Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales

Departamento de Química Industrial y Aplicada

Microbiología General y de los Alimentos

MICROBIOLOGÍA GENERAL Y DE LOS ALIMENTOS

3.1. STP Nº 3: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

3.1.1. Objetivos
 Comprender la función del medio de cultivo en el desarrollo y crecimiento de
microorganismos.
 Identificar los diferentes componentes de los medios de cultivo.
 Adoptar criterios de selección de un medio de cultivo, para un determinado
uso, a través del conocimiento de sus diferencias de composición.
 Adquirir destreza en técnicas de laboratorio de microbiología: Preparación de
medios de cultivo y esterilización.

3.1.2. Marco Teórico

Los medios de cultivo son una mezcla equilibrada de nutrientes que en concentraciones y en
condiciones físicas óptimas permiten un buen crecimiento de los microorganismos.
Contienen una base mineral, fuente de carbono, nitrógeno y azufre; atmósfera adecuada y
los factores de crecimiento necesarios.

Clasificación de los medios de cultivo

1. Según el estado de agregación:

 Líquidos: Tienen sus componentes disueltos en agua. Fueron los primeros
utilizados en microbiología, Pasteur los empleó en sus célebres experiencias sobre
la biología de los microorganismos, medios que hoy se utilizan en gran escala
porque en muchos casos son insustituibles por los sólidos.
 Sólidos: Contienen ágar-ágar o gelatina para darle la consistencia requerida. El
agar-agar es un polisacárido producido por algas, que sirve de sostén para los
microorganismos, ya que no puede ser metabolizado por éstos. Mediante el uso de
estos medios se posibilitó la obtención de colonias aisladas al estado de pureza y
la técnica del laboratorio se perfeccionó a raíz de la implementación de su uso.

2. Según la finalidad de desarrollo:

 Medio común: Tiene los nutrientes necesarios (básicos) para microorganismos
poco exigentes. En él pueden crecer un gran número de especies microbianas.
Ej.: Agar Nutritivo, Agar Plate Count (P.C.A.).
 Medio enriquecido: Tiene un gran exceso de nutrientes y se utiliza para
microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales. Ej.: Agar chocolate,
Agar cerebro-corazón, etc.

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 Medio selectivo: Sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e

inhibe el de otros. Permite seleccionar y aislar microorganismos a partir de
poblaciones mixtas. Ej.: Agar manitol-sal o Chapman (permite el crecimiento de
ciertos Staphylococcus).
 Medio diferencial: Permite revelar características fisiológicas de los
microorganismos. Ej.: Levine (para visualizar la fermentación de lactosa por viraje
de un indicador ácido-base), Agar sangre (permite visualizar la síntesis de
hemolisinas).

3. Según su composición:
 Medio sintético o definido: Tiene una composición química definida cuali y
cuantitativamente.
 Medio complejo o indefinido: Contiene nutrientes de composición química variable
o no establecida. Son mezclas complejas y poco definidas de sustancias. Se
forman a partir de extractos animales, vegetales, etc.

Preparación de los medios de cultivo

1. Disolución de componentes:
Se limpia cuidadosamente el recipiente a utilizar y luego se enjuaga con agua destilada con
el fin de eliminar totalmente residuos.
Se pesan los componentes y se les agrega, para su disolución, agua destilada con pH 7. Se
agita para obtener una suspensión homogénea y luego se completa el volumen con el agua
restante, aprovechando para desprender e incorporar al conjunto, las partículas del medio
de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente.
Los medios de cultivo que no contienen agar-agar se los disuelve en agua fría o bajo un
ligero calentamiento. Los que poseen agar-agar deben ser calentados a Baño María para
alcanzar la disolución completa del medio. No calentar más de lo necesario (recordar que en
mayor o en menor grado los medios de cultivo son sensibles al calor).
En el caso de medios de cultivo con base de agar y pH menor a 5, deben prepararse con
sumo cuidado, pues el agar se hidroliza al ser calentado en medio ácido y por tanto
disminuye la estabilidad del gel del medio de cultivo. Por lo que se tratará de no fundirlos
nuevamente. Ante una inevitable fundición, puede agregarse aproximadamente 5 g/L más
de agar.
2. Ajuste de pH:
Cuando se utiliza agua neutra para la preparación del medio, estos muestran el valor de pH
indicado para cada uno de ellos a la temperatura de trabajo. A pesar de todo, se recomienda
comprobarlo y si es necesario corregirlo. El pH depende de la composición del medio de
cultivo, la temperatura al instante de la medición y del tratamiento a que ha sido sometido.
La medición de pH se hace luego de la esterilización.

