Guia de Prácticas

Universidad Peruana Unión Ingeniería Ambiental
GUIA DE PRÁCTICAS DE
MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
Autor: Gina Tito Tolentino

Editor: Stive Flores Gómez
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN
PRÁCTICA 1
FUNDAMENTOS DE MICROSCOPÍA, MONTAJE Y COLORACIONES DE
MUESTRAS
1. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos son imposibles de observar a simple vista, por ello la es necesario equipos
amplificadores de tamaño como el microscopio (micro = pequeño, skopos = observar). Para el
examen microscópico de los microorganismos se puede utilizar el microscopio óptico o el
microscopio electrónico.
2. OBJETIVO
Desarrollar habilidades de cuidado y manejo del microscopio óptico de campo claro.
3. DESARROLLO
3.1 Tipos de microscopios ópticos
El término microscopia óptica se refiere al empleo de cualquier clase de microscopio que utilice
luz visible para observar las muestras. Según las propiedades luminosas del instrumento existen
distintos tipos de microscopios ópticos: de campo claro, contraste de fase, campo oscuro y
fluorescencia.
3.2 Microscopio de campo claro
Un microscopio de campo claro tiene una serie de lentes y utiliza luz visible como fuente de
iluminación (Figura 2.1). Un conjunto de lentes forma una imagen focal definida cuyo tamaño
es muchas veces mayor que el de la muestra en sí. Este aumento se logra cuando los rayos
luminosos procedentes de la fuente de luz pasan a través de un condensador, que tiene lentes
que dirigen los rayos de luz a través de la muestra. Desde aquí los rayos pasan al interior del
objetivo, la lente más próxima a la muestra. La imagen de la muestra vuelve a ser ampliada por
el ocular.
La capacidad amplificadora de un microscopio compuesto es el producto del aumento

individual de los oculares y los lentes objetivos. La mayoría de los microscopios utilizados en
microbiología poseen varias lentes objetivos, que proporcionan 10x (bajo aumento), 40x (gran
aumento) y 100x (de inmersión en aceite). La mayoría de los oculares amplían la imagen 10
veces. Al multiplicar el aumento de un objetivo específico por el del ocular (10x) se observa que
el aumento total puede ser de 100A con bajo aumento, de 400A con gran aumento y 1000A con
lente de inmersión.
La resolución se define como el espacio de máxima aproximación entre dos puntos en el que
aún se pueden observar claramente como dos entidades independientes. El poder de resolución
de un microscopio está sujeto a la longitud de onda de la luz y a la propiedad de las lentes
conocidas como la apertura numérica (AN). El límite del poder de resolución de un microscopio
es aproximadamente igual a 0,61/AN que para un microscopio óptico es de alrededor de 200
nm.
A menor longitud de onda de la luz y AN de las lentes, el poder de resolución del microscopio
será mejor. Por lo tanto, queda claro que el poder de resolución de los microscopios ópticos se
encuentra restringido por la AN que se obtenga de los sistemas de lentes y las longitudes de
onda del espectro de luz visible.
La apertura numérica indica la cantidad de luz que entra en un objetivo desde un punto del
campo del microscopio. Tal valor es muy importante, ya que, de él depende el poder de
resolución, la propiedad más importante de un objetivo.
La AN de una lente depende del índice de refracción (N) del medio que llena el espacio entre el
objeto y la parte frontal del objetivo, y del ángulo (μ) de los rayos de luz más oblicuos que
puedan entrar al objetivo. La fórmula para calcular la AN es: AN = N x sen μ/2.
El aire tiene un índice de refracción de 1, que limita la resolución que se puede obtener, pero se
puede incrementar la AN poniendo aceite de inmersión entre el espécimen y el objetivo,
aumentando así el poder de resolución del microscopio. El aceite de inmersión tiene un índice
de refracción de 1,5 lo cual aumenta considerablemente la AN y esto mejora el poder de
resolución del microscopio.
Para obtener una imagen clara con detalles precisos en el microscopio óptico compuesto las
muestras deben teñirse para que contrasten nítidamente con el medio que las rodea. Para lograr
ese contraste es necesario cambiar el índice de refracción de la muestra al del medio, esto se
logra tiñendo las muestras. En las condiciones habituales de trabajo el campo de visión de un
microscopio óptico está iluminado de forma brillante. Cuando se enfoca la luz, el condensador
produce una iluminación brillante (campo claro).
3.2 Identificación de las partes del microscopio óptico
3.2.1 Señale las partes del microscopio:

PRÁCTICA 2
PREPARACIÓN DE FIJACIÓN DE MUESTRA
Objetivo
Aprender las técnicas de preparación de frotis, de fijación y coloración más utilizadas en el
estudio microscópico de cultivos bacterianos.
Fundamentos:
Previo al desarrollo de una técnica de tinción, el material a ser observado debe ser fijado, es
decir adherido a una lámina de vidrio sobre la cual ha de realizarse la tinción. Si la preparación
no es fijada, la muestra tiende a perderse durante los procedimientos de tinción. El
procedimiento de fijación mata al microorganismo, coagula el protoplasma celular y provoca su
adhesión a la lámina de vidrio .Un agente de fijación ideal preserva la estructura de la célula en
la forma y posición normal sin causar la aparición de artefactos (estructuras no presentes en las
célula viviente). Aunque el calentamiento es el agente de fijación más común, el alcohol y otros
agentes químicos también pueden ser usados satisfactoriamente.
El procedimiento a seguir en este ejercicio es preliminar a la mayoría de métodos de tinción

usados para las bacterias.
Materiales
- Muestra conteniendo bacterias

- Asa de Kolle
- Lamina porta objeto
- Mechero de alcohol
- Piseta con agua
Procedimiento
1. Coloque una gota de agua sobre una lámina porta objeto completamente limpia. Con
ayuda del asa de Kolle coloque sobre la gota una pequeña porción de la muestra a fijar.
Si la muestra que contiene al microorganismo es líquida, puede aplicarse directamente
sin la gota de agua.
2. Distribuya la gota cargada con la muestra en la lámina hasta formar una película
delgada.
3. Seque la lámina al aire o a una razonable distancia sobre la llama del mechero.
4. Cuando la película este seca, pase la lámina a través de la llama del mechero unas tres
veces, cuidando que la película este hacia arriba y que la lámina no se recaliente. La
sobre exposición al calor puede alterar la forma y estructura del microorganismo.
Figura 1. Preparación y fijación de cultivos bacterianos.

PRÁCTICA 3
MICROSCOPIA Y PREPARACIÓN DE UNA MUESTRA FIJA PARA TINCIÓN
TINCIÓN SIMPLE CON COLORANTES BÁSICOS
Objetivo
Observar las diferentes formas, tamaños y agrupaciones que presentan los microorganismos
aplicando un método simple de tinción.
Fundamentos
La tinción simple construye una técnica sencilla y directa que a través del uso de un
colorante, nos permite contrastar y diferenciar los microorganismos de su entorno.
Los colorantes básicos, los cuales se utilizan comúnmente para teñir microorganismos,
difieren en el grado de reactividad con las células. El azul de metileno reacciona con las células
cargadas negativamente a la tasa más baja, tomando de 20 a 30 segundos para teñir
apropiadamente una preparación microbiana. El cristal violeta es más reactivo y generalmente
requiere sólo 10 segundos. El carbol fucsina es un colorante aún más reactivo y generalmente
requiere solo 15 segundos. Su reactividad es tan grande que ciertamente puede dificultar una
tinción apropiada, sobre todo cuando la muestra contiene abundante materia orgánica.
Materiales
- Láminas fijadas de microorganismos, Aceite de inmersión
- Colorantes básicos: Azul de metileno, Cristal violeta, Carbolfucsina
- Papel secante, Piseta de agua, Soporte para tinción
Procedimiento
1. Coloque las láminas fijadas de microorganismos sobre el soporte para tinción.
2. Agregue 5 o 6 gotas de cada colorante dejando que actúen por un tiempo de 30
segundos para el azul de metileno; 10 segundos para el cristal violeta; y 5 segundos para
la carbolfucsina.
3. Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lave cada lámina con la piseta de agua.
4. Seque las láminas al aire o dentro del papel secante
5. Examine las preparaciones teñida bajo el objeto de inmersión (100 – 150 x) de un
microscopio compuesto.
6. Elabore esquemas de sus observaciones destacando las diferencias en tamaño, forma y
agrupaciones que se presenten.
Cuestionario.
1. ¿Cuáles son las asociaciones más frecuentes en las bacterias?
2. ¿En qué rango de tamaño se definen las bacterias?
3. ¿Cuáles son las formas bacterianas más frecuentes?
4. ¿Qué diferencia a una tinción directa de una tinción negativa?
5. ¿Qué importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los colorantes
empleados?
PRÁCTICA N°2
PREPARACIÓN DE MATERIALES Y
MEDIOS DE CULTIVO PARA ESTERILIZAR
I. Introducción
La esterilización de dispositivos médicos se realiza mediante el uso de procesos
físicos y / o químicos que inactivan todas las formas de vida microbiana. (Qiu, Sun &
Connor 2017).
La esterilización es un mecanismo por el que se consigue la muerte o eliminación de

