UNIVERSIDAD POLITECNICA DE PUEBLA

BIOQÍMICA MICROBIANA

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA MICROBIANA

GRUPO BA

PRACTICA #1

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA

AZUCENA PEREZ EDITH

LÓPEZ MALDONADO SARAI
TEPALE HERNANDEZ BRENDA
TEPALE TOMAX BERENICE
VÁZQUEZ PORTILLO R. EDUARDO

QFB. MA GABRIELA ALVARADO CASTILLO

20 DE SEPTIEMBRE DE 2010
 HOJA DE EVALUACIÓN

VALOR CALIFICACION
MAXIMA 10

PORTADA 1

INTRODUCCION 1

OBJETIVO, MATERIAL Y .5
METODOLOGIA

OBSERVACIONES Y ESQUEMAS 1

RESULTADOS 1

DISCUSIÓN DE RESULTADOS 1.5

Y CONCLUSION

REPORTE DE PRACTICA 1

CUESTIONARIO 2

BIBLIOGRAFIA 1

TOTAL 10
INTRODUCCION

Levaduras
Las levaduras son hongos unicelulares. La reproducción asexual es normalmente por gemación.Son muy parecidas a
bacterias macroscópicamente pero son más cremosas y los colores que presentan son blancos, beiges o un poco más
oscuros. Algunas son rosadas o rojas porque tienen carotenoides.La manipulación es muy similar a las bacterias. La
siembra se hace igual que en bacterias. El asa hasta el extremo del tubo y en estría sobre el tubo inclinado.Son ubicuos (en
muchos hábitats). Algunas sólo crecen sobre azúcares, otras sólo sobre mucosas... Al microscopio se ven células de
diferente forma (esférica o alargada) y se debe ver alguna gema (célula con otra al lado o encima).En el interior de la célula
grande se ven estructuras. Dentro se pueden ver vacuolas.El núcleo siempre está muy cercano a la zona donde está la
gema. A más vieja es la célula, mayor es la vacuola.De ancho tienen 2.5 – 10 m y de largo 4.5-21 m.Para identificar una
levadura se parte de cultivos puros.

Se debe tener en cuenta siempre tres características:Morfológicas forma, medida, reproducción asexual, características de
reproducción sexual, características fisiológicas o bioquímicas.

MORFOLOGÍA: Suelen ser esféricos, alargados, medida, color, diámetro.Tienen tendencia a depositarse en el fondo del
líquido o flotar. La mayoría de las levaduras tienen un ciclo de reproducción asexual por gemación. algunas tienen una
reproducción asexual por fisión binaria. Otras levaduras pueden dividirse bipolares o multipolares. Algunas levaduras no
separan la célula hija (gema o blastospora o blastoconidio) y forman pseudomicelio es importante saber si puede o no
formar pseudomicelio para clasificar una levadura.

CARACTERÍSTICAS DE REPRODUCCIÓN SEXUAL: Hay dos células A y a que se multiplican por gemación y siguen su
ciclo asexual. Si se encuentran y son compatibles, inician una reproducción sexual; plasmogamia cariogamia y dan una
célula diploide.Pueden haber células haploides y diploides gemando. Después se dividen meióticamente y dan células
haploides que son genéticamente diferentes. En un momento determinado, si se encuentran, inician un ciclo sexual.

CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS Y BIOQUÍMICAS: Son pruebas que tardan 24-48 horas y que muchas son parecidas a
las de las bacterias.Crecen de 35 a 37ºC.Resistencia a actidiona o ciclohexidina.Fermentación de carbohidratos.Pruebas de
asimilación de carbohidratos. Están muy estandarizadas las pruebas de asimilación. Sólo sirven para identificar algunas
levaduras de interés clínico.

Los carbohidratos son aldehídos o cetonas con grupos hidroxilo que pueden existir como cadenas o anillos. Los
carbohidratos son las moléculas biológicas más abundantes, y presentan varios papeles en la célula; algunos actúan como
moléculas de almacenamiento de energía (almidón y glucógeno) o como componentes estructurales (celulosa en las
plantas, quitina en los animales). Los carbohidratos básicos son llamados monosacáridos e incluyen galactosa, fructosa, y el
más importante la glucosa. Los monosacáridos pueden sintetizarse y formar polisacáridos.

