, hasta una altura de 1 a 2 mm.
4. Dejar que solidifique la agarosa, aproximadamente 20 minutos.
5. Perfore la placa con el extremo más ancho de una pipeta Pasteur,
distribuya los agujeros alrededor de un pozo central (3 mm de diámetro
aproximadamente), en donde se colocará el anticuerpo, el antígeno se
coloca en pequeños pozos laterales. Se debe mantener una distancia de
aproximadamente 0.5 cm entre pozo y pozo.
6. Marcar cada pocillo por debajo de la placa siguiendo el modelo de la
figura.
7. Preparar hematíes al 2,4,6 y 8 % (Ag) para los pozos y extraer el plasma
de la muestra problema.
8. Colocar 50ul de cada reactivo en sus respectivos pocillos. Cubrir la placa
y una vez que se hayan absorbido los reactivos en el gel, sellar la placa
de Petri con cinta aislante.
9. Dejar la placa incubando a temperatura ambiente durante 24−48 horas.
 10. Examinar las líneas de precipitación.

IV. Resultado

Hacer un esquema de los pasos seguidos para desarrollar la practica

V. Cuestionario

1. Mencione técnicas que utilicen el principio de inmuno-precipitación para

detectar la unión específica entre el antígeno y el anticuerpo.
2. Indique las diferencias y semejanzas de la precipitación en medio
semisólido (gelosado) y en medio líquido.
3. ¿Cuáles son los factores que influyen en la aparición de las bandas de
precipitación?
4. ¿Cuáles son las leyes de física que rigen la difusión de las macromoléculas?
5. ¿Qué tipos de bandas de precipitación pueden definirse en el Ouchterlony?
6. ¿La técnica de Ouchterlony es una técnica cualitativa o cuantitativa? ¿Sirve
para analizar muestras simples y/o complejas?

VI. Referencias

HORNBECK, Peter. Double‐immunodiffusion assay for detecting specific antibodies. Current

protocols in immunology, 1991, no 1, p. 2.3. 1-2.3. 4.