todos los microorganismos vivos de una muestra, medio, superficie o material de trabajo
(LEAHY et al., 1999). Entre estos se incluyen bacterias, arqueas, hongos, protistas y sus
formas de resistencia, asimismo los priones y virus. El único método que destruye esporas es
la esterilización (Instituto Nacional de Gestión Sanitaria, 2013).
La esterilización puede ser por medios físicos y químicos como aplicación de calor
seco o húmedo, filtración y radiaciones. Químicos como el óxido etileno, formaldehido o
glutaraldehido. Actualmente existen métodos que usan las bajas temperaturas, el gas plasma
y otras técnicas que requieren de menos tiempo y son eficientes en eliminar todo tipo de
microorganismo.
Antes de ser sometido a procesos de esterilización, el material debe ser

inspeccionado con el fin de asegurar que se encuentra en buenas condiciones de
funcionamiento y libre de materia orgánica. MINSAL s/f.
La esterilización preparativa es la que se realiza para mantener libre de

microorganismos el material que vamos a utilizar antes de empezar el trabajo en sí mismo o
durante el proceso de trabajo (placas Petri, pipetas, medios de cultivo, asas de siembra,
hisopos, etc.).
1.1 Métodos físicos para eliminar los microorganismos
a. Calor Seco
La esterilización por calor seco produce la destrucción de los microorganismos
por oxidación de sus componentes celulares.
b. Calor húmedo
El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de sus proteínas
celulares.
La autoclave es un recipiente metálico de paredes gruesas con cierre hermético que

permite trabajar con vapor de agua a alta presión y alta temperatura que sirve para esterilizar
material médico o de laboratorio.
• La autoclave inactiva todos los virus y bacterias, aunque se ha llegado a saber que algunos
microorganismos, así como los priones, pueden soportar las temperaturas de la autoclave.
• La olla de presión tiene el perfecto principio de la autoclave.
• La esterilización con vapor es el método más efectivo, actúa coagulando las proteínas de
los microorganismos llevando así a su destrucción.
1.2 Los Medios De Cultivo
Existen Varios tipos de medios de acuerdo a las necesidades nutricionales

particulares. Al preparar un medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos debe
tenerse en consideración el proveer de las fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo,
azufre y de los factores de crecimiento que sean necesarios. En la formulación de los medios
de cultivo podemos distinguir entre medios definidos y complejos.
a. El medio definido
Provee de los nutrientes requeridos para el crecimiento en la forma de compuestos

químicos de concentración conocida. Por ejemplo un medio definido para un heterótrofo
como Escherichia coli puede ser compuesto de NH4Cl, MgSO4, KH2PO4, Na2HPO4 y
glucosa.Otros elementos como fierro, manganeso y cobre están generalmente presentes
como contaminantes de los compuestos químicos en cantidades adecuadas para el
crecimiento.
b. El medio complejo
Contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de microorganismos,

pero ellos están contenidos en ingredientes crudos, es decir, que no todos los componentes
del medio ni sus concentraciones exactas son conocidas. Ingredientes de este tipo son los
extractos de la levadura, de carne, los hidrolizados de proteínas (peptona, tristona), que
constituyen fuentes de polipéptidos aminoácidos, vitaminas, algunos carbohidratos, etc.
De acuerdo al tipo de microorganismo que se quiera cultivar de los medios pueden

clasificarse como:
Comunes. - Permiten el crecimiento indiscriminado de todo tipo de

microorganismos. Ejemplo: Agar nutritivo, Caldo nutritivo, Agar gelatina, etc.
Especiales. - Son formulados teniendo en cuenta exigencias nutricionales diversas o

características bioquímicas determinadas. Pueden considerarse medios enriquecidos o
mejorados, selectivos y diferenciales.
c. Medios mejorados o enriquecidos
Son aquellos a los que se les agrega determinadas sustancias nutritivas (sangre, yema
de huevo, suero, etc.) y con ello estimulan las exigencias nutritivas de ciertos
microorganismos. Ej. Agar sangre, Caldo selenito, etc.
d. Medios selectivos
Se caracterizan porque se incluyen sustancias que favorecen el crecimiento de

determinadas especies y sustancias que inhiben el crecimiento de otras no deseadas. Ej.:
Agar salmonella Shigella, Agar Bismuto sulfito, etc.
e. Medios de diferenciación
Ponen de manifiesto algunas propiedades bioquímicas del microorganismo, como

formación de gas, cambios en de pH, etc. Los cambios de pH se evalúan incorporando
indicadores en el medio y se determinan de acuerdo al rango en estudio. Ej.: Medios

azucarados como: Caldo glucosado, Caldo Lactosado, Kligler, etc.
Frecuentemente los medios selectivos y diferenciales se deben usar juntos para aislar
e identificar especies a la vez. Algunos medios tienen incorporados los ingredientes
convenientes para este doble propósito y resultan de gran utilidad y economía. Ej.: Agar
Manitol salado, Agar Mac Conkey, etc.
Dependiendo de la técnica de cultivo elegida, los medios mencionados anteriormente

pueden ser preparados como líquidos o sólidos. Los medios mencionados anteriormente
pueden ser preparados como líquidos o sólidos. Los medios líquidos contienen los nutrientes
y otros elementos en una solución acuosa que generalmente recibe el nombre de caldo; los
medios sólidos contienen además un agente solidificante llamado agar que se utiliza para dar
parte del nombre del medio e identificarlo como sólido. El agar es un polisacárido complejo
derivado de un alga marina y posee características muy útiles para microbiología. Muy pocos
microorganismos degradan el agar de tal manera que aún después de un periodo de
crecimiento, el medio con agar se mantiene sólido. El agar se funde a 90°C o al punto de
ebullición del agua y permanece en estado líquido hasta que la temperatura desciende hasta
aproximadamente 40°C.
Una vez preparado el medio de cultivo líquido o sólido debe ajustarse al pH

adecuado, disponerse en un recipiente de vidrio resistente al calor, (Tubo o matraz) y
protegerlo con un tapón de algodón o material plástico que permita el intercambio de gases y
que impida el ingreso de otros microorganismos. El medio de cultivo así dispuesto debe ser
esterilizado en autoclave a 121 °C bajo 15 lb. de presión de vapor por 15 minutos. En caso
de contener ingredientes termolábiles, pueden emplearse otros métodos de esterilización
como la filtración.
II. Objetivo
Destacar la importancia de la esterilización de los materiales de microbiología para

reducir la contaminación cruzada y garantizar la calidad de los análisis de microrganismos.
III. Metodología
3. 1 Materiales
 Medos de cultivo o
ingredientes deshidratados
 Agua destilada o desionizada
 Algodón, gasa
 Balanza
 Erlenmeyers de 250 y 500 ml
 Espátulas
 Lápiz marcador de vidrio
 Papel indicador de pH
 Papel aluminio y papel
corriente no absorbente
 Pipetas graduadas
 Probetas de 100 ml
 Tubos de ensayo
3.2 Método
Preparación de Caldo nutritivo (extracto de carne,0.3 % y peptona, 0.5 %)
1.- Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente la cantidad de medio

deshidratado suficiente para preparar 100ml de caldo nutritivo.
2.- Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml limpio y seco, y agregue
cuidadosamente el agua destilada medida en la probeta.
3.- Mezcle la preparación con movimientos giratorios hasta la completa disolución.
4.- Elabore tapones de algodón para 15 tubos, distribuya el medio líquido con una pipeta
graduada a razón de 5 ml en cada tubo.
5.- Distribuya el medio líquido con una pipeta graduada a razón de 5 ml en cada tubo.
6.- Coloque los tapones de algodón a los tubos evitando que estén flojos o muy
compactos.
7.- Disponga los tubos en un contenedor resistente al calor, envuélvalos con papel,
identifíquelos con el nombre del medio, la fecha de preparación y el nombre de la
persona responsable en la elaboración.
8.- Esterilice los tubos con medio en una autoclave a 121 °C (15 lb. de presión) durante
15 minutos.
Preparación de Agar nutritivo (Extracto de carne de 0.3; peptona, 0.5 %; agar,