La fermentación normal de la glucosa por la levadura. La fermentaci6n de la glucosa a etanol y anhídrido carbónico por las
levaduras (Saccharomyces cerevisiae) se realiza a través de la vía de la fructosabifosfato. La transformaci6n de piruvato a
etanol implica dos pasos. En el primero se descarboxila el piruvato par la piruvato-descarboxilasa (I) con participaci6n de la
tiaminapirofosfato, formandose acetaldehído; este se reduce a etanol con NADHz mediante la alcohol-deshidrogenasa (2).
OBJETIVO, MATERIAL Y METODOLOGIA

OBJETIVO

Conocer la biología de las levaduras como responsables de la fermentación alcohólica. Observar un proceso fermentativo.
Estudiar las reacciones de la fermentación alcohólica y cuantificar el desprendimiento de CO 2 . Comprobar la formación de
etanol, como producto final de la fermentación. Medir la tasa de fermentación por el incremento de la acidez utilizando
diferentes sustratos.

AGENTES BIOLÓGICOS MATERIAL

 Levadura de cerveza o levadura de pan  6 Matraces o frascos de vidrio de 200 ml

 6 Tapones de goma horadados (del mismo
calibre que la varilla)
REACTIVOS
 6 Pipetas de vidrio de 10 ml
 100 ml de glucosa 0.2 M  Piceta con agua destilada
 100 ml de fructosa 0.2 M  Potenciómetro
 100 ml de maltosa 0.2 M  Balanza analítica
 100 ml de rafinosa 0.2 M  6 Matraces aforados de 100 ml
 100 ml de sacarosa 0.2 M (azúcar de mesa)  6 Vasos de pp. De 100 ml
 Fosfato de amonio  Espátula
 Sulfato de amonio  6 Sacarímetros de Eihörn ó 6 varillas huecas
 Soluciones buffer de pH 4 y 7 (para de vidrio dobladas en forma de Z.(se puede
potenciómetro) sustituir con mangueras de látex o venoclisis)
 Ácido sulfúrico 0.1 N  6 probetas de 100 ml o recipientes graduados.
 Dicromato de potasio  Cuba hidroneumática (sustituir con un recipiente
 Agua de cal de plástico (tupperware) de aprox. 30 cm de
largo X 10 de ancho X20 cm de alto).
 Silicón para sellar las conexiones.

PROCEDIMIENTO

1. Etiquete los frascos de 200 ml con cada una de las soluciones de fructosa, glucosa, rafinosa sacarosa y agua como
control. Adicione a cada frasco la solución que le corresponde de acuerdo a la etiqueta y 0.25g de cada una de las
sales de amonio. En este momento determine el pH de la solución (tiempo 0) y tome una alícuota de 5 ml, guárdela
aparte para realizarle las pruebas de etanol y determinación de azúcares.
2. Añada 1g de levadura seca a cada matraz o frasco.
3. Disuelva bien las levaduras y las sales. Cierre herméticamente con el tapón horadado. Conecte en la horadación el
tubo de vidrio doblado en Z y conecte el otro extremo del tubo con una probeta invertida sobre la cuba
hidroneumática o el recipiente de plástico y llena de agua al igual que el recipiente (ver figura 1.).
6. Mantener los matraces o frascos a temperatura ambiente (15-20 ºC) o en incubadora de 20 a 25ºC

Probeta graduada

Desprendimiento
de CO2

Matraz
fermentador Cuba hidroneumática

Con Barrera de agua

Figura 1. Equipo fermentador para la obtención de etanol preparar uno para cada substrato
MEDICIÓN DE LA ACIDEZ
Determine el pH con el potenciómetro a los tiempos cero (inicial), y 48 (final) hrs.

PRESENCIA DE CO2.

La fermentación empezará cuando se observe un burbujeo, procedente del CO 2. Observar el volumen del gas que se va
acumulando en la parte superior de la probeta e ir anotando cada 30 minutos los valores observados en ml para pasarlos a
una gráfica. Utilizar papel milimétrico y colocar en los ejes los valores de Tiempo (expresado en minutos) en el eje de las
abcisas (X) y Volumen de CO2 (expresado en ml.) en el eje de las ordenadas (Y). Pipetear 5 ml de la solución que aún se
encuentre dentro de la probeta (después de 3 hrs. o 48 hrs.) y que haya estado en contacto con el gas, es decir, del líquido
de barrera. Añadir gota a gota una solución de agua de cal acidulada (1.0 mL de HCl 4.0M y una pizca de CaCO3). Un
precipitado blanco nos indica la presencia de CO2, enturbia el agua de cal.

