Manual de Bioquímica 2019-1

2019 - 1
DATOS DEL ESTUDIANTE
 APELLIDOS Y NOMBRES:
 CÓDIGO DE ESTUDIANTE: APODERADO:
 DIRECCIÓN:
 CORREO PERSONAL:
 Correo crece: @crece.uss.edu.pe
 FACULTAD:
 ESCUELA PROFESIONAL:
 SEMESTRE ACADÉMICO: CICLO y SECCIÓN:
 TURNO DE PRÁCTICA: No DE MESA:
G
Guzmán Vigo César, Alarcón Benavides Edwin, Moreno Echeandía Gustavo 2019 -1
PRESENTACIÓN
Los análisis que se llevan a cabo en un laboratorio de Bioquímica tienen como objetivo separar, caracterizar,
modificar o cuantificar biomoléculas. En la mayoría de los casos se trabaja con muestras complejas que
contienen un gran número de biomoléculas distintas. Por este motivo, las técnicas y los métodos utilizados
tienen que ser altamente específicos y su determinación se basa en las propiedades físicas, químicas o
bioquímicas de las biomoléculas. Los conocimientos metodológicos para estudiar las biomoléculas avanzan a
pasos agigantados y en la mayoría de los casos se requieren de reactivos y equipos costosos, que se van
perfeccionando y simplificando con el avance de la ciencia y la tecnología. De otro lado, el análisis de tejidos y
pruebas para los fluidos corporales, que se aplican en la bioquímica clínica, son fundamentales para el cuidado
de los pacientes, contribuyendo significativamente al diagnóstico, tratamiento, seguimiento y pronóstico de la
mayoría de padecimientos en el hombre.
La Bioquímica es la ciencia que se encarga de estudiar desde una perspectiva química la estructura y las
funciones de los seres vivos, comprendiendo las sustancias que se encuentran presentes en ellos y las
reacciones químicas fundamentales en los procesos vitales; constituyéndose en una de las ciencias más
importantes en la formación básica de los estudiantes que cursan una carrera en ciencias. A pesar del
espectacular desarrollo que en los últimos años vienen experimentando las ciencias aplicadas y sus diversas
tecnologías, la vigencia y trascendencia de las ciencias básicas se mantiene debido al notable papel que tienen
como generadora de conceptos, principios y teorías que configuran el soporte teórico de toda invención
tecnológica.
El presente Manual de Laboratorio de Bioquímica, pretende ser un instrumento que contribuye a alcanzar las
competencias curriculares propuestas para el estudiante a través del desarrollo de actividades, revisiones en
publicaciones arbitradas, revisiones bibliográficas electrónicas, observaciones y evaluaciones en cada sesión
práctica. La presente edición del Manual lleva las correcciones y sugerencias observadas en ediciones
anteriores, también se han incorporado nuevas prácticas que permitirán ampliar el área de conocimientos del
estudiante en esta asignatura.
La presente edición se ha elaborado teniendo en cuenta los insumos adquiridos para los laboratorios en el
presente ciclo académico. Es nuestro deseo que el presente manual pueda ayudar al estudiante en la
comprensión teórica y ejecución práctica de la asignatura y en la apertura de investigaciones básicas en el gran
campo de las Ciencias de la Salud. Se espera que el esfuerzo desplegado, cumpla su cometido en bien de una
óptima formación profesional y una mejor comprensión del papel importante que cumple el estudio de la
Bioquímica en el campo de las Ciencias Biomédicas. Así mismo se esperan las valiosas sugerencias de colegas
y estudiantes que permitan el perfeccionamiento de este manual en ediciones futuras.
LOS AUTORES
G
ÍNDICE
Página
PRESENTACIÓN 2
ÍNDICE 3
NORMAS, RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO
DE BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA 4
PRÁCTICA No 1: BIOSEGURIDAD Y MANEJO DE EQUIPOS E INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN
BIOQUÍMICA 6
PRÁCTICA No 2: ESPECTROFOTOMETRÍA 15
PRÁCTICA No 3: OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE Y MANEJO DE SUERO Y PLASMA 20
PRÁCTICA No 4: METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: DETERMINACIÓN DE GLICEMIA 27
PRÁCTICA No 5: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE COLESTEROL LÍQUIDO 31
PRÁCTICA No 6: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE TRIGLICÉRIDOS 34
PRÁCTICA No 7: DETERMINACION CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS TOTALES 38
PRÁCTICA No 8: DETERMINACIÓN DE AMILASA LÍQUIDA 43
PRACTICA N⁰ 9: DETERMINACIÓN DE CALCIO 47
PRÁCTICA No 10: DETERMINACIÓN DE FOSFATASA ALCALINA 50
PRÁCTICA No 11: DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS AST /ALT 54
PRÁCTICA No 12: DETERMINACIÓN DE CREATININA Y BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA 58
PRÁCTICA No 13: EXAMEN COMPLETO DE ORINA 65
PRÁCTICA No 14: DETERMINACIÓN DE ÍNDICES HEMATIMÉTRICOS 70
PRÁCTICA No 15: PRUEBAS GENERALES DE COAGULACIÓN 75
PRÁCTICA N° 16: EVALUACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONAL 82
BIBLIOGRAFÍA 92
G
4
NORMAS, RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES PARA EL TRABAJO EN EL