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En los medios de cultivo sólidos y semisólidos la medición y corrección se realiza entre los
45 y 50 °C y en los medios líquidos se realiza a temperatura ambiente.
La corrección se logra por adición de solución 1N o 1/10 N de ácido clorhídrico o hidróxido
de sodio, esterilizado por filtración, a una muestra de medio de cultivo exactamente medida.
La cantidad de disolución correctora necesaria para la totalidad del producto preparado, se
calcula fácilmente a partir de la cantidad de solución correctora empleada para la muestra
del medio de cultivo.

3. Esterilización:
Antes de esterilizar es conveniente distribuir el medio en recipientes pequeños de vidrio, de
50 a 100 mL. Si las normas de preparación no indican lo contrario, se esteriliza en autoclave
a 121 °C durante 15 minutos.

Medios de Cultivo para Bacterias

1. Agar para recuento (PCA)
Es usado en el examen bacteriológico de alimentos. La claridad del medio permite fácil
recuento de colonias en cada caso.
Composición (g/L)
Triptona 5,0
Extracto de levadura 2,5
Glucosa 1,0
Ágar-ágar 15,0

El pH del medio a 37 ºC es de 7,0 a 7,2.

Se disuelven los componentes en 1 L de agua destilada. Se esteriliza en autoclave durante
15 minutos a 121 ºC.

2. Ágar Nutritivo
Se lo recomienda para aquellos microorganismos que no son demasiado exigentes.
Composición (g/L)
Extracto de carne 3,0
Peptona 5,0
Ágar-ágar 15,0

El pH del medio a 37 ºC es de 6,8 a 7,2.

Se añaden los componentes a 1 L de agua destilada o volumen requerido y se calienta
hasta disolución total. Se esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121 ºC.

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3. Ágar Mac Conkey

Utilizado para detectar bacterias coliformes.
Composición (g/L)
Peptona de caseína 17,0
Peptona de carne 3,0
Lactosa 10,0
Sales biliares 1,5
Cloruro de sodio 5,0
Rojo neutro 0,03
Violeta cristal 0,001
Ágar-ágar 13,5
pH previsto del medio a 37º C : 7,0-7,2.

Se dispersan 35 g del medio en 1 L de agua destilada. Se hierve hasta disolución. Se

esteriliza en autoclave 15 minutos a 121 ºC.

4. Agar Levine o Eosine Metilen Blue (E.M.B)

Medio para aislar y diferenciar enterobacterias con represión de la flora intestinal Gram (+).
Composición (g/L)
Peptona de caseína 10,0
Lactosa 5,0
Sacarosa 5,0
Fosfato dipotásico 2,0
Eosina 0,4
Azul de metileno 0,065
Ágar-ágar 13,5
pH previsto del medio a 37 ºC: 7,0 a 7,2.
Se añaden 36 g a 1 L de agua destilada. Se agita y se hierve hasta disolución completa. Se
esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121 ºC.

5. Ágar Cetrimide
Para aislamiento y diferenciación de Pseudomona aeruginosa.
Composición (g/L)
Peptona de gelatina 20,0
Cloruro de magnesio 1,40
Sulfato de potasio 10,0
N-cetil-N,N,N, trimetila-moniobromuro (cetrimide) 0,3
Ágar-ágar 13,0

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Se disuelven los componentes en agua destilada y se agregan 10 mL de glicerina. Se

esteriliza en autoclave durante 15 minutos a 121 ºC. Para aumentar la inhibición de la flora
acompañante se puede agregar 15 mg/mL de ácido nalidíxico.

6. Caldo Verde de Malaquita

Para enriquecimiento selectivo de Pseudomona aeruginosa.
Composición (g/L)
Peptona de carne 15,0
Extracto de carne 9,0
Verde de malaquita oxalato 0,03
Fosfato ácido dipotásico 1,1

Se disuelven los componentes en agua destilada y se esteriliza en autoclave durante 15

minutos a 121 ºC.

7. Ágar sulfuro de hidrógeno, indol y movilidad (S.I.M)

Para diferenciar bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno, indol y movilidad.
Composición (g/L)
Peptona de caseína 20,0
Peptona de carne 6,0
Citrato férrico 0,2
Tiosulfato de sodio 0,2
Ágar-ágar 3,0
pH del medio a 37 ºC : 7,2-7,4.
Se distribuyen 30 g de los nutrientes en 1 L de agua destilada. Se agita y se hierve hasta
disolución completa. Luego se vierte la solución en tubos de ensayo, hasta unos 4 cm de
altura aproximadamente. Se esteriliza en autoclave 15 minutos a 121 ºC.