PRESENCIA DE ETANOL.

1.- Preparar una solución alcohólica al 10% en masa añadiendo agua a 6.5 cm 3 de alcohol al 96% hasta completar un
volumen de 50 cm3.

2.- ESCALA DE REFERENCIA. (Este paso solo lo llevará a cabo un equipo) En una gradilla se colocan 8 tubos de ensayo y,
dejándose el primero vacío, se añade respectivamente una gota, dos, tres, cuatro, cinco, seis y diez de la disolución
alcohólica a los restantes. A continuación se añade 1 cm3 de agua y 0.5 cm3 de la disolución sulfocrómica a cada tubo,
agitando y dejando reposar. Después de unas horas se puede observar que, a partir del tubo que contiene cinco gotas de la
disolución alcohólica, se ha producido un viraje completo de naranja claro a azul mientras que en los otros tubos aparecen
tonalidades que varían del naranja oscuro al verde azulado.

Anote sus observaciones, si es necesario, tome fotografías para su reporte.

3.- TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS. En una gradilla se colocan en tubos diferentes, 0.5 ml de los respectivos
substratos, se añade 1 ml de agua y 0.5 ml de mezcla sulfocrómica a cada uno comparando con las tonalidades de la
escala. Calentar (solamente si no ha aparecido coloración verde) 10 minutos a baño María para acelerar la reacción, en
presencia de alcohol, debe formarse un compuesto aromático característico, y se pone de manifiesto porque cambia de
color de amarillento a verdoso lo cual indica que existe etanol. Determinar la presencia de etanol con la prueba sulfocrómica
a los tiempos cero (inicial), y 48 (final) hrs.

PRECAUCIONES. Hay que evitar el contacto del dicromato potásico con la piel y, sobre todo, hay que tener gran cuidado
en el manejo del ácido sulfúrico (la disolución sulfocrómica adquiere una temperatura considerable) y operar en el orden
indicado.

NOTA: Cuando la reacción se realiza sin que haya un gran exceso de alcohol (gotas de disolución alcohólica al 10%) su
curso es muy lento, lo que probablemente se debe a que el etanal continúa oxidándose a ácido acético y el dicromato sigue
reduciéndose a Cr3+.

PREPARACIÓN DE LA MEZCLA SULFOCRÓMICA: Se prepara en un Erlenmeyer una disolución añadiendo 2.5 g de

dicromato potásico en 39.5 cm3 de agua y adicionar a continuación 10 cm 3 de ácido sulfúrico concentrado.

Presencia de Azúcar
Tomar 5 ml de la muestra de cada solución de azúcar antes de añadirle la cepa de levaduras.

Determinar la presencia de azúcares reductores con la prueba de DNS a los tiempos cero (inicial), y 48 (final) hrs.

DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES.

FUNDAMENTO. Los azúcares reductores pueden reducir al ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) bajo determinadas condiciones.

Reactivo.

Preparación del DNS

Para preparar 500 ml del reactivo:

 150 g de tartrato de sodio-potasio tetrahidratado (4.H2O)

 5 g de 3.5-dinitrosalisílico (DNS)
 8 g de NaOH

1. Primero forras con aluminio un vaso de precipitado de 500ml, disuelves en 300 ml de agua destilada el tartrato de
Na-K, y lo tapas con una tapa de plástico (aluminio no porque se te deshace), luego de unos 30 min o que más o
menos ya se haya disuelto esta base, agregas el DNS y lo dejas que se disuelva (toma una coloración naranja y
tiene un aspecto como de leche cortada) durante 1 hora. Si todavía observas muchos sólidos puedes agregar 50 ml
más de agua destilada.
2. Aparte, en un matraz de aforación de 100ml, agregas los 8 g de NaoH y agregas el agua destilada. Esta solución
la agregas a la preparación anterior; toma una coloración naranja transparente. Deja a que se disuelva
perfectamente y no haya sólidos presentes.
3. Una vez lista tu solución, la agregas a un matraz de aforación de 500ml (forrado con aluminio antes de la marca de
aforación) y la aforas.
4. Tu solución la guardas en un frasco ámbar forrado con aluminio, lejos de la luz solar y el calor.