LABORATORIO DE BIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
El trabajo en el laboratorio, requiere la observación de una serie de normas de seguridad, a fin de evitar posibles
accidentes debido a desconocimiento de lo que se está haciendo a una posible negligencia. Quien trabaja en el
laboratorio está expuesto a muchos riesgos, pues hay productos químicos que son tóxicos, inflamables, explosivos,
corrosivos, carcinogénicos y, a veces, existe el peligro derivado del uso de altos voltajes, de luz ultravioleta y otras
radiaciones.
I. NORMAS PERSONALES
1. Seguir las instrucciones y recomendaciones dadas por el docente para cada sesión práctica. No manipule
muestras, materiales, instrumentos o equipos por su cuenta.
2. Procure ingresar al laboratorio a la hora señalada, con el guardapolvo puesto y con el material de trabajo
previamente solicitado.
3. Es conveniente la utilización de guardapolvo (mandil) ya que evita que posibles sustancias químicas lleguen a la
piel; además, se evita posibles deterioros de las prendes de vestir. El guardapolvo es de uso exclusivo en el
laboratorio, hay que sacárselo si se va abandonar el mismo.
4. Si se tiene el cabello largo, es conveniente llevarlo recogido.
5. Durante su permanencia en el laboratorio aproveche y use adecuadamente el tiempo, materiales de trabajo,
agua, corriente eléctrica, gas, mobiliario y espacio.
6. No arroje desechos a los lavaderos ni al piso. Procure colocarlos en los tachos correspondientes para que sean
descartados una vez finalizada la práctica. En el tacho con bolsa ROJA, se desechan los residuos de materiales
biológico (restos vegetales y animales, material contaminado con sangre u otros); en el tacho con bolsa NEGRA
se arrojan los desperdicios comunes no contaminados (papeles, plásticos, etc.).
7. Está estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio.
8. Sobre la mesa de trabajo del laboratorio debe de tener solamente el material solicitado y libreta de apuntes.
Coloque las carteras, mochilas, libros y otros en los casilleros o en los lugares destinados para ellos.
9. Durante el desarrollo de la práctica observe y grafique con detalle los diversos experimentos, protocolos o vistas
microscópicas; intercambie conceptos, ideas y puntos de vista con sus compañeros y profesor.
10. Al término de la práctica el estudiante debe limpiar su mesa de trabajo, lavar el material de vidrio utilizado,
lavarse cuidadosamente las manos, despojarse del guardapolvo y retirarse ordenadamente.
II. NORMAS DE UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS
1. Antes de utilizar un compuesto químico, asegurarse de que es el que se necesita.

