ESPECTROFOTOMETRÍA.

La espectrofotometríía se refiere a los meí todos, cuantitativos, de anaí lisis quíímico que
utilizan la luz para medir la concentracioí n de las sustancias quíímicas. Se conocen como
meí todos espectrofotomeí tricos y seguí n sea la radiacioí n utilizada como espectrofotometríía
de absorcioí n visible (colorimetríía), ultravioleta, infrarroja.

MÉTODOS ESPECTRO ANALITICOS

Un meí todo analíítico, depende del sistema quíímico observado y de la calidad de los
instrumentos utilizados para observarlo.
La cantidad de ruido presente en un sistema quíímico y/o instrumental determina la
concentracioí n de analito maí s pequenñ a que puede medirse con exactitud, y tambieí n fija la
precisioí n de la medida a concentraciones maí s grandes. Conforme las concentraciones
disminuyen hacia el nivel de traza o las fuentes de senñ ales se tornan deí biles, el problema
de distinguir las senñ ales respecto al ruido se hace cada vez maí s difíícil, ocasionando una
disminucioí n en la exactitud y la precisioí n de las medidas. La capacidad de un sistema
instrumental para discriminar entre senñ ales y ruido se expresa, usualmente como la
relación señal-ruido:
S/N = amplitud media de la senñ al / amplitud media del ruido
Varios paraí metros permiten caracterizar una medida o un meí todo analíítico:
1. El límite de detección mínimo, S, se define como la razoí n de cambio en la respuesta del
instrumento al cambiar el correspondiente estíímulo: concentracioí n, temperatura,
masa, etc, por ejemplo:
S = dG/dC donde G = Senñ al de salida, C = Concentracioí n del analito
La sensibilidad de un método analítico, S, se define como la pendiente, m, de la
curva de calibración, ya que eí sta define la razoí n de cambio de la propiedad medida por
unidad de concentracioí n.
Para los meí todos espectrofotomeí tricos, S = mcal = D A/ D C de la curva de calibracioí n
Absorbancia vs. Concentracioí n.
La sensibilidad tambieí n puede expresarse en teí rminos de concentracioí n como:
S = 0.0044/ mcal relacioí n cuyas unidades corresponden a concentracioí n.
El valor 0.0044 es la absorbancia que corresponde a la míínima diferencia medible
con precisioí n ( D T = 1.0% T ) en instrumentos con escala de % T entre 0.0 y 100.0 ; una
absorcioí n de 1% corresponde a 0.0044 unidades de absorbancia, aplicando:
A = log [100 / (100-% absorcioí n) ] = log [100 / ( 100-1)] = 0.00436
 Una respuesta no lineal en la graí fica de A vs C indica un cambio en el valor de la
sensibilidad en funcioí n de la concentracioí n. Conforme la concentracioí n del analito se
aproxima a cero, la senñ al desaparece dentro del ruido y se rebasa el líímite de deteccioí n.
2- El límite de detección mínimo (LD) ó la concentración mínima detectable es un
paraí metro estadíístico que ha sido muy controvertido. Diferentes autores han dado
diversas definiciones y metodologíías para su determinacioí n experimental. Actualmente,
algunos autores lo definen como la cantidad o concentración mas pequeña del analito
que produce una señal XL significativamente diferente de la señal del ruido de fondo
Xb. ( Analyst, 1987,112,199-209)
El criterio utilizado para que la concentración mínima detectable sea
distinguible con certeza (significativamente diferente o estadíísticamente diferente) del
ruido de fondo es que la diferencia entre la señal del analito, de concentracioí n muy baja,
y la señal de los blancos sea igual a tres veces la desviación estandar de la señal de los
blancos, utilizados para medir el ruido de fondo. Es decir que:

en donde XL es la señal límite, obtenida para la concentracioí n míínima detectable de