Metodología
1. En un tubo colocar 500 L de la muestra, agregar 500 L de DNS y agitar.
2. Colocar el tubo o tubos en un baño en ebullición durante 5 min exactos e inmediatamente colocarlos en un baño de
agua muy fría durante 5 min.
3. Agregar a cada tubo 5 ml de agua destilada y agitar
4. Leer a 540 nm

De preferencia los debes de leer inmediatamente, si los lees después de 30-40 min los valores pueden cambiarte y darte
falsos positivos.

NOTA: Si las muestras salen muy negras después de la ebullición por 5 min, puedes hacer diluciones de tu muestra y de ahí
tomar los 500 L ó agregar menos muestra, es decir, en lugar de 500L puedes agregar 450, 400, 100, 50, etc., y completar
con agua destilada y, agregar siempre los 500 L de DNS. Siempre debes de tener 1ml en total.

Curva de calibración.

Elaborar una solución patrón pesando 2.0 g de glucosa y aforando a 1 L. Esta solución tendrá una concentración de 0.002 g
/ml .

Preparar una serie de tubos como se indica a continuación:

Concentración. Tubos Agua (µl) Solución std. DNS (µl)

de Glu (µl)
g/L

1 500 0 500

2 400 100 500

3 200 300 500

4 100 400 500

5 0 500 500

Completar
 Determinar la concentración de Glucosa en cada tubo
 Graficar la curva de calibración (concentración vs. Absorbancia)
 Obtener la ecuación del gráfico
 Obtener la r2
 Esquemas Observaciones calculos y Resultados

Fructosa Maltosa

9.09 8.2 Inicail

pH

3.86 2.9 Final

Potenciómetro : Intrumento para medir el pH

Con este instrumento se midio el pH de los dos

sustratos en el tiempo inicial(0 h) sin levadura y al
tiempo final (48 h) despues de la fermentacion,

Pruebas Fructosa Maltosa

Organolépticas

CO2(volumen del gas

Aproximadamente .5 Aproximadamente .5
visto por el ojo
cm3 cm3
humano)

Olor Pulque Leche cortada

Turbidez poco turbia Muy turbia

Sedimento poco mucho

Fermentacion de maltosa y fructosa

El olor, turbidez, sedimentos y nivel de CO2

Escala de reportado fue en base a los sentidos de la mayoria
de los integrantes del equipo.
referencia.
Etanol

Determinación Fructosa Maltosa

0 0 inicial
Etanol aprox
(%)
6 2 final
 Prueba de CO2 Gotas de agua de cal
Prueba de CO2
adicionadas
despues de 24hrs se
Fructosa 10 adiconaron las gotas
de agua de cal. Tubo
Maltosa 20 izquierdo maltosa.
Tubo derecho fructosa

Tubos con prueba de Tubos con prueba de Tubos con prueba de

azucares reductores. DNS azucares reductores.
En baño maria. midiendo.

Concentración Absorbancia Glucosa

0 0.084 1.4
y = 0.2405x - 0.3311
0.8 0.305 1.2 R² = 0.9736

1.2 0.687333333 1

1.6 0.827333333 0.8

Glucosa
2 1.161333333 0.6
Linear (Glucosa)
0.4

0.2

0
0 2 4 6 8
-0.2
Concentración Absorbancia
Glucosa
0 0.13
0.14
0.021 y = -0.0151x + 0.0825
0.8 0.12 R² = 0.0571
1.2 0.016 0.1
0.08
1.6 0.066 Glucosa
0.06
2 0.095 Linear (Glucosa)
0.04
0.02
0
0 1 2 3

Calculando las concentraciones de cada tubo, y graficándolas contra la absorbancia obtenida de ellas, se
obtuvieron las ecuaciones:

y = 0.240x - 0.331 con R² = 0.973

y = -0.015x + 0.082 con R² = 0.057

A partir de la cual se calcularon las concentraciones para las diferentes muestras, esto despejando X y
substituyendo las absorbancias en Y.

Concentración de Glucosa en cada tubo:

Absorbancia Absorbancia [Glucosa] [Glucosa] [Glucosa]