8. Ágar citrato de Simmons

Se utiliza para distinguir bacterias Gram-negativas comprobando el consumo de citrato.
Composición (g/L)
Fosfato monoamónico 1,0
Fosfato dipotásico 1,0
Cloruro de sodio 5,0
Citrato de sodio 2,0
Sulfato de magnesio 0,2
Azul de bromotimol 0,08
Ágar-ágar 13,0
pH del medio a 37 ºC : 6,8-7,0.

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Se añaden 24,2 g del concentrado a 1 L de agua destilada. Se calienta agitando, hasta

disolución completa. Se esteriliza en autoclave 15 minutos a 121 ºC.

9. Caldo de rojo de metilo de Voges-Proskauer (Medio R.M-V.P)

Para distinguir entre Escherichia, Citrobacter y Aerobacter, mediante comprobación de la
producción de ácido a partir de glucosa con rojo de metilo como indicador o con Alfa naftol.

Composición (g/L)
Polipeptona 7,0
Glucosa 5,0
Fosfato de potasio 5,0
pH de medio a 37 ºC : 6,8-7,0
Se disuelven 17 g en 1 L de agua destilada. Se esteriliza en autoclave 15 minutos a 121 ºC.

10. Agua peptonada al 1%

Medio usado como diluyente y para enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos y otros
materiales de interés sanitario.
Composición (g/L)
Peptona de carne 10,0
Cloruro de sodio 5,0
pH final 7,0-7,2
Suspender 15 g de polvo en 1 L de agua destilada. Mezclar bien y distribuir. Esterilizar en
autoclave a 121°C durante 15 minutos.

11. Ágar manitol sal

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciación de
estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patogénicos a partir de
muestras clínicas, alimentos, productos cosméticos y otros materiales de importancia
sanitaria.

Composición (g/L)
Extracto de carne 1,0
Peptona especial 10,0
Cloruro de sodio 75,0
Manita 10,0

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Rojo de fenol 0,0025

Ágar-ágar 12,00
pH del medio a 37º C : 7,3-7,5.

Se dispersan 108 g en 1 L de agua destilada y se calienta hasta ebullición, removiendo

hasta disolución completa. Se esteriliza en autoclave 15 minutos a 121 ºC.

12. Caldo Lauril Sulfato

Medio recomendado por A.P.H.A. para detección y recuento de coliformes en aguas, aguas
residuales y alimentos. Es un medio rico en nutrientes, que permite un rápido desarrollo de
los microorganismos fermentadores de la lactosa, aún de los fermentadores lentos.

Composición (g/L)
Triptosa 20,0
Lactosa 5,0
Cloruro de sodio 5,0
Lauril sulfato 0,1
Fosfato dipotásico 2,75
Fosfato monopotásico 2,75
pH del medio a 37 ºC : 6,8-0,2.
Suspender 35,6 g del polvo en 1 L de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos. Calentar a
ebullición hasta la disolución total. Distribuir en tubos conteniendo tubos de fermentación.
Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121°C.

Tecnología de Sustratos definidos o métodos de detección enzimática

Consiste en la utilización de medios de cultivo que contienen derivados de azúcares que, al
escindirse por la actividad enzimática, producen fluorescencia o un determinado color.

1. Recuento de coliformes totales y coliformes termorresistentes

Se basa en la detección de β-D galactosidasa (GAL). Esta enzima actúa sobre sustratos
como:
 5-bromo 6-dicloro-3-indoxyl-β-D galactopiranósido (X-GAL)
 o-nitro-fenil-β-D-galactopiranósido (ONPG)
 p-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (PNPG)
 4-metilumbelliferil-β-D-galactopiranósido (MUGA) etc.

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2. Recuento de Escherichia coli

Se basa en la detección de la actividad de la β-D-glucuronidasa (GUR).
En medios líquidos se agregan sustratos como:
• 4-metilumbelliferil-β-D-glucurónido (MUG) que es hidrolizado por la enzima GUR
resultando un producto final fluorescente (metilumbeliferona) a la luz ultravioleta de
onda larga (366 nm).

EC-MUG
Medio selectivo utilizado para la detección de Escherichia coli en muestras de agua y
alimentos.