1.5%)
1.- Prepare 200 ml de caldo nutritivo. (repita los pasos 1,2 y 3 del procedimiento
anterior con la corrección en el peso para la nueva cantidad solicitada y en el
Erlenmeyer a usar, debe tener unas tres veces el volumen que tendrá el medio).
2.- Agregue 3 g de agar (1.5 %), y lleve a licuar en baño de agua a ebullición hasta que
el medio luzca transparente a la luz.
3.- Elabore tapones de algodón para unos 16 tubos.
4.- Una vez licuado el medio, déjelo enfriar ligeramente y distribúyalos en los tubos con
una pipeta graduada. Prepare 6 tubos con 12 ml y 10 tubos con 7 ml.
5.- Repita los pasos 6, 7,8 del procedimiento anterior.
6.- El medio restante debe ser acondicionado para su esterilización junto a lo anterior.
Preparación de Agar Mac Conkey

(peptona, 1.7 %; proteosa – peptona, 0.3 %; lactosa,1%, sales biliares,0.15%; NaCl,
0.5%; agar, 1.5%, rojo neutro, 0.003%, cristal violeta, 0.0001 %).
Preparación Agar manitol salado

(Extracto de carne 0.1 %; proteosa – peptona,1.0 %; NaCl, 7.5%; manitol, 1.0%; agar,
1.5%, rojo fenol, 0.0025%)
1.- Pese la cantidad de medio deshidratado necesario para preparar 100 ml de cada uno.
Observando la formulación de cada medio comprobará que los pesos a realizar son
distintos.
2.- Coloque el polvo de cada medio en Erlenmeyer de 25. ml y llévelos a licuar en baño
de agua caliente hasta la completa disolución del agar.
3.- Elabore tapones de algodón para cada Erlenmeyer. Luego de colocarlos cubra los
recipientes con papel e identifique el material con el nombre del medio, fecha de
elaboración y el nombre de la persona responsable de su preparación.
4.- Esterilice en autoclave a 121 °C por 15 min.
Preparación de Agar almidón

(Peptona, 1%; K2HPO4 ,0.5 %; almidón, 0.3% agar, 1.5%).
1.- Pese cuidadosamente el almidón necesario para preparar 100 ml de medio.
2.- Coloque el polvo en un Erlenmeyer de 250 ml con un volumen pequeño de agua
destilada que ha medido en la probeta.
3.- Caliente el recipiente con el almidón agitando constantemente hasta su disolución.
4.- Pese el resto de los ingredientes y agréguelos con la cantidad de agua destilada
restante.
5.-Lleve el medio al baño de agua caliente hasta la completa disolución del agar. Deje
enfriar ligeramente y ajuste el pH.
6.- Coloque en el Erlenmeyer un tapón de algodón a la medida, cubra con papel,
etiquete el material y esterilice a 121 °C por 15 minutos.
Preparación de Agar gelatina

(Peptona ,0.1%; extracto de levadura ,0.3%; gelatina, 0.4%; agar, 1.5%).
1.- Pese cuidadosamente la cantidad necesaria de cada ingrediente para preparar 100 ml
de medio.
2.- Coloque los ingredientes en un Erlenmeyer de 250 ml y agregue agua destilada
medida en probeta.
3.- Lleve el recipiente a licuar en baño de agua en ebullición hasta la completa
disolución del agar. Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH a 7.
4.- Acondicione su medio para esterilización como en los procedimientos anteriores.
Esterilice en autoclave a 121 °C por 15 minutos.
Cuestionario.
1. ¿Cuáles son las ventajas de los medios complejos para el cultivo de microorganismos?
2. ¿Por qué no es necesario ajustar el pp. en el caldo nutritivo y sí lo es en el agar
almidón?
3. Determine la naturaleza química y la función nutritiva de cada uno de los ingredientes
que contienen los medios que ha utilizado.
4. Describa la autoclave y su forma de uso.
5. ¿Qué otros métodos de esterilización se emplean para los medios de cultivo? ¿Qué
ventajas otorgan?
PRÁCTICA N°3
Tinción diferencial Gram y Tinción diferencial ácido resistente
I. Fundamento
Tinción diferencial Gram
Los microorganismos no sólo difieren químicamente de su entorno, sino también

muestran diferencias físicas y químicas entre ellos. Esto da lugar a que puedan
reaccionar diferencialmente ante un procedimiento de tinción. La tinción diferencial,
por lo tanto, nos permite distinguir entre grupos de microorganismos. En particular, la
tinción de Gram, es la más utilizada de las técnicas de tinción diferencial para distinguir
entre dos grupos de bacterias: Gram positivas y Gram negativas.
La diferencia entre estos dos tipos de células radica en la variación de capas que
conforman sus paredes. La pared de la gram- positivas es principalmente una gruesa
capa de peptidoglucano, mientras que las gram- negativas la pared es una multicapa
formada por una capa de peptidoglucano rodeada por una capa externa de proteína y
lipopolisacárido. La diferente permeabilidad de estas estructuras de superficie ante los
reactivos utilizados en las tinciones Gram, permite la diferenciación en la coloración
final.
La tinción de Gram requiere de cuatro soluciones: Un colorante básico, Un

mordiente, un agente decolorante y un contraste (otro colorante básico).
Las propiedades de los colorantes básicos ya fueron discutidas previamente. Un

mordiente es una sustancia que incrementa la afinidad entre la célula y el colorante, es
decir ayuda a la fijación del colorante en la estructura de interés. Ejemplos de
mordientes son ácidos, bases, sales metálicas, y yodo. Bajo la acción de un mordiente
una célula se tiñe más intensamente y es más difícil decolorarla. Un agente decolorante
es una sustancia que retira el colorante de una estructura teñida. Algunas células teñidas
se decoloran más rápidamente que otras, y está variación en la tasa de decoloración es la
que diferencia tipos de bacterias cuando la tinción Gram y otras tinciones diferenciales
se usan. El contraste es un colorante básico de un color diferente al usado inicialmente.
El propósito de su aplicación es da a las células decoloradas un color contraste con el
inicial. Aquellas células que no se decoloran rápidamente retienen el color del colorante
básico inicial, mientras que las células que se decoloran fácilmente toman el color del
contraste.
La tinción Gram se resume en lo siguiente: El primer paso es teñir la preparación
intensamente con un colorante básico, preferentemente el cristal violeta. Esto es seguido
de por un tratamiento de las células teñidas con un mordiente, por ejemplo, un
compuesto iodado como el lugol. La preparación luego es tratada con un agente
decolorante como el alcohol o alcohol-cetona. Las células que retienen el colorante
básico después de la decoloración son llamadas gram – positivas, y aquellas que son
decoloradas son gram-negativas, y pueden ser reteñidas con un contraste como la
safranina.
II. Objetivo
- Demostrar a través de la técnica de tinción diferencial de Gram la existencia de dos

grupos principales de bacterias.
- Distinguir a través de dos técnicas de tinción diferencial la presencia de endosporas

bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas normales.
III. Material y método
- Cultivos jóvenes de microorganismos (18-24horas): Bacillus sp; streptococcus sp;