Muestra t0 t48 t0(g/L) t0(g/L) t0(g/L) [Glucosa] t48(g/L)
Maltosa 1 2.624 1.745 Primera ecuación Segunda ecuación
Maltosa 2 2.623 1.747 y = 0.240x - 0.331 y = -0.015x + 0.082
Maltosa 3 2.626 1.747 x=(y+ 0.331)/ 0.240 x=(y- 0.082)/ -0.015
Maltosa T 2.62433333 1.74633333 11.0726389 8.65555556 -169.488889 -110.955556
Fructosa 1 2.735 1.419 Primera ecuación Segunda ecuación
Fructosa 2 2.731 1.418 y = 0.240x - 0.331 y = -0.015x + 0.082
Fructosa 3 2.73 1.418 x=(y+ 0.331)/ 0.240 x=(y- 0.082)/ -0.015
Fructosa T 2.732 1.41833333 12.7625 7.28888889 -176.666667 -89.0888889
Nota: Para medir la absorvancia de la solución de maltosa se tubo que hacer una dilucion 2-1
Para la preparación de soluciones se realizaron los siguientes calculos

Fructosa 100ml .2mol 180g 3.6g

1000ml 1mol
Maltosa 100ml .2mol 342g 6.84g
1000ml 1mol
DISCUSIÓN DE RESULTADOS Y CONCLUSION

Al momento de armar de quitar el sistema se presento un problema para medir el CO 2 producido(en volumen)
debido a que se tenian que voltear los frascos y en ese momento el gas se escapaba, así que solo lo que se
logro ver fue reportado en ml, también se midio el CO 2 disuelto en agua debido al poco gas visto en la barrera
hidroneumática, para realizar la prueba de los azucares reductores la solución de maltosa se tubo que diluir 2-
1 ya que al tratar de medirla el espectofotometro marcaba que era mayor a 3.5

En esta practica se pudo observar cual fue el mejor sustrato para poder llevar acabo una buena fermentacion
alcoholica , en este caso utilizamos dos sustratos que fueron: maltosa y fructosa, con la levadura
Saccharomyces cerevisiae(utilizada para la fabricación del pan); al medir el porcentaje de etanol se pudo
observar que el de fructosa fue el que obtuvo mayor porcentaje, tambien presento en mayor cantidad CO2
(disuelto en agua) y en la prueba de azucares los resultados fueron acorde a lo anterior, con esto se concluye
que la fructosa es mejor sustrato para la produccion de etanol que la maltosa

CUESTIONARIO.

1. ¿Cuál de los sustratos es mas rápidamente fermentado por la levadura?

La fructosa
2. ¿Cómo esperaría que fueran los niveles de acidez después de 8 y 12 horas adicionales de fermentación?
Bajando continuamente
3. ¿Cuáles son los productos que se generan durante un proceso de fermentación, cuales de ellos se
mantienen?
CO2 este gas es liberado
etanol es el producto que se mantiene

4. Menciona las preferencias de sustratos de las levaduras utilizadas industrialmente en la producción de 3

bebidas alcohólicas diferentes.
Sustratos Bebida

cebada y otros cereales cerveza

arroz sake

jugo de manzana sidra

jugo de uva vino

cebada whisky escocés*

malta, trigo, centeno, avena whisky irlandés*

maíz whisky americano (bourbon)*

caña de azúcar ron*

granos triturados, con saborizantes de semillas de enebro, anís, etc. ginebra*

grano o papa, aromatizado con semillas de alcaravea aquavit*

 grano o papa, sin saborizantes vodka*

jugo del cactus Agave tequilana tequila*

uvas blancas de Cognac, Francia coñac*

frutas variadas brandy*

jugo de cerezas kirsch*

* bebidas destiladas

5. Investigar los fundamentos y cada una de las reacciones de identificación de los productos y del
substrato.

La reacción del dióxido de carbono con el agua de cal apagada (disolución de hidróxido de calcio en
agua) es un proceso químico en el que se origina carbonato de calcio, una sustancia insoluble de color
blanco, que enturbia el agua de cal, dándole a ésta un aspecto lechoso. Con el tiempo, el carbonato de
calcio precipita en el fondo del recipiente formando un deposito de color blanco

La determinación de azucares reductores se realiza utilizando el método calorimétrico de Acido

Dinitrosalicílico (DNS). Este método se selecciona por ser rápido y reproducible. La concentración se
obtiene a partir de la recta obtenida al realizar la curva de calibración, que correlaciona la Absorbancia
medida a 540 nm con la concentración de Glucosa. Los patrones son preparados con D-Glucosa de
Merck

6. ¿Qué métodos conoce para determinar etanol?. Indique los principios en que se basa cada uno de
ellos y sobre qué tipo de muestras se aplica cada uno (sangre, aliento, alimentos, bebidas).