2. No devolver a los frascos de origen los sobrantes de los productos químicos o medios de cultivo. Si existiese
sobrante, desecharlo.
3. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos, utilizar peras de succión o propipetas.
4. Los ácidos requieren un cuidado especial, cuando haya que diluirlos, nunca echar agua sobre ellos; por el
contrario, se debe agregar el ácido sobre agua.
5. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) no deben estar cerca de fuentes de calor. Si hay que
calentar tubos con estos productos, se hará al baño maría, nunca directamente a la llama.
6. Si se vierte sobre la piel cualquier ácido o producto corrosivo, lavarse inmediatamente con abundante agua y
avisar al encargado del laboratorio.
7. Si se preparan soluciones químicas, éstas deben colocarse en un frasco limpio y seco y rotulado
convenientemente.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
5
III. NORMAS DE UTILIZACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO
1. Tener cuidado con los bordes y puntas cortantes de los tubos u objetos de vidrio.
2. El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frio. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar antes de
tocarlo.
3. Las pipetas usadas deben colocarse en recipientes que contienen una solución desinfectante (mezcla
sulfocrómica o bicloruro de mercurio). De la misma manera se procede para tubos de ensayo, láminas
cubreobjetos y laminillas.
4. Si se tiene que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo, debe considerarse lo siguiente:
a) La boca del tubo de ensayo no debe apuntar a ningún compañero de trabajo ni a sí mismo. Puede hervir el
líquido y salir disparado, ocasionando un accidente.
b) El tubo de ensayo debe calentarse por la parte lateral, nunca por el fondo, agitando suavemente.
Todos los que trabajan en el laboratorio, deben saber dónde está el botiquín, las botellas de irrigación de los ojos, y
los extintores de incendio.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
6
PRACTICA N° 1
BIOSEGURIDAD Y MANEJO DE EQUIPOS E
INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN
BIOQUÍMICA
I. COMPETENCIAS:
1.1. Conoce las normativas para proteger la salud de las personas que puedan estar expuestas a riesgos
relacionados con la exposición a agentes biológicos, químicos, físicos, ergonómicos y psicosociales, en el
laboratorio.
1.2. Comprende el manejo y eliminación de residuos generados en el laboratorio.
1.3. Reconoce símbolos internacionales para su desempeño correcto dentro y fuera de las instalaciones del
laboratorio.
1.4. Reconoce los diferentes equipos e instrumentos utilizados en el desarrollo de la parte práctica del curso de
Bioquímica.
II. INTRODUCCIÓN:
En el campo de la salud existen diversos lugares donde el profesional se desempeña, como hospitales, clínicas,
postas, centros asistenciales, etc. Sin embargo el laboratorio también constituye un lugar de trabajo, tanto en el
campo clínico, educativo, de investigación e incluso de enseñanza, siendo por ello necesario que se conozcan
las pautas mínimas necesarias para el normal desempeño dentro de él.
Se define como bioseguridad al conjunto de combinaciones específicas (normas) de trabajo, equipo de

seguridad y facilidades diseñadas para minimizar la exposición de los trabajadores y el ambiente a los agentes
infecciosos; es así que las normas de bioseguridad están destinadas a reducir el riesgo de transmisión de
microorganismos de fuentes reconocidas o no reconocidas de infección en Servicios de Salud vinculadas a
accidentes por exposición a sangre y fluidos corporales, así como también agentes físicos y químicos.
Los objetivos de estas normas son:

1. Proteger la salud del personal que pueda estar expuesto a riesgos relacionados con la exposición a agentes
biológicos, químicos y físicos.
2. Establecer la conducta a seguir frente a un accidente con exposición a dichos elementos.
3. Participar de las normas de Bioseguridad a todo el personal que directa o indirectamente toma contacto con el
laboratorio.
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
TIPOS DE ÁREAS DE TRABAJO:
1. Área contaminada.- Área donde se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo: Laboratorios

donde se manipulan virus, producción de antígenos etc.
2. Área de tránsito limitado.- Área donde el tránsito está permitido sólo a personas previamente
autorizadas, debido a la presencia de agentes microbianos que tienen poca capcidad de causar enfermedad
al ser humano (Grupo I y II). El acceso del personal administrativo está terminantemente prohibido.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
7
3. Área de tránsito restringido.- Área en las que el tránsito está permitido sólo al personal
adecuadamente protegido y autorizado, debido a la presencia de agentes del grupos III (Puede causar una
enfermedad grave en el hombre y presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que
se propague a la colectividad y existiendo frente a él generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. Implican
patología grave, de difícil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas y ocasionalmente producir
la muerte).
4. Área limpia.- Área del laboratorio donde no se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo: donde
se mantienen los medios de cultivos celulares, se preparan los medios de cultivo y a la vez se
realiza la formulación de la vacuna.
5. Área libre.- Área de tránsito libre para todo el personal. Ejemplo: pasadizos comunes, comedor y
otras áreas de uso común.
MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGO
Grupo de riesgo Microorganismo infectante