Escherichia coli.
- Colorantes básicos: Cristal violeta; Safranina
- Decolorante: Alcohol-cetona
- Láminas porta objeto
- Mordiente: Lugol
- Papel secante
- Piseta de agua
- Soporte para tinción
- Asa de Kolle
- Aceite de inmersión.
Procedimiento.
1. Prepare una lámina fija de cada uno de los cultivos microbianos proporcionados y
una lámina fija con la mezcla Streptoccus y Escherichia coli
2. Agregue cristal violeta y deje que actúe por 30 segundos.
3. Enjuague con agua
4. Cubra la película teñida con lugol y deje que actúe por 30 a 60 segundos.
5. Enjuague con agua.
6. Decolore con alcohol acetona. Para una película delgada, la exposición al
decolorante por 10-20 segundos es suficiente.
7. Enjuague con agua
8. Aplique el colorante de contraste safranina por 30 segundos.
9. Enjugue con agua y seque la lámina al aire o dentro del papel secante.
10. Examine cada muestra bajo el objeto de inmersión
11. Elabore los esquemas correspondientes.
Tinción Diferencial Ácido-Resistente
La tinción ácido-resistente es una tinción diferencial que mide en células teñidas la

resistencia a la decoloración mediante ácido. La propiedad de ácido resistencia en ciertas
micobacterias y actinomicetos está correlacionada con su salto contenido lipídico. Teñir
estas bacterias requiere de un tratamiento de alta temperatura y la utilización de colorantes
fuertemente a fines.
El procedimiento consiste en teñir con carbolfucsina caliente, decolorar con una solución de
alcohol-ácido y reteñir con un contraste. Las bacterias ácidas en comparación a otros
microorganismos y retienen el color del colorante inicial.
Este tipo de coloración es utilizada en el estudio y diagnóstico de enfermedades causadas

por especies ácido-resistentes como los de la tuberculosis, la lepra, y también para la
diferenciación de estructuras resistentes como las endosporas bacterianas.
Tinción De Endosporas
Las especies del genero Bacillus y Clostridium producen una estructura denominada
endospora. A diferencia de la célula la endospora es una estructura resistente capaz de
sobrevivir por largos periodos en ambientes desfavorables, en condiciones extremas de alta
temperatura o bajo la acción de agentes desfavorables, en condiciones extremas de alta

temperatura o bajo la acción de agentes químicos.
Existen variadas técnicas que se utilizan para la tinción de endosporas. Destacan entre ellas
la técnica Dörner y la de Schaeffer & Fulton. En la primera se emplea carbol fucsina para
teñir la espora y nigrosina como agente decolorante y de tinción negativa; la espora se tiñe
de rojo, la parte vegetativa incolora y toda la estructura aparece sobre un fondo oscuro. La
técnica se Schaeffer y Fulton emplea carbolfucsina para teñir la espora, alcohol ácido como
decolorante y verde malaquita como colorante de contraste; la espora se tiñe de rojo y la
parte vegetativa de verde. Ambas técnicas emplean fenol y alta temperatura como agentes
coadyugantes para lograr la penetración de la Fucsina en la estructura de la espora.
Técnica de Dörner
Material
- Cultivo de 48 horas: Bacillus_sp; Clostridium sp.
- Aceite de inmersión
- Asa de Kölle
- Baño de agua a 100°C
- Lámina porta objeto
- Soluciones colorantes: Carbolfucsina, Nigrosina.
- Tubos con agua destilada estéril.
Procedimiento.
1. Haga una suspensión concentrada del organismo en 2 ó 3 gotas de agua destilada
contenida en un tubo pequeño de prueba.
2. Añada igual cantidad de carbolfucsina y coloque el tubo en un recipiente con agua
hirviendo por 10 min.
3. Transfiera una gota de la suspensión de células hervidas en un recipiente con agua
hirviendo por 10 minutos.
4. Agregue una gota de nigrosina y extienda la mezcla con ayuda de otra lámina hasta
obtener una delgada película.
5. Seque la lámina al aire o dentro del papel secante.
6. Examine al microscopio compuesto bajo un objeto en inmersión.
Técnica de Schaeffer y Fulton
Material
- Cultivo de 48 horas: Bacillus_sp; Clostridium sp.
- Aceite de inmersión
- Asa de Kölle
- Lámina porta objeto
- Mechero de alcohol
- Pinzas
- Soluciones colorantes: Carbolfucsina; verde malaquita.
- Solución decolorante: Alcohol ácido.
Procedimiento
1. Prepare una muestra fija del microorganismo proporcionado.
2. Agregue a la preparación carbolfucsina hasta cubrirla totalmente.
3. Con ayuda de una pinza, caliente la lámina con el colorante haciéndola pasar
ligeramente por la llama del mechero hasta que observe el desprendimiento de vapores.
4. Mantenga esta condición durante tres minutos , evitando que el colorante se seque o
entre en ebullición
5. La ve con alcohol ácido hasta que este resulte incoloro.
7. cubra la preparación con unas gotas de verde malaquita dejando que actúe por dos
minutos.
9. Seque la lámina al aire o dentro del papel secante.
10. Examine al microscopio compuesto bajo un objeto de inmersión.
Cuestionario
1. ¿Bajo qué circunstancia la tinción diferencial de Gram podría resultar errada?
2. Que efecto traería reemplazar el lugol con otro agente oxidante.
3. ¿Podría usted variar el colorante primario y el contraste obteniendo los mismos
resultados?
4. ¿Cuál es la influencia del pH? en la reacción Gram?
5. Liste cinco ejemplos de bacterias gram positivas y cinco de Gram negativas, señalando
su importancia.
6. ¿Cuál de los métodos utilizados le permitió observar mejor las endosporas bacteriana?
¿A qué atribuye la diferencia?
7. ¿Qué efecto producirá el reemplazar el alcohol ácido por otro decolorante como el
alcohol cetona?
8. ¿Qué otros géneros de bacterias pueden formar endosporas?
9. Revise otras técnicas de tinción de esporas y compárelas con las técnicas usadas en este
ejercicio. Destaque ventajas y desventajas.
}
+
PRACTICA N° 4
TÉCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS
Objetivo
 Conocer las diferentes técnicas de aislamiento en medios de cultivos sólidos para la
obtención de cultivos puros de bacterias.
 Identificar las diferentes formas de medios de cultivos de uso general, diferenciales y
selectivos para los cultivos de diferentes especies bacterianas.
Fundamento
Para iniciar un cultivo de microorganismos es necesario que un número de células
(inóculo) sea transferido (inoculado) a un medio fresco estéril .Si se quiere cultivar una especie
en particular a partir de una mezcla de microorganismos, deben emplearse técnicas de
aislamiento que permitan obtenerla en forma pura. Esto involucra un proceso seriado de varias
transferencias y la utilización de medios tanto comunes como especiales, mayormente sólidos,
seleccionados de acuerdo a la naturaleza del microorganismo. La técnica d cultivo por
aislamiento pueden ser realizada por:
a) Por estrías, que consiste en diseminar los microorganismos en la superficie se un

medio sólido dispuesto en placa Petri; si el inóculo inicial se encuentra sólido o en
polvo, es recomendable llevarlo a suspensión.
b) Por diluciones sucesivas, que consiste en hacer diluciones seriada de la muestra o del
inóculo inicial y disponer alícuotas de ellas en placas petri con medio. Las colonias de
varios microorganismos difieren en forma, tamaño, color, consistencia, por lo tanto su
apariencia en cultivo es importante para propósitos de identificación. Por otro lado, si
se tiene ya aislado un microorganismo, que a asume puro, desde un medio agotado en
nutrientes hacia un medio fresco. Las técnicas de transplante se realizan por lo
general en tubos de ensayo con medios líquidos o sólidos, siendo la práctica más
común de conservación de cepas (de forma aeróbicas y anaeróbicas facultativas), el
realizar estrías en tubos de agar inclinado.
En todo procedimiento de inoculación la aguja o asa de Kölle debe ser calentada “al rojo”
por flameo antes y después de la transferencia. El flameo destruye la formas vivas en la
superficie del filamento previniendo la contaminación .Durante la transferencia se debe sostener
el tubo de trabajo en la mano izquierda en posición casi horizontal y retirar el tapón
sosteniéndolo con los dedos anular y meñique de la mano derecha (asumir la posición inversa en
individuos no diestros). La boca del tubo de trabajo (tanto del que se va tomar el
microorganismo como del que se va a recibirlo) debe ser flameada antes y después de la
transferencia. Aparte de destruir los microorganismos en los bordes del tubo, el flameo crea
corrientes convectivas que disminuyen las probabilidades de contaminación.
Las técnicas de cultivo de aislamiento y transplante nos permitirán obtener los

microorganismos en forma pura y en estado activo así como el estudio de sus características de
crecimiento, el primer registro de datos en la identificación de todo microorganismo.
Figura 1. a) siembra masiva; b) estría simple; c) estría con fin capilar.
“TÉCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS: CARACTERÍSTICAS DE

