Introducción a la Citología (II).

28 mayo 2012Daniel Borràs MúrciaDeja un comentario

La obtención y manejo de muestras.
Existen diversas técnicas de obtención de muestras para estudio citológico: las improntas, la
punción y aspiración con aguja fina (PAAF) y el raspado.
1.- IMPRONTA

Para realizar una impronta, se procede a cortar con bisturí una pequeña porción de un
órgano (tamaño máximo como medio terrón de azúcar), se seca bien una de las superficies
sobre papel absorbente con el fin de eliminar sangre y líquidos tisulares y luego, con
delicadeza, se realizan varios toques con la muestra sobre el portaobjetos.

Técnica de impronta. Se realizan múltiples contactos de la pieza tisular sobre el portaobjetos.

(Imagen cedida por Lamberto Viadel).
Las improntas de los órganos proporcionan muestras de mayor calidad que las AAF, ya
que las células no están sometidas a tantos traumatismos.
La impronta no es aconsejable en lesiones cutáneas superficiales ulceradas porque
habitualmente obtendremos material degenerado y componente inflamatorio o infeccioso
secundario, cuando la información útil está en las capas profundas. Tampoco es aconsejable
para muestrear tejidos fibrosos o de consistencia elevada en general (en este tipo de
lesiones es preferible la técnica de raspado).

2.- ASPIRACIÓN CON AGUJA FINA (AAF).

Es, sin duda, la técnica más utilizada. Supone un mínimo riesgo para el paciente. Apenas se
produce dolor o infecciones secundarias. Se puede aplicar tanto a masas externas como a
órganos internos, incluso se puede aplicar a lesiones de hueso. Se necesita una aguja fina de
calibre 22, 23 (azul) o 25G (naranja, de insulina). En función de la cantidad de material
obtenido o de la contaminación hemática escogeremos uno u otro. O varios para una misma
lesión. Utilizaremos jeringas de5 a10 ml (aunque según la masa a aspirar también se pueden
emplear hasta las de 20 ml).
 Técnica de punción-aspiración con aguja fina (PAAF).
(Imagen cedida por Lamberto Viadel).

Para las masas superficiales, no es necesaria una preparación aséptica y generalmente no se

necesita afeitar aunque se puede limpiar la zona con suero fisiológico o alcohol. Se sujeta
bien la masa con una mano y con la otra se clava la aguja unida a la jeringa y se aspira con
el émbolo varias veces. Para intentar que la muestra sea lo más representativa posible, sin
sacar la aguja, es conveniente reorientarla dentro de la masa (sin aspirar en este momento)
y repetirla operación. Antes de retirar la aguja, interrumpimos la aspiración, separamos la
jeringuilla y luego sacamos la aguja de la masa, con el fin de no aspirar material no
deseado, como sangre, que nos pueda contaminar la preparación.

Lo normal es que se aspire poco material, que no se haga visible en la jeringa.

Acontinuación juntamos la aguja a la jeringa y presionamos el émbolo para expulsar el
contenido sobre varios portaobjetos. Después realizaremos un frotis o extensión de la
muestra como si se tratara de un frotis sanguíneo. En las muestras delicadas, donde se
puede producir rotura celular (como en los aspirados de los ganglios linfáticos), se
recomienda hacer la extensión con un cubreobjetos en lugar de utilizar otro portaobjetos.

Técnica de PAAF. Con la base de la aguja ocupada por material detenemos la aspiración y
podemos retirar la aguja.
(Imagen cedida por Lamberto Viadel).
Una variante de la AAF consiste en incidir la aguja solamente sin aplicar posteriormente la
jeringa. El material se introduce en la aguja por capilaridad. Es igualmente conveniente
reorientar la aguja en varias direcciones para intentar que la muestra sea representativa.
Con esta variante la contaminación sanguínea es mucho menor, por lo que se aconseja
utilizar en órganos como el hígado, bazo, riñón, tiroides y tejidos o lesiones vasculares en
general.