RIESGO
1
- Acanthamoeba
Agrupa microorganismos que tienen
- Plasmodium
escaso o nulo riesgo de provocar
- Protozoarios
enfermedades
- Helmintos intestinales
RIESGO
2
- Acinetobacter - Treponema pallidum
Agrupa a microorganismos que - Aeromonas - Vibrio
pueden provocar enfermedades - Bordetella - Neisseria
humanas de riesgo moderado. - Bartonella - Salmonella typhi
Si provoca una infección al personal bacilliformis - Shigella
de laboratorio, ésta tiene tratamiento - Clostridium - Yersinia
y cura - Corynebacterium - Pseudomonas
- Entamoeba - Sataphylococcus
hystolitica - Haemophylus
- Escherichia - Leptospira
coli
entoropatóg
ena
- Leishmania
RIESGO
3
Agrupa microorganismos que pueden - Brucella - Paracoccidiodis

provocar enfermedades humanas - Histoplasma brasilensis
graves. Tienen tratamiento, cura y se capsulatum - Taenia solium
limita. - Mycobacteri - Trypanosoma cruzi
um - Yersinia pestis
tuberculosis
- Mycobacterium bovis
RIESGO
4
Agrupa microorganismos que - Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

provocan enfermedades graves en el - Virus de fiebre hemorrágica Ébola.
ser humano. No hay tratamiento para
su cura.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
8
SEÑALES DE SEGURIDAD (PICTOGRAMAS)
1. DE PROHIBICIÓN: Redondas, con pictograma de color negro sobre fondo blanco, con bordes y banda
transversal de izquierda a derecha. Ejemplos:
2. DE ADVERTENCIA: Triangulares, con pictogramas de color negro y fondo amarillo o naranja.
3. DE SEGURIDAD: Rectangulares o cuadrangulares, con pictogramas de color blanco y fondo verde.
4. DE OBLIGATORIEDAD: Circulares y con pictogramas de color blanco con fondo azul.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
9
GESTIÓN EN MANEJO DE RESIDUOS
1. Generalidades: La gestión de residuos debe ser considerada como una parte importante de la
seguridad en los laboratorios. Los desechos que se generan pueden estar contaminados por
microorganismos o contener sustancias químicas tóxicas y peligrosas. En menor medida, el personal del
laboratorio puede estar expuesto a los efectos de las radiaciones ionizantes.
Los casos de infecciones o intoxicaciones en el laboratorio son conocidos lo que obliga a la adopción de
medidas de protección para el personal que trabaja en este ámbito. La visión que se pretende dar está
sobre todo encaminada a la protección del personal de los laboratorios, no olvidar que las actividades
que en ellos se realizan pueden afectar a la salud comunitaria.
La mejor manera de racionalizar los residuos es mediante una gestión integrada cuyos pilares básicos
son la minimización, segregación y eliminación.
2. Clasificación de los Residuos según su
Peligrosidad: Clase A: Residuos
Biocontaminados (Peligrosos)
Tipo A 1: Atención al paciente. Instrumentos y materiales utilizados en la toma de muestra de
sangre, tejidos y otros.
Tipo A 2: Material biológico.
Tipo A 3: Sangre humana y productos derivados.
Tipo A 4: Quirúrgicos y anatomopatológicos.
Tipo A 5: Animales contaminados.
Clase B: Residuos
Especiales Tipo B 1:
Químicos peligrosos. Tipo
B 2: Farmacéuticos.
Tipo B 3: Radioactivos.
Clase C: Residuos Comunes: Similares a los domésticos. Incluye a los generados en

administración como: cartón, papel, material de oficina, basura orgánica, etc.
3. Manejo de Residuos Sólidos:

Las bolsas de recolección de residuos sólidos se deben de diferenciar por colores:
Residuos Biocontaminados: Color roja.
Residuos Especiales: Color amarilla.
Residuos comunes: Color negra.
Si los residuos son punzantes o cortantes debe utilizarse recipientes rígidos resistentes a la
perforación cuyo volumen no supere los 2 L y que contengan desinfectante (hipoclorito de sodio al
10%), el cual debe ocupar los 2/3 del volumen del recipiente.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
10
MANEJO DE EQUIPOS E INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN BIOQUÍMICA
ESPECTROFOTÓMETRO
El Espectrofotómetro es un instrumento para medir la trasmitancia o absorbancia de una muestra, en función

de la longitud de onda de la radiación electromagnética. Un espectrofotómetro consta de los siguientes
componentes clave:
1. Una fuente que genera una banda ancha de radiación electromagnética. Puede ser una lámpara halógena o
de volframio que suministra la luz de la zona visible del espectro (400 – 700nm), o de neón, argón o de
hidrógeno, para la zona ultravioleta (200 – 400 nm)
2. Un dispositivo de dispersión que selecciona una longitud de onda particular de la radiación de la fuente.
Comúnmente, se utilizan prismas y redes halográficas de difracción, que junto a una rendija de entrada y
otra de salida configuran el monocromador
3. Un área de muestra: Célula transparente a la radiación incidente monocromática que contiene el material
bajo estudio disuelto en un solvente adecuado. Suele ser de 1 cm. De espesor.
4. Uno o más detectores para medir la intensidad de la radiación: Normalmente, es un tubo
fotomultiplicador o un tubo fotodiodo.
Fig 1. Espectrofotómetro UNICO S2100UV
Análisis colorimétricos: El objetivo del análisis cualitativo es identificar una substancia o encontrar
los elementos que la componen. El análisis cuantitativo es usado para determinar la cantidad
(concentración) de un componente específico de la muestra. El análisis colorimétrico es una técnica de
determinación cuantitativa, que compara la densidad de color de la muestra con el de un patrón.
La muestra coloreada tiene características especiales de absorción y de esta forma su color complementario es
adsorbido en la región visible. La cantidad o concentración de una substancia puede ser determinada por la
medición del quantum del color complementario absorbido. Esto es el principio de los análisis colorimétricos. Si
la muestra fuera incolora y transparente, se adicionan reactivos que a través de reacciones químicas
produzcan el color.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
11
MEDICIÓN DE VOLÚMENES
PIPETAS Y MICROPIPETAS
Las mediciones y transferencias de volúmenes exactos y precisos son requisitos básicos de la bioquímica .
Estos procedimientos son hechos utilizando instrumentos como las pipetas manuales, las micropipetas, las
buretas, las probetas o los balones de aforar. Cada uno de ellos cumple una función en particular dentro del
laboratorio pero en algunos casos estas funciones pueden sobreponerse. El grado de precisión de los mismos
puede variar considerablemente así que la utilidad del instrumento a utilizar para realizar una medición en
particular es un paso crítico para obtener el resultado esperado.
MICROPIPETAS AUTOMÁTICAS
Las micropipetas son instrumentos que se utilizan para la dispersión de líquidos en el Laboratorio de
Bioquímica. Los volúmenes de las soluciones que se necesitan medir son en el orden de microlitros (µL),
requiriéndose exactitud, precisión y reproductibilidad de los mismos. Los errores en la medición que se pueden
cometer dependen en gran medida del usuario y no de las micropipetas en sí. El funcionamiento se basa en el
principio de desplazamiento del aire y en la utilización de puntas desechables. Las pipetas cubren un amplio
rango de volumen que va de 0,5 microlitros hasta 5 ml. Para que las medidas sean correctas deben tenerse en
cuenta las siguientes consideraciones generales:
1. La micropipeta debe mantenerse siempre en posición vertical durante todo el proceso de pipeteo, nunca
inclinada. También, cuando la pipeta no se utilice se debe dejar siempre en posición vertical en el soporte de
pipetas. Nunca la deje horizontalmente encima de la mesa y menos una vez que tenga líquido succionado.
2. Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo miden solamente un único
volumen. En las de volumen variable, se puede seleccionar un volumen dentro de un rango de valores
determinado. En éstas, solo se deben ajustar volúmenes a los que se recomiendan para cada micropipeta.
3. Las micropipetas existen de rango único y rango variable, en el caso de estas últimas algunas traen un freno
que impide cambiar de volumen, tener cuidado al momento de manipular estas micropipetas para evitar su
deterioro. Al cambiar de volumen hacerlo lentamente para evitar malograr el instrumento.
4. Los modelos que toman volúmenes inferiores a 200 µL usan puntas o tips amarillos, y las micropipetas que
toman volúmenes superiores a 200 µL hasta 1000 µL usan puntas azules. La micropipetas que miden
volúmenes menore s 20 µL utilizan puntas blancas o transparentes.
5. La micropipeta debe cogerse como un puñal. La empuñadura debe de reposar sobre el dedo índice.
Todas las micropipetas tienen dos topes. Para el pipeteo de rutina se utiliza el modo directo, consistente en:1)
Presión hasta el primer tope para tomar el volumen calibrado. 2) Presión hasta el segundo tope para expulsar
el volumen tomado.
6. Existen otros modos de pipeteo que se utilizan para Soluciones muy viscosas o cuando se tenga que
pipetear repetidamente una solución. Tanto la presión como la liberación del émbolo de la pipeta se debe
realizar lentamente y con suavidad. Si se realiza bruscamente, se pueden formar burbujas dentro de la punta
de la pipeta, que alterarían las medidas. También se pueden formar burbujas si la punta no está ajustada a la
pipeta. La solución es ajustarla mejor.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
12
Fig. 2 Micropipeta mostrando sus partes
CENTRÍFUGA
Equipo de laboratorio que sirve para separar sustancias de diferentes densidades utilizando la fuerza
centrífuga. La centrifugación es una técnica de sedimentación acelerada, empleada en el análisis o separación
de mezclas de partículas, células, arganelas, o moléculas. Se puede regular velocidad, tiempo, temperatura,
existiendo rotores angular y baculante.
CLASES DE CENTRIFUGACIÓN
Según la velocidad:
a. A baja velocidad (menos de 10,000 rpm).
b. A alta velocidad (entre 10,000 a 20,000 rpm).
c. Ultracentrifugación (más de 20,000 rpm).
Fig. 3 Centrífuga digital
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
13
Según el propósito:
a .Centrifugación analítica: Mide propiedades físicas de partículas que sedimentan (coeficiente de