analito, Xb es la senñ al promedio de los blancos, y s b es la desviacioí n estaí ndar de las lecturas
del blanco.
Experimentalmente, el líímite de deteccioí n se determina involucrando todos los
factores que afectan la medida y se define , en general, para obtenerlo en unidades de
concentracioí n como:
LD = 3sb / mcal bajas concentraciones
Donde, sb = desviacioí n estaí ndar de los blancos, mcal es la pendiente de una curva de
calibracioí n del sistema, preparada a muy bajas concentraciones. Este criterio es
recomendado por IUPAC.
Aplicado a los meí todos espectrofotoí meí tricos, entonces, sb = desviacioí n estaí ndar de los
blancos en absorbancia y mcal pendiente de la curva de calibracioí n (A vs C) en unidades de
Absorbancia/Concentracioí n, por lo tanto, al calcular la relacioí n el líímite de deteccioí n se
obtiene en unidades de concentracioí n.
Otros autores, utilizan para calcular el líímite de deteccioí n, la siguiente expresioí n:

En donde C nominal es la concentracioí n del patroí n de baja concentracioí n y C promedio

corresponde al promedio aritmeí tico, de las concentraciones halladas experimentalmente

por interpolacioí n (despueí s de interpolar la absorbancia en una curva de calibracioí n), de
por lo menos diez replicas de la solucioí n de baja concentracioí n. Este criterio aunque no lo
recomienda IUPAC es muy utilizado en diferentes laboratorios.
3- El límite de detección máximo: Se define como la maí xima concentracioí n de un analito
que se puede analizar. Generalmente, lo que ocurre, es que las soluciones se hacen tan
concentradas, que en el caso de los meí todos espectrofotomeí tricos, toda la luz es atrapada
por el analito y tenemos una situacioí n equivalente al ajuste del 0 % de transmitancia. En
este caso, el detector no diferencia dos soluciones de concentraciones altas. La
determinacioí n queda limitada a concentraciones menores del valor de líímite de deteccioí n
maí ximo, pero en este caso, a diferencia del líímite de deteccioí n míínimo, el problema se
soluciona faí cilmente mediante una dilucioí n adecuado. En el caso del líímite de deteccioí n
míínimo, las soluciones son concentrar la muestra o usar otra teí cnica con líímite de
deteccioí n menor. El líímite de deteccioí n maí ximo, se puede obtener de la parte superior de
la curva de Ringbom, como se veraí maí s adelante.
4-Límite de cuantificación: Corresponde a la cantidad o concentracioí n del analito a partir
de la cual es confiable realizar determinaciones cuantitativas y se define como:
Límite de cuantificación = LQ = 10s b / m cal bajas concentraciones
5- La precisión de una medida o de un método analítico tambieí n se determina por un
parámetro estadístico que indique la dispersión de las medidas con relacioí n al valor
medio la mediana o la moda de la medida realizada. Generalmente se expresa por la
desviación media o desviación estándar. En los meí todos espectrofotomeí tricos se
determina tanto la precisioí n del instrumento como la del meí todo en general..
La precisioí n del instrumento se define entonces por el error instrumental o error
fotométrico D T. Experimentalmente se obtiene midiendo la transmitancia de unas 10-20
porciones de una solucioí n y calculando la desviacioí n media de esas mediciones. Cada
medida debe incluir las operaciones de vaciado, llenado y colocacioí n de la celda en el porta
celdas, asíí como el ajuste del 0.0% T (con el obturador) y del 100% T con el disolvente
puro.
6- El error fotométrico o instrumental que indica la repetibilidad de las lecturas en un
espectrofotoí metro es comuí n tomarlo como:
D T = 2S T- T promedio / n , el doble de la sumatoria de las desviaciones de las lecturas de T
con respecto a la transmitancia promedio T , en valor absoluto, dividido entre el nuí mero
de datos, n.
Sobre la determinacioí n de la precisioí n del meí todo analíítico se comentaraí posteriormente.
La calidad de las medidas, como se observa, depende del ruido de fondo, ya sea del ruido
originado por los componentes del instrumento o ruido instrumental o el ruido originado
por la matriz de análisis del sistema químico.
Las principales fuentes de ruido instrumental asociados a dispositivos eleí ctricos o
electroí nicos en estado soí lido son:
- Ruido térmico: originado por el movimiento teí rmico de los electrones en las resistencias
u otros elementos resistivos de un circuito eleí ctrico. Su magnitud se calcula por:
Vrms = ( 4kTR D f )1/2
Donde Vrms es el ruido medio cuadraí tico en el voltaje, dentro de una banda de frecuencias
D f, k constante de Boltzmann (1.38x10-16 erg / grado) ,T temperatura absoluta.
- Ruido de disparo o de golpeteo: tiene origen cada vez que una corriente transfiere
electrones u otras partíículas cargadas a traveí s de uniones o cuando los portadores de
carga atraviesan las uniones n-p, o llegan a la superficie de los electrodos. Su magnitud se
calcula por:
irms = (2IeD f )1/2 ,
Donde i rms es la fluctuacioí n de la corriente media cuadraí tica relacionada con la corriente
media I, e es la carga del electroí n 1.6x10-19 coulombs y D f el ancho de la banda de
frecuencia considerado.
- Ruido de parpadeo o fluctuación: Su magnitud es inversamente proporcional a la
frecuencia de la senñ al observada, se denomina ruido 1/f. Su magnitud es importante para
frecuencias menores que 100 Hz.
Existe otro tipo de ruido que es el ambiental el cual implica la transferencia de energíía
desde los alrededores hasta el sistema de medicioí n. Las fuentes comunes son: campos
eleí ctricos y magneí ticos, producidos por las lííneas de transmisioí n de potencia a 60Hz y sus
correspondientes armoí nicos; energíía radiante reflejada, vibraciones mecaí nicas y las
interacciones eleí ctricas entre los diferentes instrumentos.
El ruido instrumental se mide por la desviacioí n estaí ndar de la senñ al producida por los
blancos, razoí n por la que este paraí metro aparece en la determinacioí n del líímite de
deteccioí n.