“Breathalyzer” (Breath= respiración, Analyse = análisis), que basa su funcionamiento en la relación que
existe entre la cantidad de alcohol ingerido, que se manifiesta en el aliento, y su correlativa proporción en
la sangre (Borkenstein, 1962). El método consistía en realizar una profunda espiración a través de un
pequeño tubo; el aliento burbujeaba en una ampolla que contenía una disolución ácida (ácido sulfúrico
50%) de dicromato de potasio (0,25%) con nitrato de plata (0,25%) como catalizador, y se comparaba
colorimétricamente mediante dos fotocélulas el cambio de color de la disolución con una ampolla de
referencia sin abrir, que es directamente proporcional a la cantidad de alcohol en la muestra de aliento. El
método permitía medir la concentración equivalente de alcohol en sangre en tiempo real

La tecnología actual utiliza sistemas de medida de IR que son más específicos para el etanol utilizando
filtros ópticos. Se determina el nivel de etanol en el aire pasando, a través de la muestra de aliento, una
estrecha banda de luz IR, elegida por su absorción especifica para el etanol

La muestra de sangre se toma de la sangre venosa en la vena cubita del brazo o de sangre de un capilar
en el dedo o lóbulo de la oreja. La muestra se deposita en un recipiente, se lleva a un laboratorio y se
analiza por cromatografía de gases, con espaciadores de cabeza
Determinación de etanol en muestras de alimentos. Método Enzimático / UV

Fundamento

El etanol es oxidado a acetaldehído en presencia de la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) por

nicotinamida / adenina dinucleótido (NAD).

Etanol + NAD+ acetaldehído+ NADH + H+

El acetaldehído formado puede ser desplazado totalmente hacia la derecha en condiciones alcalinas
atrapando el acetaldehído formado.

El acetaldehído es oxidado en presencia de aldehído deshidrogenasa (Al DH) cuantitativamente a ácido

acético

Acetaldehído + NAD+ + H20 ácido acético +NADH + H*

NADH es determinado por la medida de su absorbancia a 334, 340 ó 345 nm.

(a) Determinación del etanol en el vino.

La concentración de etanol en el vino tinto y blanco en general se puede determinar sin tratar la muestra
(salvo mediante dilución, según la tabla de dilución). Normalmente, los vinos con 10-15 % (v/v) de etanol, una
dilución de 1:1,000 y volumen de muestra de 0,1 mL es adecuado.

(b) Determinación del etanol en la cerveza, sidra y zumos de fruta con alcohol.
Después de eliminar el dióxido de carbono aumentando el pH de la solución a un valor aproximado de 9,0 con
2 M NaOH y agitando suavemente, diluya y analice la muestra según la tabla de dilución. Normalmente, las
bebidas con 3-8 % (v/v) de etanol, una dilución de 1:500 y volumen de muestra de 0,1 mL es adecuado.

(c) Determinación del etanol en cervezas sin alcohol y con bajo contenido de alcohol y otras bebidas.
Después de eliminar el dióxido de carbono aumentando el pH de la solución a un valor aproximado de 9,0 con
2 M NaOH y agitando suavemente, diluya y analice la muestra según la tabla de dilución. Normalmente una
dilución de 1:50 y un volumen de muestra de 0,1 mL es adecuado.

(d) Determinación del etanol en bebidas alcohólicas (whisky, brandy, etc).

La concentración de etanol en las bebidas alcohólicas en general se puede determinar sin tratar la muestra
(salvo mediante dilución, según la tabla de dilución). Sin embargo, será necesario realizar los dos pasos
necesarios de dilución. Normalmente, las bebidas con 30-60 % (v/v) de etanol, una dilución de 1:10000 y
volumen de muestra de 0,1 mL es adecuado.

(e) Determinación del etanol en el zumo de fruta, concentrados y bebidas similares.

La concentración de etanol en soluciones claras y neutrales en general se puede determinar sin tratar la
muestra (salvo mediante dilución, según la tabla de dilución). Cuando se utilice sin diluir, el pH de las
soluciones ácidas se debe aumentar a un valor de 9,0 aproximado con 2 M NaOH. Los líquidos turbios en
general solo hay que filtrarlos antes de la fase de dilución. Las soluciones coloreadas en general se
pueden utilizar para el análisis después de diluirlas en una concentración adecuada de etanol. Sin embargo, si
las soluciones coloreadas requieren un análisis sin diluir, se pueden decolorar de la siguiente forma: trate la
solución con polivinilpolipirrolidona (PVPP) o carbón activado a 2 g/100 mL y filtrelo en papel Whatman No. 1.
Normalmente, no se requiere dilución y serán necesarios volúmenes de muestra de hasta 0,5 mL.

