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EXTRACCIÓN DE DNA

Objetivo

En esta práctica realizaremos la extracción del ADN de células animales poniendo de


manifiesto su estructura fibrilar y el extraordinario grado de enrollamiento, que permite el
empaquetamiento en el núcleo celular de larguísimas cadenas de esta molécula. Tras la
extracción se realizará una tinción específica del ADN obtenido (Opcional)

Materiales:

 Tejido animal (50 g de hígado de  Pipeta de 5mL


pollo) o 3 choros de mar fresco  Probeta de 100mL
(Usar solo el manto del choro)  Vaso de precipitado de 250 mL
 - Mortero o batidora o mix (sujeto a  Varilla de vidrio
si existe licuadora en el laboratorio  Láminas y laminillas
o a que lleven los alumnos  02 embudos por mesa
licuadora, será confirmado)  Pipeta Pasteur
 Arena fina si se usa mortero
 Gasa para filtrar
 Tijera

Reactivos:

 1 Lt de alcohol de 96° helado (dejar en el congelador la noche anterior a la


práctica)
 ClNa 0,2mM
 SDS al 20% (Sodio Dodecil Sulfato) o cualquier otro detergente, inclusive puede
ser Woolite o Ariel liquido). Por confirmar si existe SDS en el laboratorio.
 Ablandador de carne

Fundamento

El ADN se encuentra en el interior del núcleo celular, disperso y muy replegado, unido a
proteínas para formar la cromatina. Así, para extraerlo será necesario homogeneizar el
tejido y romper las células para separar el núcleo, romper también la envoltura nuclear
para liberar su contenido, luego separar el ADN de las proteínas que lo protegen y, por
último, precipitarlo para extraerlo de la solución. Una vez realizado esto, el ADN
aparecerá como un agregado de fibras blanquecinas que se adhieren a la varilla de vidrio.
Por último, se puede situar sobre un porta, teñirlo con un colorante básico y observarlo al
microscopio.

Procedimiento

Triturar en frío la muestra de hígado o el choro de mar en el mortero junto con arena o
mediante la batidora para homogeneizar el tejido. Este procedimiento rompe muchas
células liberando su contenido. Parecer ser más eficaz el empleo de una batidora, con la
que se obtiene una mezcla más homogénea y fácil de filtrar después.
Añadir unos 50 ml de agua destilada, y remover suavemente pero mezclando a fondo.

Filtrar varias veces el resultado a través de un pedazo de tela de gasa. Este filtrado es
lento y difícil, pero se retendrá los restos de tejido.

Medir el volumen del filtrado final y añadir a este filtrado resultante un volumen igual de
solución de NaCl 0,2mM. Esta solución, provoca un choque osmótico que es capaz de
romper algunas membranas no afectadas por el tratamiento anterior. Además, las cargas
positivas de los iones Na+ atraerán luego las cargas negativas del ADN manteniéndolo en
la disolución.

Añadir ahora 5 a 10 mL ml de detergente y mover suavemente, mezclando bien pero


evitando que se forme espuma. Repetir la mezcla varias veces dejando reposar un minuto
cada vez. Si se forma espuma se puede retirar con una esquina de papel de filtro o con un
cuentagotas. Recuerde que el DNA es una fibra muy fina y frágil pues las cadenas son
solo sustentadas mediante puentes de H, entonces el tratamiento debe ser siempre muy
suave.

El detergente completa la rotura de las membranas al disolver y separar los lípidos de las
mismas. También interviene en la separación de las proteínas que rodean al ADN. Pasar
la mezcla a tubos de ensayo de vidrio y llenar hasta aprox. 1/3 del tubo.
Colocar los tubos en una gradilla para poder adicionar una pizca de ablandador de

carne a cada tubo de ensayo para completar la liberación de proteínas. y agitar


suavemente para no romper el ADN. Si es posible volver a filtrar, se obtendrá una
solución más limpia de restos.

Con los pasos anteriores hemos conseguido tener el ADN libre en la disolución acuosa (la
cual contendrá también diversos restos tisulares y celulares en función de la bondad del
filtrado). A continuación hay que separar el ADN haciéndolo precipitar.

Añadir con pipeta 10 ml de alcohol etílico 96% muy frío 0ºC. Se debe dejar escurrir
lentamente el alcohol por la cara interna del tubo cuidando de mantener el tubo inclinado
durante la adición del alcohol. Se formaran 3 fases: el alcohol quedará en la parte
superior, en la intermedia el ADN precipitado y en la inferior los restos de la solución.

Es muy importante evitar que se mezclen ambas soluciones, pues será en la interfase
donde precipitará el ADN.

El ADN irá apareciendo poco a poco en la interfase agua-alcohol en forma de grumos


blancos. Se favorece la precipitación y recolección si se va recogiendo mediante la varilla
de vidrio, u otro instrumento similar, introduciéndola ligeramente bajo la interfase y
haciéndola girar suavemente mientras se extrae. Así se irán pegando en la varilla (puede
funcionar bien para esto una aguja de crochet) unas hebras blancas que corresponden a
miles de fibras de ADN.
Ahora se puede tomar una muestra del ADN recogido, depositarla sobre un porta y teñir con azul
de metileno durante 1 a 3 minutos. Tras limpiar bien el porta, se observa al microscopio.

RESULTADOS

OBSERVACIONES

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

Cuestionario:

1. ¿Cómo se puede cuantificar el ADN de una muestra?


2. Función e importancia del ADN en los organismos.
Lista de materiales y reactivos a ser solicitados para la práctica de Extracción de ADN

Materiales (para cada mesa de práctica, si son 3 mesas multiplicar por 4 cada material):

 02 Mortero o batidora o mix  02 Pipeta de 5mL


 Arena fina si se usa mortero ( Si  02 Probeta de 100mL
 Gasa para filtrar **(alumnos pueden  02 Vasos de precipitado de 250 mL
comprar por mt)  02 Varilla de vidrio
 Tijeras  Láminas y laminillas
 Bisturí, cuchillo, placa Petri para  02 Embudos
apoyar la muestra y cortar

** Gasa puede ser comprada por metro y
cortar cuadrados de 15 x 15 cm, llevar cortado
a la práctica. Como ven en el protocola de la
práctica se usará en varios filtrados.

Reactivos (para cada grupo de Práctica):

 1 L de alcohol de 96° helado (dejar en el congelador la noche anterior a la práctica)


 1 L de ClNa 0,2mM
 100 mL de SDS al 20% (Sodio duodecil sulfato) o cualquier otro detergente de uso en
técnicas de laboratorio de biología, inclusive puede ser Woolite o un sobre pequeño de
detergente líquido Ariel
 Un sobre de ablandador de carne