METODO COLORIMÉTRICOS
Fotometría.
Dentro de los meí todos colorimeí tricos, un gran nuí mero de determinaciones que se
realizan habitualmente en el laboratorio, utiliza medidas de energíía radiante, ya sea
emitida, absorbida o reflejada. Estas medidas se determinan a traveí s de teí cnicas
fotomeí tricas. Las teí cnicas fotomeí tricas tienen su fundamento en las interacciones de
las radiaciones electromagneí ticas sobre la materia.
 Radiaciones Electromagnéticas

Pueden considerarse como un conjunto de corpuí sculos, llamados fotones, los cuales
llevan asociada una onda. La energíía de radiacioí n esta relacionada con la longitud de
onda. Las longitudes de onda maí s cortas poseen mayor energíía que las longitudes de
onda maí s largas. De tal manera que podemos hablar de un espectro electromagneí tico
constituido por las radiaciones electromagneí ticas, mismo que se ha dividido en varias
regiones, de acuerdo con la longitud de onda (λ) y la energíía.

1. Rayos X (1-100 nm)

2. Ultravioleta (100-390 nm)
3. Visible (390-700 nm)
4. Infrarrojo (700-100 000 nm)
5. Microondas (100 000- 1 000 000 nm)

MÉTODO ESPECTROFOTOMETRICO
un meí todo espectrofotomeí trico para que sea cuantitativo son:
Que el meí todo sea selectivo al analito que se desea analizar.
Que esteí libre de interferencias que afecten el resultado analíítico oí que las interferencias
se puedan controlar.
Que tenga alta precisioí n y exactitud.
Que tenga una alta sensibilidad y
Que el líímite de deteccioí n corresponda a una concentracioí n baja.

Experimentalmente para el establecimiento de un meí todo espectrofotomeí trico, despueí s

de optimizar las condiciones quíímicas del sistema (pH, temperatura, control de
interferentes, concentracioí n adecuada de reactivos, solvente apropiado, proteccioí n a la luz
para evitar reacciones fotoquíímicas, etc.) que garanticen que se tiene la especie de intereí s
en condiciones adecuadas para la medida, se establecen los siguientes paraí metros:

1-Longitud de onda analítica: Se escoge mediante el registro y/o la observacioí n de la

curva espectral o espectro de la sustancia que indicaraí si es adecuado tomar la longitud de
onda de maí xima absorcioí n u otra banda caracteríística de la sustancia como longitud de
onda para realizar las medidas, la longitud de onda escogida se conoce como longitud de
onda analíítica.
2- Intervalo óptimo de concentraciones : Se debe trabajar, en lo posible, con
concentraciones que permitan que se cumpla la ley de Beer, con el fin de obtener una curva
de calibracioí n que tenga una relacioí n lineal.