CRECIMIENTO EN MEDIO DE CULTIVO.”
Objetivo
 Observar las características de crecimiento de los microorganismos al transplante en
medios de cultivo líquido y sólido.
 Materiales
- Cultivo de Microorganismos de 18 horas.

- Asa de kolle.
- Mechero.
- Tubos con agar nutritivo inclinado.
- Tubos con agar nutritivo vertical.
- Tubos con caldo nutritivo.
Procedimiento
1. Esterilice el asa de kolle por flameo a la llama.
2. Tome el tubo con el cultivo de 18 horas, retire el tap6n, flamee la boca del tubo al
mechero y obtenga una pequeña porción del cultivo con ayuda del asa de kolle. Flamee
la boca del tubo antes de volver a taparlo.
3. Tome el tubo con caldo nutritivo, y con los mismos cuidados anteriores
introduzca el asa en el líquido para dejar el inóculo. Homogenice la mezcla
girando el tubo entre las palmas de la mano.
4. Repita el procedimiento 1 para obtener m6s in6culo, pero usando esta vez aguja
de kolle.
5. Tome el tubo con agar inclinado y realice la siembra depositando el inóculo a lo
largo de una sola línea descrita desde la base de la inclinaci6n hasta el extremo.
6. Repita el procedimiento 1 para obtener inóculo, usando nuevamente aguja de
kolle.
7. Tome el tubo con agar vertical y realice la siembra por picadura profunda del
medio.
8. Rotule los tubos sembrados y póngalos a incubar a 37° C por 24 horas.
9. Cumplido el tiempo de incubación, evalué el crecimiento y anote sus resultados
en la hoja adjunta, según lo siguiente:
a) Crecimiento en estrías sobre agar inclinado

Cantidad: Escasa, moderada o abundante
Distribución en la superficie: Uniforme o irregular
Forma de crecimiento difuso, etc. Arborescente, equinulado, rizoide, filiforme.
Consistencia del crecimiento: Butiroso, viscoso, fibroso
Pigmentación Coloración del cultivo
b) Crecimiento en agar vertical por picadura profunda

Crecimiento: - Limitado a la línea de inoculación o picadura.
- Con propagación fuera de la línea de inoculación.
- Superficial o en profundidad o ambas a la vez.
c) Crecimiento en caldo nutritivo

Cantidad: - Escasa, moderada o abundante
Caldo - Turbidez, aparición de opacidad en el medio.
Apariencia o tipo: - Sedimento, depósito de células en el fondo del tubo;
- si el tubo se agita el sedimento se resuspende el y no disgregan
aun si el tubo se agita.
- Formación de película, masa de células en la superficie
del caldo.
- Mucosidad, depósito de células que permanecen adheridas.
Cuestionario
10. ¿Por qué algunos microorganismos desarrollan en caldo un característico crecimiento
tipo película? ¿Qué factores ambientales podrían alterar la formación de una película
superficial?
11. ¿Cuándo utiliza tubos de agra inclinado para el estudio de las características de
crecimiento? ¿Es preferible inocular con aguja de kolle
12. y no con asa? ¿Por qué?
13. ¿Qué factores influyen en la abundancia del crecimiento en caldo, agar? inclinado y
agar vertical
“TÉCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS: AISLAMIENTO Y

RECUENTO EN PLACAS”
Objetivo.
 Separar colonias individuales a partir de una mezcla de microorganismos utilizando técnicas
de aislamiento.
Materiales.
- Tubos de caldo conteniendo una mezcla de microorganismos (Serratia marceasen,
Bacillus sp., Escherichia coli, Mlcrococcus sp., Proteos sp.)
- Asa de kolle, aguja de kolle
- Mechero
- Tubos con 12 ml de agar nutritivo licuado y mantenido a 50° C.
- Placas petri estériles
- Placas con agar nutritivo
- Placas con Agar Mac Conkey
Procedimiento
a) Aislamiento por estrías
1. Tome el tubo de caldo que contiene la mezcla de microorganismos y con ayuda del asa
o aguja de kolle previamente esterilizada a la llama, retire inoculo. Considere todas las
recomendaciones antes dadas para el trabajo en asepsia.
2. Tome la placa con agar nutritivo con la mano izquierda y con ayuda de los dedos pulgar
e índice levante hacia un lado la tapa, procurando que la parte expuesta se encuentre bajo
la influencia de la llama del mechero. No descubra por completo la placa, así evitara
mayor contaminación. Con el asa cargada de inoculo, haga estrias sobre toda la
superficie del medio, procurando trazar una ultima estría en un espacio libre. Cierre la
placa.
3. Esterilice el asa a la llama nuevamente.
4. Repita los pasos 2 y 3 para la placa con agar Mac Conkey.
5. Coloque las places en incubaci6n a 37° C por 24 horas.
6. Observe el desarrollo de colonias individuales y describa sus características de forma,
elevación, consistencia, bordes, etc. Diferencie las características de las colonias
desarrolladas en el medio selectivo-diferencial.
Figura 2. Aislamiento por estrías.
b) Aislamiento por diluciones

1. Tome el tubo de caldo conteniendo la mezcla de microorganismos y con ayuda del asa
de kolle retire inoculo.
2. Tome un primer tubo de agar licuado y mantenido a 50° C y transfiera as6pticamente
el inoculo. Esterilice el asa a la llama del mechero. Con el tubo cerrado mezcle el
inoculo con el medio, haci6ndolo girar entre las palmas de las manos.
3. Transfiera una asada del agar mezclado con el inoculo hacia un segundo tubo de agar
licuado. Repita la operación anterior para obtener una mezcla homogénea.
4. Vierta el contenido de cada tubo por separado en dos placas petri est6riles y rótelas
lentamente para distribuir el medio de manera uniforme. Identifique cada dilución.
5. Incube las placas a 37° C por 24 horas.
6. Examine el crecimiento de las colonias en las placas. Haga un recuento de colonias, si
el estimado no es inferior a 30 ni superior a 300. Describa las características
diferenciales de las colonias observadas.
Figura 3. Aislamiento por diluciones.
Cuestionario
1. ¿Qué procedimiento seguiría a continuación del desarrollado en estos ejercicios para
obtener el cultivo puro de cada cepa contenida en la mezcla? ¿Como podríamos
comprobar que estas cepas obtenidas finalmente corresponden a las colonias
aisladas?
2. ¿Qué factores limitan el tamaño de las colonias en una placa de cultivo?
3. Suponga que recibe una muestra de leche en polvo y se le pide determinar el número
total de colonias por gramo. Plantee una metodología cuantitativa basada en diluciones
sucesivas para resolver el problema.
4. ¿En qué consiste la técnica del número más probable y que usos tiene?
5. ¿De qué manera se pueden preservar cepas puras por largos periodos?
6. ¿Qué técnicas de cultivo se emplean para aislar microorganismos anaeróbicos?
PRÁCTICA DE LABORATORIO Nº 6
OBSERVACIÓN DE ALGAS Y PROTOZOOS
I. Introducción
1.1 Las algas
Son un grupo de organismos que pueden ser unicelulares o pluricelulares, todas
con clorofila y algunas sustancias de reserva. Sus células, poseen pared celulósica y
una organización correspondiente a organismos eucariontes, sin embargo, no llegan a
formar tejidos diferenciados; es decir son Talofitas (cuerpo indiferenciado, sin raíz,
tallo ni hojas).
a. Forma:
Variada
 Unicelulares
 Pluricelulares
 Filamentosas, laminares y ramificadas.
b. Nutrición: son organismos autotróficos, es decir tienen la capacidad para