En otras ocasiones no se obtiene material del aspirado, como por ejemplo en el caso de
masas fibrosas, las cuales exfolian pocas células («aspirados secos»). En estos casos se
pueden utilizar agujas de mayor calibre como 21G (verdes) ó 20G (amarillas). Pero la
contaminación sanguínea, en los aspirados de aguja con estos calibres, suele ser mayor. En
las masas fibrosas o, en general, cuando obtenemos aspirados secos es preferible la técnica
del raspado, siempre que se pueda aplicar, ya que proporciona mayor número de células
(véase más adelante). Si al aspirar una lesión se obtiene líquido, se depositará en un tubo
con EDTA (ácido etilendiaminotetracético) para prevenir la coagulación de la muestra.

Extensión a partir de aspirados de masas sólidas:

Una vez depositada la muestra sobre un portaobjetos, se extiende como si se tratara de un
frotis sanguíneo. Debemos hacerlo con delicadeza para no dañar las células. Generalmente
se necesita cierta práctica para conseguir extensiones de calidad. La extensión debe
distribuir las células en una capa fina monocelular, que favorecerá su tinción y posterior
examen y no debe ocupar toda la longitud del portaobjetos (como máximo 2/3 de la longitud
del mismo).

La extensión del material celular con un hisopo está absolutamente contraindicada por el
daño celular que provoca.

Extensión a partir de fluidos corporales.

La extesión debe realizarse lo antes posible. Si es posible se toman las muestras en tubos
con EDTA. La preparación se puede hacer directamente sobre un portaobjetos como si fuera
un frotis sanguíneo. Pero si no hay suficientes células en la preparación, se debe centrifugar
el líquido durante 5 min a 1.000-1.500 r.p.m., el sobrenadante se elimina casi en su
totalidad, el sedimento que nos queda se agita suavemente y se coge una gota pequeña
para examinarla.

3.- RASPADO

Generalmente se aplica sobre lesiones externas o masas fibrosas, aunque también se

puede hacer de órganos. El raspado proporciona mayor número de células quela AAFy que
las improntas. Se realiza con una hoja de bisturí pasándola sobre la superficie a examinar,
sucesivamente y en un mismo sentido. Con el material que queda sobre la hoja del bisturí se
extiende en una capa fina sobre uno o varios portaobjetos. Presenta como gran
inconveniente que en la mayoría de los casos recoge exclusivamente células superficiales o
células inflamatorias. Si el raspado es muy enérgico podemos arrastrar demasiadas células,
amontonándolas en grupo, dificultando la valoración posterior.

4.- HISOPO

Generalmente se utiliza cuando no se puede aplicar ninguna de las técnicas anteriores, como
en vagina, fondo de la boca, fondo nasal, fístulas, etc. Se humedece un hisopo con suero
fisiológico y se pasa por la superficie a examinar, luego se hace rodar el hisopo suavemente
sobre uno o varios portaobjetos. Las muestras recogidas con hisopo de la cavidad nasal no
recogen material suficiente para llegar a un diagnóstico por no introducirse y rascar lo
suficiente la mucosa a estudiar. En el conducto auditivo, aunque se introduzca de forma
óptima, tampoco es frecuente obtener células diagnósticas.

Tomado y modificado de “Atlas de microscopía clínica del perro y el gato” de Lamberto Viadel
y Daniel Borràs, Ed. Temis Medical S.L., 2011.
INMUNOHISTO…QUÉ?
23 abril 2012Daniel Borràs MúrciaDeja un comentario
Se dice con frecuencia que el trabajo del patólogo es subjetividad basada en la objetividad. Y
es cierto. Nuestro trabajo tiene mucho de interpretativo. Toda entidad patológica, a nivel
microscópico, tiene un patrón tipo que la caracteriza, una especie de prototipo en torno al
cual gravitan infinitas variaciones más o menos alejadas de la imagen ideal. Esto, que vale
para todo tipo de lesiones, es especialmente cierto en el caso de las neoplasias. Cuanto más
cerca del modelo, más fiable es el diagnóstico (y más aliviado queda el patólogo!). Cuanto
más alejado del modelo, más difícil nos resulta cerrar un diagnóstico único identificando un
fenotipo celular concreto. Es entonces cuando ofrecemos el diagnóstico que nos parece de
mayor probabilidad y añadimos uno o más diferenciales.