Para obtener el intervalo oí ptimo de concentraciones primero se construye la curva de

Ringbom, que consiste en construir una graí fica de absortancia (100- %T) vs. lg
Concentración. Los datos se obtienen preparando una serie de soluciones patroí n del
analito, que cubran una variacioí n de por lo menos dos oí rdenes de magnitud de
concentracioí n de este y se miden las transmitancias correspondientes a la longitud de
onda analíítica escogida. Para la mayoríía de los sistemas la curva de Ringbom corresponde
a una curva en forma de S. La parte lineal de esta graí fica permite obtener el intervalo de
concentraciones oí ptimo o el intervalo que presentara una relacioí n lineal entre
absorbancia y concentracioí n. En esta graí fica, los cruces de la parte recta (la intermedia),
con la parte baja y con la parte alta, pueden servir para determinar un valor para los
líímites de deteccioí n míínimo y maí ximo, respectivamente.

3- Curva de Calibración: Con los datos de la parte recta de la curva de Ringbom se

construye la curva de calibracioí n Absorbancia ( en las ordenada ) vs. Concentración (en
la abcisa) previo ajuste de los datos por mínimos cuadrados (que incluyen el punto 0.0,
0.0000) revisando que el coeficiente de correlación sea estadísticamente significativo.
La graí fica de la recta de calibracioí n debe incluir los puntos experimentales. La recta
ajustada tambieí n se conoce con el nombre de curva de trabajo.

4- Curva de Crawford: Con todos los datos obtenidos para la curva de Ringbom, se calcula
el error analíítico por unidad de error fotomeí trico, y se construye la curva del error para el
sistema de intereí s, previa determinacioí n experimental del error fotomeí trico o
instrumental. Si no se conoce D T, entonces solo se puede obtener (D C/C)/D T.

5- Sensibilidad del método analítico: Se calcula la sensibilidad del meí todo de la

pendiente de la curva de calibracioí n y se expresa como se indicoí anteriormente.

Límite de detección: Se preparan, por lo menos, diez soluciones del blanco de

procedimiento, se leen las transmitancias o absorbancia respectivas y se calcula como se
indicoí anteriormente.
Precisión del método. Carta de dispersión: La precisioí n indica la dispersioí n de las
medidas o la variabilidad del meí todo. La precisioí n se mide mediante un paraí metro
estadíístico de dispersioí n, generalmente se utiliza la desviacioí n estaí ndar, S:
S = [å ( X- X promedio)2 /( n -1)] 1/2
donde X es la variable medida concentracioí n, absorbancia, etc., X promedio el valor medio de
la variable medida y n el nuí mero de medidas o datos. Un valor pequenñ o de desviacioí n
estaí ndar con relacioí n al valor medio, indica que las medidas presentan poca dispersioí n o
que son precisas. En muchos casos, se observa si todos los datos de una serie de medidas
caen entre el valor medio y maí s o menos dos desviaciones estaí ndar, X promedio ± 2S, si es asíí,
se dice que el meí todo tiene una precisioí n del 95 %.
El procedimiento que se sigue para obtener los datos que permitan el calculo de la
desviacioí n estaí ndar en concentracioí n, se ilustra a continuacioí n: Se preparan, por lo
menos, diez soluciones patroí n del analito de la misma concentracioí n (concentracioí n que
produzca una transmitancia cercana a 37.0%) siguiendo todos los pasos del
procedimiento, se lee su transmitancia, se calcula la absorbancia para cada solucioí n, se
interpolan los valores en la curva de calibracioí n y se obtienen las concentraciones
respectivas. Con las concentraciones halladas se obtiene el valor promedio de
concentración y la desviación estándar, S, que corresponde a la medida de la dispersioí n
de los datos. Se construye la carta de dispersión de los datos y se calcula el coeficiente de
variación del método asíí: % Coeficiente de variación = (desviación estándar / valor
medio)