transformar sustancias inorgánicas en orgánicas con participación de energía
luminosa y clorofila.
c. Reproducción: Las algas se pueden reproducir en forma sexual (con gametos) y en

forma asexual (sin gametos).
d. Clasificación de algas
 División Clorofilas: Algas verdes
 División Crisófitas: Algas doradas
 División Rodófitas: Algas rojas
 División Feofitas : Algas pardas
 División Pyrrofitas: Dynoflageladas
1.2 Los protozoos
Actualmente los protozoos están incluidos dentro del reino Protista, donde se ubican
la mayoría de los organismos eucariontes unicelulares microscópicos (Torres y
Flores, 2001) Los modelos de organización de los protistas muestran una diversidad
considerable de formas, funciones y estrategias de supervivencia, la mayoría de los
protozoos son unicelulares llevan a cabo todas las funciones vitales utilizando
solamente los orgánulos de las células eucariotica. (Bruscas y Brusca, 2005). Los
protozoarios incluyen especies marinas, dulceacuícolas, terrestres, simbiontes, con
algunos organismos patógenos tanto de humanos, plantas y animales. Algunos se han
vuelto útiles en el estudio de la biología molecular. Se encuentran clasificados
aproximadamente 65,000 diferentes organismos como protozoarios, en la actualidad
un estudio más profundo de ellos ha mostrado las necesidades tratarlos en filo
separados, tanto en el caso de los de vida libre como los parásitos.
Clasificación
 Mastigosphora
 Sarcodina
 Ciliados
 Esporozooa
 Suctorios
II. Objetivo
Reconocer las especies de algas y protozoos en una muestra de agua de Laguna para
verificar sus nichos ecológicos y relaciones en beneficio de la calidad ambiental y de la
dinámica del ecosistema.
III. Materiales y métodos
3.1 Materiales
 Microscopio óptico
 Mechero Bunsen
 Rojo neutro
 Fucsina
 Lugol
 Formol
 Azul de metileno
 Laminas portaobjetos
 Laminillas
 Agua destilada
 Botella con muestras de agua
3.2 Metodología
1. Colocar una malla de 25 µm de diámetro a 40 cm de profundidad del lago donde
se va estudiar la diversidad microbiana, dejarlo por unos días.
2. Retirar la malla y llevarlo en la misma agua de origen
3. En un frasco incorporar formol al 5% y mezclar.
4. Lavar la malla con la solución de formol
5. Extraer todo el material adherido a la malla.
6. Filtrar la solución para concentrar la cantidad de especies.
7. Con ayuda de una pipeta llevar una gota de la solución a la lámina portaobjeto
8. Cubrir con laminilla
9. Colocar en el microscopio a 10 x, 20 x, 40 x
10. Dibujar las especies de algas y protozoos observados a 100 x
11. Teñir las muestras para mejorar las observaciones.
IV. Resultados y discusión

V. Conclusiones
VI. Cuestionario
1. Describa las funciones que cumplen los protozoos en los ecosistemas acuáticos.
2. Elabore un tipo de relación entre los protozoos y bacterias.
3. Describa la importancia de las algas en la producción de energía.
4. ¿Qué repercusiones tiene la presencia de algas y protozoos en los sistemas de distribución y
almacenamiento del agua de consumo humano?
Práctica N°7
OBSERVACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS Y
HONGOS DEL MEDIO AMBIENTE
I. Introducción
Los hongos forman el reino fungí; existen en forma unicelular como las levaduras que
son microscópicas y pluricelulares como los mohos y las setas. Los hongos están
formados por células eucariotas sin clorofila, que poseen una pared celular
caracterizada por la presencia de quitina (Prats, 2005). La mayoría de hongos se
reproduce por esporas.
Tortora, Funke y Case, (2007) señalan que los hongos son beneficiosos porque
participan de la cadena alimentaria porque descomponen la materia vegetal muerta y
de esta forma reciclan elementos vitales.
Estudiar los hongos nos permite observar sus beneficios al medioambiente como las
asociaciones simbióticas de hongos alga, hongos plantas y hongos animales. Estas
relaciones permiten beneficios mutuos, hoy se resalta la asociación de las micorrizas
en las plantas.
II. Objetivo
Observar el desarrollo de hongos misceleares y levaduriformes en sustrato de diferente
origen e identificar los géneros más frecuentes.

 Material infectado (con evidencias de crecimiento de hongos)
 Asa de Kolle o estilete
 Láminas porta y cubre objetos
 Solución colorante: azul de metileno
Procedimiento
1.- Observación macroscópica de hongos

 Observe cuidadosamente cada sustrato infectado y determine el tipo de colonia que
desarrolla.
Describa el aspecto externo de las colonias de hongos.
 Observación microscópica:
Coloque una gota de azul de metileno en un porta objeto limpio y desgrasado.
 Con ayuda del asa de Kolle en forma de gacho, extraiga una pequeña cantidad de u
micelio de una muestra y coloque en la gota de colorante.
 Coloque sobre la preparación la lamina cubre objetos
 Observe bajo el objetivo de 10 y 40 aumentos.
 Reconozca las estructuras más características del cuerpo vegetativo del hongo
 Elabore los esquemas que correspondan para cada observación.
 Con ayuda de láminas referenciales trate de identificar el o los géneros que observe.
2.-Aislamiento de hongos del medio ambiente.

Objetivo.
Aislar en medios de cultivos los diferentes géneros de hongos que frecuentan el medio
ambiente y determinar sus características .
Materiales.
Placas petri, con medios de cultivos para hongos (Agar sabouraud).
Procedimiento
1.- Elija u punto determinado en el ambiente que quiera evaluar.
2.- Destape la placa petri exponiendo al medio de cultivo al aire (Se asume que las
esporas de hongos se encuentran suspendidas). El tiempo de exposición puede ser de 5 a
10 minutos. Vuelva a tapar la placa identifiquela con su nombre, grupo y lugar
muestreado.
3.- Trabaje de manera similar para cada placa y lugar.
4.- En el laboratorio incube las placas en una estufa de 30 °C por cuatro o cinco días.
5.- Transcurrido el tiempo, examine las placas y realice una descripción detallada de las
mismas.
Cuestionario.
1.- ¿Que géneros de Hongos abundan frecuentemente en el medio ambiente?
2.- ¿Qué variaciones medio ambientales modificaría sustancialmente la presencia de hongos?
Formule su respuesta tomando en cuenta modificaciones en cantidades y en diversidades de
especies.
3.- ¿Podrían las especies de hongos patógenos estar presentes en el aislamiento de hongos que
usted realizo?
Práctica N° 8
Análisis microbiológico de aguas
I. Introducción
La demanda de agua dulce aumenta cada vez debido al crecimiento de la
población, la urbanización, las industrias, y por el aumento de la producción
(UNESCO, 2015). A la par se debe brindar fuentes de agua dulce de buena calidad
a las personas de todo el mundo, sin embargo, se observa que en los diferentes
países existe una carencia de servicios básicos de saneamiento, por esa razón se ha
incrementado enfermedades gastrointestinales que tienen relación con la mala
calidad del agua. Esta agua se convierte en un vehículo de transmisión de
enfermedades ocasionadas por patógenos como bacterias, virus, protozoos y otros
organismos que ocasionan problemas de salud pública.
Para garantizar un agua segura a la población se ha elaborado guías, reglamentos,

normas y protocolos de monitoreo y vigilancia del agua para consumo humano.
Para esto la calidad del agua es la condición de ausencia de cualquier sustancia
nociva que afecta las propiedades del agua y la salud del consumidor.
Ministerio de salud (2011) señala que el agua apta para el consumo humano, es toda
agua inocua para la salud que cumple los requisitos de calidad establecidos en el
Reglamento DS 031-2010 S.A. asimismo en el Artículo sesenta señala que los
parámetros microbiológicos y otros organismos Toda agua destinada para el
consumo humano, debe estar exenta de: 1. Bacterias coliformes totales,
termotolerantes y Escherichia coli, 2. Virus; 3. Huevos y larvas de helmintos,
quistes y ooquistes de protozoarios patógenos; 4. Organismos de vida libre, como
algas, protozoarios, copépedos, rotíferos y nemátodos en todos sus estadios
evolutivos; y 5. Para el caso de Bacterias Heterotróficas menos de 500 UFC/ml a
35°C.
1.1 Microorganismos relacionados con la contaminación en el agua