(f) Determinación del etanol en alimentos sólidos (como en chocolates rellenos de licor).
Homogenice los alimentos sólidos (~ 10 g) utilizando un mortero u homogeneizador si fuera necesario. Añada
2 g de material representativo a 50 mL de agua sin etanol y remueva durante 30 min en una botella Duran®
sellada (caliente a 60°C si fuera necesario). Enfríe el extracto (si fuera necesario) y trasládelo
cuantitativamente a un matraz de 100 mL. Diluya hasta la marca con agua sin etanol. Filtre la solución
turbia, diluya si fuera necesario (según la tabla de dilución) u analice. Normalmente una dilución de 1:10 y un
volumen de muestra de 0,1 mL es adecuado.

(g) Determinación del etanol en el vinagre.

En general, para analizar el vinagre solo hay que filtrar y diluir antes del ensayo. Sin embargo, el pH de las
muestras que se tienen que analizar sin diluir se debe aumentar a un valor aproximado de 9,0 utilizando 2 M
NaOH antes de filtrar. Normalmente una dilución de 1:20 y un volumen de muestra de 0,1 mL es adecuado.
(h) Determinación del etanol en la mermelada.
Pese con precisión aproximadamente 5 g de material representativo en una botella Duran® de 100 mL y
extraiga con 50 mL de agua sin etanol, agitando durante 30 min a 60°C (con la botella sellada). Enfríe el
extracto, y si está ácido, ajuste el pH a 9,0 utilizando 2 M NaOH. Traspase cuantitativamente la solución a un
matraz de 100 mL y llénelo hasta la marca con agua sin etanol. Filtre la solución turbia, diluya si fuera
necesario según la tabla de dilución. Normalmente, no se requiere dilución y serán necesarios volúmenes de
muestra de hasta 0,5 mL.

(i) Determinación del etanol en la miel.

Pese con precisión 10 g aproximados de material representativo y échelos en un matraz de 100 mL con 40 mL
de agua sin etanol, tapando el matraz inmediatamente. Disuelva la miel removiendo suavemente a 60°C
durante 10 min. Después de 11 enfriare, llene el matraz hasta la marca con agua sin etanol. Filtre la solución
turbia, diluya si fuera necesario según la tabla de dilución. Normalmente, no se requiere dilución y serán
necesarios volúmenes de muestra de hasta 0,5 mL.

(j) Determinación del etanol en los productos lácteos.

Pese con precisión aproximadamente 10 g de material representativo en una botella Duran® de 100 mL y
extraiga con 50 mL de agua sin etanol, agitando durante 30 min a 60°C (con la botella sellada). Enfríe el
extracto y traspase cuantitativamente la solución a un matraz de 100 mL y llénelo hasta la marca con agua sin
etanol. Filtre la solución turbia, diluya si fuera necesario según la tabla de dilución.
Normalmente, no se requiere dilución y serán necesarios volúmenes de muestra de hasta 0,5 mL.

7.- ¿ Que diferencia hay en el metabolismo (en los seres humanos) del metanol y del etanol?

Metabolismo del etanol en los seres humanos

La degradación catabólica del etanol es esencial para la vida, no sólo de seres humanos, pero de casi todos
los organismos vivos. De hecho, ciertas secuencias del aminoácido en las enzimas usadas para oxidar el
etanol se conservan hasta el final de nuevo a las bacterias unicelulares. Tal funcionalidad es necesaria porque
todos los organismos producen realmente el alcohol en cantidades pequeñas por varios caminos, primario
entre ellos síntesis del ácido graso.

De muchas maneras, el metabolismo del alcohol se liga íntimo al camino del carbohidrato/de la glucosa. El
alcohol entra en el camino glicolítico normal hacia el final del normal glicolisis camino como Acetilo-CoA. Esto
es típico en sistemas metabólicos - si la glicolisis podría procesar solamente glucosa, el organismo tendría
cantidad inadecuada de energía. Por lo tanto, el cuerpo ha desarrollado muchos importantes caminos para
convertir ciertos productos químicos en energía (ATP), por ejemplo el etanol.

Metabolismo del metanol en los seres humanos.