Fig.1 Tinción inmunohistoquímica sobre una sección de intestino utilizando un marcador de

célula epitelial (AE1/AE3). La positividad se aprecia en color marrón. Se aplica un suave
contraste con hematoxilina (azul) para teñir el resto de estructuras que de otra forma
quedarían en blanco.
Una técnica que usamos con frecuencia los patólogos para paliar estas dificultades es
la tinción inmunohistoquímica (IHQ). Nos permite identificar tipos celulares de una
forma objetiva mediante la detección de proteínas específicas. De esta forma podemos
clasificar como carcinoma una neoplasia muy pobremente diferenciada si obtenemos
positividad tintorial para proteínas específicas de células epiteliales. O podemos clasificar
como de tipo T o de tipo B un linfoma, algo imposible mediante valoración visual
únicamente.

¿Pero qué son y cómo funcionan estas tinciones? Las técnicas de IHQ tienen su origen más
remoto en los años 40 del siglo pasado, si bien no es hasta la década de los 70 que reciben
su mayor empuje y empiezan a aplicarse al diagnóstico anatomopatológico. Hoy en día son
rutina en patología humana. En nuestro caso no hablaría de rutina, ya que por el eterno
problema de los costes las limitamos a casos muy concretos.
 Fig. 2 Esquema de la técnica de inmunotinción. El anticuerpo primario (2) se adhiere al
antígeno buscado (1). Sobre él se añade un anticuerpo secundario (3) y, para agrandar toda
la estructura, se añade un complejo Avidina-Biotina (4). Finalmente se induce un viraje
cromático mediante una reacción química catalizada por peroxidasa.
Su fundamento es muy simple. Y muy ingenioso. Si no ves algo pequeño, agrándalo. Si no
ves algo incoloro, coloréalo. Pero, ¿cómo agrandar algo tan pequeño como una proteína y,
además, de forma selectiva? Aquí viene la parte ingeniosa: enganchándole una cadena de
anticuerpos (de ahí el nombre de “inmuno”). Habitualmente se emplean tres etapas:

1.- En un primer paso se aplica un anticuerpo fabricado para reconocer la proteína que
buscamos. Por ejemplo, un anticuerpo que reconozca una proteína presente sólo en linfocitos
T (CD3). O presente sólo en células musculares (miosina, actina). O presente únicamente en
células gliales (GFAP). Hay centenares de anticuerpos comerciales dirigidos contra otras
tantas proteínas concretas.

2.- En un segundo paso añadimos un anticuerpo que reconoce anticuerpos y que se unirá,
por tanto, al que hemos añadido en el primer paso. Menos complicado de lo que parece si
miramos la figura x. Pero aún no tenemos una estructura suficientemente grande.

3.- Para amplificar aún más la cadena que hemos creado con anticuerpos usamos un
complejo compuesto por Avidina (una

Fig. 3 Inmunotinción de linfocitos T (CD3) en un linfoma cutáneo epiteliotrópico de tipo

micosis fungoide. La clonalidad celular (T o B) es una característica de la mayor parte de
linfomas.
proteína presente en la clara de huevo) y por Biotina (un coenzima del complejo vitamínico
B). Ambas moléculas tienen una gran afinidad mútua, formando un complejo tridimensional
de gran tamaño. La biotina va incorporada al segundo anticuerpo. La avidina la añadimos
posteriormente.

Bien, ya hemos amplificado considerablemente nuestra proteína (en el caso de que esté
presente en el tejido!). Ahora sólo falta darle color para hacerla visible al microscopio. Para
ello se emplea una reacción química que transforma una sustancia soluble e incolora en otra
insoluble y de color marrón. Dicha sustancia es la diaminobencidina (DAB), que se añade
como último paso. Allí donde encuentre complejo Avidina-Biotina, precipitará y dará color.

Fig. 4 Tinción específica de células endoteliales (anticuerpos anti-Factor VIII, una proteína
presente en este tipo celular). En el centro, una estructura vascular con marcaje específico
del endotelio. En el interior, numerosos eritrocitos con algo de tinción inespecífica.
El resultado final de la tinción, además de resultar visualmente bastante estético, es
súmamente útil. Tanto que con frecuencia los patólogos lamentamos no poder recurrir a ella
con más asiduidad.