Para asegurar que el agua que consume una población es de buena calidad y en
la cantidad adecuada se debe verificar la calidad microbiológica para esto se
debe realizar:
 El análisis del agua de la fuente

 El análisis del agua inmediatamente después del tratamiento
 El análisis del agua en sistemas de distribución y/o el agua almacenada en
las casas.
Así misma vigilancia y monitoreo de la calidad porque:
 Los patógenos se hallan en forma discreta y no en solución
 Se encuentran siempre adheridos a los sólidos sus pendidos del agua
 La probabilidad de infección por patógenos depende de la invasibilidad y

virulencia del patógeno y de la inmunidad del individuo.
 En contraste con los agentes químicos, la dosis-respuesta del patógeno no es
acumulativa.
Grupo Coliformes
Son un grupo de bacterias en forma de bacilo, de la familia de los

Enterobacteriaceae, Gram negativas, aerobias y anaerobias facultativas que no
forman esporas y que fermentan la lactosa produciendo ácido y gas a 37°C en
un espacio de 24 a 48 horas (Gonzales, 2016).
Se utilizan como indicadores de contaminación en el agua, porque se encuentra
en el tracto digestivo de seres humanos y animales (Madigan, Markinko &
Parker, 2010).
Protozoos
Microrganismos eucariotas de vida libre, unicelulares y pluricelulares, viven en
colonias la mayoría son acuáticos. La preocupación por la presencia de estos
protozoos en el agua se debe a su gran impacto en salud y a sus mínimas dosis
infectivas. Algunos de ellos son: Entamoeba hystolitica, Giardia lamblia y
Crytosporidium.
Virus
Existen algunos virus que producen enfermedades gastrointestinales, sin
embargo no se encuentran normalmente en el tracto gastrointestinal del ser
humano.
Dosis Infectiva de Patógenos y parásitos relacionados con el agua

Agente Dosis Min. infectiva
BACTERIAS
 Salmonella spp. 104-107
 Shiguella spp. 101-102
 Escherichia coli 106-108
 Vibrio cholerae 103
VIRUS
V. Hepatitis A
PROTOZOARIOS 1-10
 Giardia intestinalis
 Cryptosporidium 101-102
 Entamoeba coli 101 quistes
HELMINTOS 101 quistes
Ascaris 1-10 huevos
1.2 Métodos de detección de organismos indicadores de contaminación en el

agua
Organización Panamericana de la Salud, (2004)
1.2.1 Técnicas por tubos múltiples

El método del NMP por tubos múltiples se fundamenta en un modelo de
cálculo de probabilidades. De acuerdo con la alternativa de siembra elegida,
se selecciona la tabla de NMP correspondiente para obtener los recuentos de
coliformes.
La técnica de fermentación en tubos múltiples es una alternativa para la

determinación de coliformes totales y termotolerantes y se recomienda para
el análisis de muestras de agua superficial que sirve como fuente de
abastecimiento. Es muy útil en el caso de aguas superficiales con una alta
densidad de partículas o coloreadas, que no pueden ser fácilmente
procesadas por la técnica de filtración con membrana. También se propone
este método para el análisis de agua potable, para lo cual se recomienda la
siembra de una serie de 10 tubos con volúmenes de 10 mililitros ó 5 tubos de
fermentación con volúmenes de 20 mililitros.
La técnica de fermentación en tubos múltiples para la determinación de

coliformes totales y termotolerantes consta de dos fases: la fase presuntiva y la
fase confirmatoria Organización Panamericana de la Salud, (2004).
1.2.2 Técnicas de filtración por membrana
La técnica de filtro de membrana se fundamenta en la filtración de un

volumen determinado de muestra (100 mililitros o volúmenes menores según
la densidad bacteriana esperada) a través de un filtro de membrana de 0,45
micrómetros de diámetro de poro, el cual es colocado sobre un medio de
cultivo específico y luego incubado a la temperatura adecuada.
El método de filtración con membrana para la determinación de

coliformes totales y termotolerantes está aceptado por el Standard Methods
for the Examination of Water and Wastewater (American Public Health
Association-American Water Works Association, 1999), que lo propone
como una alternativa para la determinación de los coliformes totales y
termotolerantes. Este método se recomienda para la determinación de
bacterias en muestras de agua potable y agua de origen subterráneo OPS,

(2004).
1.2.3 Técnica Presencia-ausencia
Es un procedimiento simplificado de la técnica de fermentación en tubos

múltiples para la determinación cualitativa de coliformes en agua destinada
al consumo humano. La prueba de presencia-ausencia considera la siembra
de 100 mililitros de muestra en el caldo P-A y está fundamentada sobre el
principio de que los coliformes deben estar ausentes en 100 mililitros de
agua potable. Esta prueba consta de dos fases: una presuntiva y otra
confirmativa. Si el resultado del análisis es positivo, puede ser necesaria la
determinación cuantitativa en una nueva muestra.
El método de presencia-ausencia es una alternativa para la determinación

cualitativa de coliformes totales y termotolerantes. Es más simple y
económica que las técnicas de tubos múltiples y de filtro de membrana, que
son pruebas cuantitativas OPS, (2004).
II. Objetivo
Determinar la calidad microbiológica de diferentes muestras de agua mediante el

método por tubos múltiples.
3.1 Materiales
Materiales Reactivos Equipos

Muestreo Botella de vidrio Agua destilada Phmetro de
200 ml campo
Guantes
Balde limpio
Sogilla
Análisis Coliformes Tubos de ensayo  Solución salina Mechero
totales Gradilla peptonada (aguas Bunsen
residuales y aguas Incubadora
Pipetas 0,1 ml; superficiales)
1ml; 10 ml  Caldo lauril
Pipeteador triptosa
Asa de siembra  Caldo verde
brillante bilis
Análisis Coliformes Tubos de ensayo  Caldo EC Mechero
termotolerantes Gradilla  Reactivo de Bunsen
Kovacs Incubadora
Asa de siembra
3.2 Metodología
3.3
1. Tomar la muestra de agua con una botella de vidrio o plástico autoclavable

de 250 ml. y guantes estériles.
2. Si el agua en estudio es potable se debe añadir 0,1 ml de tiosulfato de sodio
1,8%
3. (OMS, 1988) menciona que los tres tipos de agua que se pueden analizar
son: Agua de una corriente de agua (ríos), aguas con poco o sin movimiento
(reservorios, lagunas, lago) o agua depositada (tanque). Agua de un pozo
excavado o algo semejante, donde el acceso presenta una mayor dificultad.
Agua de un grifo en un sistema de distribución o de una bomba de mano.
4. Al tomar la muestra de río introducir la botella en contra de la corriente y a
una profundidad de 20 cm aproximadamente. En pozo utilizar un balde y
soga limpia y libre de contaminación (esterilizado). En caso de un grifo
abrir y dejar correr el agua por unos minutos luego abrir la botella y
colocarlo debajo del chorro de agua, cerrar y llevar de inmediato al
laboratorio.
Coliformes totales
Prueba Presuntiva
5. Para el análisis de agua potable, se recomienda la siembra de una serie de 5
tubos con volúmenes de 10 mililitros, 1 ml y 0,1 ml. Vaciar esta cantidad en
cada tubo de fermentación con caldo lauril triptosa.
6. Incubar a 37º C por 24 o 48 horas.
Prueba confirmativa
 Después de la incubación separar los tubos positivos.
 Con el asa de siembra previamente estéril sacar un inoculo de los tubos
positivos (producción de gas en tubos Durham) a los tubos nuevos con
caldo verde brillante bilis e incubar a 24 o 48 horas a 37º C. Figura Nº 1
Coliformes termotolerantes
 Pasado este tiempo, separar los tubos positivos para transferir un
inoculo a los tubos con caldo EC.
 Nuevamente incubar por 24 o 48 horas a 44,5 º C.
 Finalmente, pasado este tiempo retirar los tubos de la incubadora,
separar los tubos positivos (producción de gas en tubos Durham).
 Agregar reactivo de Kovacs para confirmar la presencia de E. coli con
un anillo rosa.
 Una vez realizado los análisis de coliformes totales prueba confirmativa
y coliformes termotolerantes registrar los tubos positivos y asignar un
código. Figura Nº2
Ejm.:
El código obtenido identificarlo en la tabla del número más probable.
7. Para el caso de agua superficial o residual se debe proceder a realizar