Fotometría de Absorción
Queí sucede cuando las moleí culas absorben o emiten luz? Por queí diferentes sustancias
absorben radiacioí n de soí lo cierta energíía especíífica, o frecuencia o longitud de onda, en las
diferentes zonas del espectro electromagneí tico o por queí una sustancia permite la
transmisioí n de luz de ciertas longitudes de onda o energíía mientras otras energíías o
longitudes de onda son absorbidas en forma selectiva?
Coí mo se produce y queí efectos tiene sobre las sustancias la interaccioí n del campo eleí ctrico
y/o magneí tico de la radiacioí n sobre la materia que a su vez esta constituida por partíículas
que tambieí n generan o poseen campos eleí ctricos y/o magneí ticos? Queí sucede con la
energíía de aí tomos y moleí culas cuando absorben o irradian luz de una cierta frecuencia o
energíía?
Las diferentes observaciones realizadas, a traveí s de muchos anñ os, desde diferentes campos
de la ciencia han llevado al planteamiento de diferentes modelos y varias teoríías para
responder el fenoí meno de la absorcioí n y emisioí n de luz por aí tomos y moleí culas. Algunas
teoríías han sido rebatidas porque los hechos experimentales las contradicen, otras se han
mantenido y confirmado porque los hechos experimentales o son explicados por ellas o la
confirman.
El conocimiento actual, tanto teoí rico como experimental indica que la absorcioí n y emisioí n
de luz por parte de las sustancias se origina en la estructura misma de las moleí culas y de
los aí tomos. El tamanñ o, la forma, la flexibilidad de las moleí culas, la distribucioí n de los
electrones en aí tomos y moleí culas, es decir la estructura de la sustancia origina la
especificidad en la radiacioí n absorbida por ellas o emitida por ellas.
La espectroscopia es el campo de la ciencia que estudia los espectros de las sustancias y la
relacioí n entre la absorcioí n y/o emisioí n de luz con la estructura de la materia. Si se observa
absorcioí n de luz se denomina espectroscopia de absorcioí n y si se observa emisioí n de luz,
espectroscopia de emisioí n. Seguí n la zona del espectro utilizada, se clasifica como:
Espectroscopia Mossbauer o de rayos g , de rayos X, espectroscopia ultravioleta, visible,
infrarroja, de microondas, de resonancia spin electroí n, de resonancia magneí tica nuclear,
etc.

Dentro de la fotometríía de absorcioí n, uno de los aparatos maí s utilizados en la

determinacioí n de las concentraciones de los analitos es el espectrofotoí metro; que es un
instrumento que utiliza medidas de absorcioí n de las radiaciones electromagneí ticas.
Ademaí s eí ste seraí nuestra principal herramienta de trabajo, ya que en eí l se haraí n las
lecturas de absorbancia para la determinacioí n de las concentraciones de los diferentes
analitos a determinar durante el semestre.
Las determinaciones por espectrofotometríía requieren que se lleve a cabo previamente
una reaccioí n quíímica especíífica que varia seguí n el analito a determinar. Los productos
finales de esta reaccioí n son los que se cuantifican utilizando la lectura de la absorbancia
de la muestra, asíí como la de estaí ndares conocidos (Calibradores).
Las determinaciones en el Laboratorio requieren un control de calidad por lo que es
importante obtener los valores de desviacioí n Standard.

El principio del Espectrofotoí metro esta basado en la Ley de Lambert-Beer, que

relaciona la intensidad de luz incidente y la de la luz transmitida, cuando es
atravesada una longitud de onda de un medio que absorbe.