El alcohol metílico se absorbe por todas las vías (oral, dérmica y respiratoria), aunque la absorción por piel
difícilmente pueda dar lugar a intoxicaciones agudas. Con frecuencia se plantea el problema bajo la forma de
intoxicación crónica. Su carácter irritante genera frecuentes lesiones de entrada, muy típicas en la
contaminación crónica por vía respiratoria, como bronquitis crónicas, frecuentemente con componentes
asmatiformes, y alteraciones en la mucosa de las vías respiratorias altas. Esta vía de absorción es propia de
los lugares de trabajo.

Una vez absorbido se dirige al hígado donde sufre procesos de oxidación a una velocidad 7 veces menor
comparada con las del alcohol etílico o etanol. La enzima responsable de su transformación es la alcohol
deshidrogenasa que lo oxida a formaldehído y éste a su vez es oxidado a ácido fórmico por la aldehído
deshidrogenasa.

La eliminación se realiza lentamente por vía respiratoria a través de los pulmones, pudiendo permanecer en el
organismo hasta 4 días después de una dosis única. Alrededor de 3 a 5% se elimina sin metabolizar.

Intoxicación aguda

La vía más frecuente de absorción en una intoxicación aguda es la digestiva. La dosis letal varía entre 20 y
100 ml aunque algunos autores informan dosis letales de 240 ml. La muerte por metanol va siempre precedida
de ceguera. Se sabe que incluso 15 ml de metanol han causado ceguera y el responsable de ello es el
formaldehído.

El alcohol metílico se absorbe por todas las vías (oral, dérmica y respiratoria), aunque la absorción por piel
difícilmente pueda dar lugar a intoxicaciones agudas. Con frecuencia se plantea el problema bajo la forma de
intoxicación crónica. Su carácter irritante genera frecuentes lesiones de entrada, muy típicas en la
contaminación crónica por vía respiratoria, como bronquitis crónicas, frecuentemente con componentes
asmatiformes, y alteraciones en la mucosa de las vías respiratorias altas. Esta vía de absorción es propia de
los lugares de trabajo.

El metanol se distribuye rápidamente en los tejidos de acuerdo al contenido acuoso de los mismos. El
volumen de distribución es de 0.6 l/Kg de peso. La mayor parte del metanol circula en el agua plasmática.

Una vez absorbido se dirige al hígado donde sufre procesos de oxidación a una velocidad 7 veces menor
comparada con las del alcohol etílico o etanol. La enzima responsable de su transformación es la alcohol
deshidrogenasa que lo oxida a formaldehido y éste a su vez es oxidado a ácido fórmico por la aldehído
deshidrogenasa.

La eliminación se realiza lentamente por vía respiratoria a través de los pulmones, pudiendo permanecer en el
organismo hasta 4 días después de una dosis única. Alrededor de 3 a 5% se elimina sin metabolizar.

8.- Investiga al menos un metodo para determinar metanol en bebidas alcoholicas.

Cromatografía de gases para la identificación y cuantificación de metanol en bebidas alcohólicas. Este método
se basa en los principios de la cromatografía de Gases y consiste en la inyección de una pequeña cantidad de
la muestra (constituída por una mezcla de sustancias volátiles) en el inyector de un Cromatógrafo de Gases
en el que son vaporizadas y transportadas por un gas inerte a través de una columna empacada o capilar con
un líquido de partición que presenta solubilidad selectiva con los componentes de la muestra, ocasionando su
separación.

NMX-V-021-1986. BEBIDAS ALCOHÓLICAS DESTILADAS. DETERMINACIÓN DE METANOL.

DISTILLATED ALCOHOLIC BEVERAGES. DETERMINATION OF METHANOL. NORMAS MEXICANAS.
DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS.

Esta Norma establece dos métodos para determinación de metanol en bebidas alcohólicas destiladas. Método
químico y método cromatográfico (cromatografía de gases).

REFERENCIAS

 Beuchat LR. 1997. Traditional fermented foods. pp. 629 – 648 en: Food Microbiology. Fundamentals
and Frontiers..
 Collins CH et al. 1999. Collins and Lyne’s Microbiological Methods. 7º ed. Butterworth-Heinemann,
Oxford, cap. 5 y 9.
 Deák T. 1992. Experiences with the Deák and Beuchat simplified identification scheme for food borne
yeasts. pp. 47-54 en: Modern Methods in Food Mycology. Samson RA et al., ed. Elsevier,
Amsterdam.
 http://www.colpos.mx/bancodenormas/nmexicanas/NMX-V-021-1986.PDF 17-septiembre-2010
20:40 Colegio de postgraduados