dilución, tomando 10 ml de la muestra y mezclar con 90 ml de agua de
dilución (solución salina peptonada o suero fisiológico).
8. Luego tomar una 3 serie de 5 tubos al cual se le agrega 10ml de muestra a
cada tubo, 1ml a la otra serie de 5 tubos y 0,1 ml a los 5 tubos restantes.
9. Luego de terminar de llenar las muestras incubar a 37 º C por 24 o 48 horas.
10. Repetir todo el proceso similar al del agua potable.
IV. Resultados y conclusiones

Cuestionario
1. ¿Cuál es el propósito de los análisis microbiológicos del agua?
2. Investigue los métodos de control de calidad del agua para consumo humano
3. Describa las características de los microorganismos coliformes
4. Explique la reacción de Kovacs
Referencias
1. Organización panamericana de la salud. 2004. Manual para análisis básico del
agua de bebida. CEPIS. Lima.
2. Ministerio de salud 2010. Reglamento de la calidad del consumo humano. Lima
3. La Organización de las Naciones Unidas para la Educación, la Ciencia y la
Cultura. 2015. Agua para un mundo sostenible. Programa mundial de
evaluación de los recursos hídricos. Italia.
Anexo
Práctica Nº 10
Evaluación microbiológica del aire en espacios exteriores
I. INTRODUCCIÓN
Los microorganismos no habitan en el aire, pero es un medio para dispersarlos. Los
microorganismos pueden ser transportados rápidamente, en forma de bioaerosoles,
a través de grandes distancias con el movimiento del aire que representa el mejor
camino de dispersión. Algunos han creado adaptaciones especializadas que
favorecen su supervivencia y su dispersión en la atmósfera (De la Rosa, 2002).
El transporte se realiza sobre partículas de polvo, fragmentos de hojas secas, piel,
fibras de la ropa, en gotas de agua o en gotas de saliva eliminadas al toser,
estornudar o hablar.
Adell, (2014) menciona que, el material particulado del aire se caracteriza por ser
una mezcla compleja y heterogénea de partículas de diferente origen, composición
química, forma, tamaño y densidad que determinan tanto su comportamiento
atmosférico como sus efectos sobre la salud y el medio ambiente (EPA, 2004). A la
asociación entre el PM y los microorganismos suspendidos en el aire se le
denomina bioaerosol. Éstos se definen como aerosoles que comprenden partículas
de origen o actividad biológica (esporas, hongos, virus, bacteria, toxinas y
alérgenos) que pueden afectar a seres humanos.
Muchas investigaciones han demostrado la presencia de microorganismos
bacterianos y fúngicos en el aire los cuales pueden causar enfermedades en plantas,
en animales y en el hombre; tal es el caso de Staphylococcus aureus, Pseudomonas
sp., Aspergillus spp., Fusarium sp., entre otros. De acuerdo a esto se han reportado
enfermedades como asma, bronquitis, pulmonías, neumonías que afectan
especialmente las vías respiratorias y otras como las infecciones cutáneas (Méndez,
Camacho y Echeverry, 2013).
II. OBJETIVOS
Determinar la presencia de microorganismos en el aire mediante el método de
sedimentación con Agar sangre.
III. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1 Material
Materiales Reactivos Equipos

Muestreo  10 Placas Petri Agua destilada GPS
con agar sangre
 Guantes
 Cronómetro
Análisis de  Microscopio  Violeta de  Mechero
microorganismos óptico genciana Bunsen
 10 Asa de  Lugol  Incubadora
siembra  Alcohol cetona  Contador de
 20 Lamina  Safranina colonias
portaobjeto  Aceite de
 20 Lamina inmersión
cubreobjetos
3.2 Metodología
Preparación del medio de cultivo
 El medio se prepara suspendiendo 40 grs de polvo en 1000 cc de agua
destilada a punto de ebullición, disolver hasta obtener una solución
homogénea, aplicar calor lentamente en constante agitación , no
permitir la ebullición , de esta forma aseguramos que los nutrientes no se
desnaturalicen. La reconstitución del medio se alcanza cuando el medio se
visualiza transparente a trasluz. Llevar a autoclave a esterilizar a 121ºC a 1
atmósfera de presión por 15 minutos ( Mantener variable de temperatura
constante).
 Enfriar hasta 50º C de temperatura que se registra en la práctica cuando el
dorso de la mano resiste el contacto con el matraz. Es importante que el
medio no registre mayor temperatura para lograr conseguir agar sangre
(temperaturas elevadas generan agar chocolate). Agregar la
sangre y homogeneizar.
Medir ph del medio en vaso de precipitado y asi evitar contaminación; el ph
del medio a 25ºC debe registrar 7.3 +/- 0.2
Su disposición en placa de petri estéril, alrededor de 4 mm de espesor unos
18 a 20 ml. Tener presente que debe plaquearse de inmediato después de
agregar la sangre ya que la temperatura baja y el agar se solidifica bajo los
40ª C.
 La totalidad del plaqueado en lo posible va a control de esterilización a 37º
C por 24 hr. Una muestra, en placa de agar sangre, se siembra
directamente sobre la superficie sólida del medio de cultivo. Siembra en
superficie por inoculo diluido en estrias zig-zag, o por hisopado para
depositar inoculo y posterior dilución en siembra en abanico. Se incuba por
24 hrs. a 37ºC.
Muestreo
 Seleccionar el lugar donde se realizará el estudio y el propósito.

 Ubicar la zona de muestreo, puntos de muestreo y número de muestras.
 Con ayuda de un GPS registrar los puntos de muestreo, altitud y temperatura
ambiental.
 Colocar las placas en los puntos seleccionados a una altura de 1 metro y
medio.
 Destapar las placas por un espacio de 10 minutos, 30 minutos y una hora.
 Tapar las placas
 Rotular las placas
 Incubar las placas por 24 horas
Recuento de colonias
 Pasado el tiempo se debe retirar las placas, observar las características de las
colonias, registrando las forma, color, borde y consistencia.
 Luego llevar la placa al contador de colonias y registrar el número de
colonias.
 Tinción Gram
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

V. CONCLUSIONES
VI. CUESTIONARIO

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Universidad Peruana Unión Ingeniería Ambiental

Autor: Gina Tito Tolentino

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3.1 Tipos de microscopios ópticos

3.2 Microscopio de campo claro

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3.2 Identificación de las partes del microscopio óptico

3.2.1 Señale las partes del microscopio:

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Contiene todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de microorganismos,

De acuerdo al tipo de microorganismo que se quiera cultivar de los medios pueden

Comunes. - Permiten el crecimiento indiscriminado de todo tipo de

Especiales. - Son formulados teniendo en cuenta exigencias nutricionales diversas o

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Se caracterizan porque se incluyen sustancias que favorecen el crecimiento de

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b) Crecimiento en agar vertical por picadura profunda

c) Crecimiento en caldo nutritivo

“TÉCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS: AISLAMIENTO Y

Figura 2. Aislamiento por estrías.

b) Aislamiento por diluciones

Figura 3. Aislamiento por diluciones.

b. Nutrición: son organismos autotróficos, es decir tienen la capacidad para