Composición (g/L)
Triptona 20,0
Lactosa 5,0
Sales biliares 1,5
di-fosfato de potasio 4,0
Mono-fosfato de potasio 1,5
Cloruro de sodio 5,0
4-metilumbelliferil- -D-glucurónido 0,05
pH a 25 ºC: 6,9 ± 0,2

Suspender 37 g de Caldo EC con MUG en 1 L de agua destilada. Mezclar bien para disolver
y distribuir en tubos de ensayo que contienen tubos de Durham invertidos. Esterilizar en
autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.

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Medios de Cultivo para Hongos

1. Agar papa dextrosa (PDA)

Composición (g/L)
Papa 200,0
Glucosa o sacarosa 20,0
Ágar-ágar 15,0
pH del medio 6,5

2. Agar Sabouraud
Composición (g/L)
Peptona especial 10,0
D (+) Glucosa 20,0
Ágar-ágar 17,0
pH previsto del medio: 5,5-5,7

3. Agar Czapek
Composición (g/L)
Nitrato de sodio 2,0
Cloruro de potasio 0,5
Sulfato de magnesio 0,5
Sulfato ferroso 0,01
Fosfato dipotásico 1,0
Sacarosa 30,0
Ágar-ágar 15,0

pH del medio 7,8

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Reactivos utilizados:

1. Agua de dilución salina

Disolver 30 g de cloruro de sodio en 1 L de agua destilada. Esterilizar en autoclave durante
15 minutos a 121 ºC.

2. Solución fisiológica
Disolver 8,5 g de cloruro de sodio en 1 L de agua destilada. Esterilizar en autoclave durante
15 minutos a 121 ºC.

3. Reactivo de Kovacs
Composición (g/L)
p-dimetilaminobenzaldehido 5,0
Alcohol amílico o isoamílico 75,0
Ácido clorhídrico (conc.) 25,0

Disolver el p-dimetilaminobenzaldehído en el alcohol amílico o isoamílico, y luego

lentamente agregar el ácido clorhídrico.

4. Solución de Rojo de Metilo

Disolver 0,1 g de rojo de metilo en 300 mL de etanol y llevar a 500 mL de agua destilada.

5. Reactivos para la reacción de Voges-Proskauer

Solución1:
Alfa-naftol 5g
Alcohol absoluto 100 mL

Solución 2:
Hidróxido de potasio 40 g
Agua destilada 100 mL

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3.1.3. Actividad Experimental

 Preparación de medios líquidos y sólidos
a) Pesar la cantidad de ingredientes para preparar 50 mL de agua peptonada y
100 mL de de ágar PCA de acuerdo a la formulación indicada por el docente.
b) Disolver los componentes, agregando agua destilada hasta completar el
volumen total y calentar a baño maría hasta disolución total de los
componentes.
c) Verificar el pH y ajustarlo si es necesario.
d) Fraccionar y esterilizar en autoclave, durante 15 minutos, a 121 ºC.
e) Etiquetar indicando nombre del medio de cultivo y fecha de esterilización.

Nota: Si hay que añadir sustancias de enriquecimiento termolábiles, se hace después

de la esterilización, y con el medio más frío pero aún fundido. La adición debe ser
aséptica y lenta, para conseguir homogeneidad.

 Preparación de medios de cultivo comerciales

a) Pesar la cantidad necesaria para preparar 50 mL de ágar Manitol Sal y 50 mL
de ágar EMB (según indicación comercial)
b) Disolver los componentes, agregando agua destilada hasta completar el
volumen y calentar a baño maría hasta disolución total.
c) Fraccionar y esterilizar en autoclave, durante 15 minutos, a 121 ºC.
d) Etiquetar indicando nombre del medio de cultivo y fecha de su esterilización.

3.1.4. Materiales y equipos

 Por grupo:
a) 2 frascos de 50 mL o 100 mL para medios de cultivos, según corresponda.
b) 1 Vaso de precipitado de plástico para pesar.
c) 1 probeta de 50 mL.
d) 1 Erlenmeyer de 100 o 200 mL, según corresponda.
e) 5 tubos de ensayo.
f) 5 tubos Falcon para dilución
g) 1 gradilla.
h) 1 espátula.
i) 1 varilla de vidrio.
j) 1 trípode y tela de soporte.
k) 1 mechero.

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Varios:
 Tapas de goma para frascos de medios de cultivo.
 Tapas de plástico para tubos de ensayo.
 Pipetas de 10 mL.
 Propipetas.
 Gasas cortadas.
 Bandas elásticas.
 Fibra indeleble.

 De uso común

a) Medios de cultivo: PCA, EMB, Ágar manitol sal y agua peptonada.

b) Agua destilada.
c) Autoclave
d) Balanza digital
e) Canasto de acero inoxidable.
f) Agitador magnético.

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