Estaí basada en la Ley de Lambert-Beer, que relaciona la intensidad de luz incidente y la de

la luz transmitida, cuando es atravesada una longitud deonda de un medio que absorbe.
Material para la espectrofotometría
 Rango de Trabajo: 200-6400 cm-1.
 Detector DTGS-CsI.
 Diaí metro de apertura variable.
 Interferoí metro de sistema AutoTune (alineacioí n dinaí mica).
 Purga continua de CO2.
 Accesorio interno de reflectancia total atenuada, dotado con cristal de ZnSe, que
permite obtener espectros de infrarrojo de soí lidos y lííquidos en un rango de
trabajo de 650-6400 cm-1.
 Libreríía de espectros.
 Celda de gases para anaí lisis de los gases desprendidos en el analizador
termogravimeí trico (ver foto).
Espectrofotometro ultravioleta visible 4200

Longitud de Ancho de Concentración

Exactitud
onda banda /RS 232
Modelo
325-1000
4200/20 +/- 0.8% T 5 nm Si
mm
200-1000
4200/51 +/- 0.8% T 5 nm Si
mm
320-1000 +/-
4210/20 5 nm Si
nm 0.004A@0.5A
190-1000 +/-
4210/50 5 nm Si
nm 0.004A@0.5A
190-1000 +/-
4250/50 5 nm Si
nm 0.004A@0.5A

Espectrofotometro visible 4100

Longitud de Ancho de Concentración

Exactitud
onda banda /RS 232

Modelo

4100 360-1000 mm +/- 2% T 8 nm No

4110 RS 330-1000 mm +/- 2% T 8 nm Si

4110 UV 200-450 mm +/- 1% T 6 nm Si

Espectrofotometro UV-VIS con barrido 4418

Exactitud Ancho de banda Concentración/RS 232

Longitud de onda
 200-1100 nm +/- 0.002A@0.5A 2 nm Si

Espectrofotometro UV-VIS de doble haz. 4419

Ancho de banda Concentración/RS 232

Longitud de onda

190-900 nm 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 y 5.0 nm Si

¿Se refiere al meí todo quíímico cuantitativo de anaí lisis quíímico que utilizan la luz para
medir la concentracioí n?
A) Método de la espectrofotometría
B) Meí todo analíítico
C) Meí todo de la absorcioí n
D) Meí todo calorimeí tricos
C) Meí todo Lambert-Beer
¿Se define como la maí xima concentracioí n de un analito que se puede analizar?
A) El límite de detección máximo
B) El límite de detección mínimo
C) El límite de detección mínimo
D) Límite de cuantificación
E) La precisión de una medida

¿Campo de la ciencia que estudia los espectros de las sustancias y la relacioí n entre la
absorcioí n y/o emisioí n de luz?
A) La espectroscopia
B) La espectrofotometríía
C) La fonometríía
D) La espectrofotometríía analíítica
E) La espectrofotometríía de absorcioí n
¿Coí mo se le denomina a la relacioí n entre la absorcioí n y/o emisioí n de luz con la estructura
de la materia?

A) La espectroscopia
B) La espectrofotometríía
C) La fonometríía
D) La espectrofotometríía analíítica
E) La espectrofotometríía de absorcioí n

¿Es uno de los aparatos maí s utilizados en la determinacioí n de las concentraciones de los
analitos?
A) Espectrofotómetro
B) Calibradores
C) Espectroscopia
D) Fotoquíímicas
E) Calculador de exactitud

¿Se escoge mediante el registro y/o la observacioí n de la curva del espectro?

A) Longitud de onda analítica
B) Intervalo optimo
C) Curva de calibracioí n
D) Curva de Crawford
E) Meí todo analíítico
¿Cuaí l es la ley que relaciona la intensidad de luz incidente y la de la luz
transmitida?
A) Ley de lambert-Beer
B) Ley de crawford
C) Ley de Beer
D) Ley de la espectrofotometríía
E) Ley de la absorcioí n de luz

¿Es un conjunto de corpuí sculos llamados fotones, los cuales llevan asociada una onda?
A) Radiaciones Electromagnéticas
B) Espectrofotometrico
C) Ondas largas
D) Ondas cortas
 E) Fotones

¿Nombre que recibe el instrumento para determina tanto la precisioí n del instrumento
como la del meí todo en genera?
A) Error instrumental o error fotométrico
B) Ruido intomental
C) Sistema quíímico
D) Valor medio
E) Error de calculo

¿Tipo de ruido que cada vez que una corriente transfiere electrones u otras partíículas
cargadas a traveí s de uniones?
A) Ruido de disparo o de golpeteo
B) Ruido térmico
C) Ruido de parpadeo o fluctuación
D) Ruido electromagneí tico
E) Ruido de ondas