sedimentación o masa molecular).
b. Centrifugación preparativa: Aisla partículas, células o moléculas.
Según el medio en el que se centrifuga y la forma como se aplica:
a. Centrifugación diferencial (frontera móvil): el comportamiento de cada componente de la muestra depende de

su forma tamaño y densidad. Se obtiene dos fracciones sedimento y sobrenadante.
b. Centrifugación zonal o de velocidad de sedimentación: la muestra se aplica en una capa delgada sobre el
medio de centrifugación, que es un gradiente de densidad.
c. Centrifugación isopícnica o de equilibrio de sedimentación: Se utiliza una gradiente de densidad, pero el

tiempo de sedimentación es lo suficientemente largo (hasta 1 o 2 días) como para que se alcance el equilibrio
de sedimentación (entre la fuerza centrífuga, el empuje hidrostático de la célula y su difusión)
d. Métodos de barrera: método rápido, típico por ejemplo en la obtención de linfocitos de sangre circulante
libres del resto de células sanguíneas.
e. Centrifugación en un medio de densidad constante. Se emplea para ellos medios comerciales como Ficol-
Paque, lymphoprep, entre otros.
BAÑO MARÍA
El baño de María (Fig 4ª y 4b) es un equipo que se utiliza en el laboratorio para realizar pruebas serológicas y
procedimientos de incubación, aglutinación, inactivación, biomédicos, farmacéuticos y hasta industriales. Por lo
general, se utilizan con agua, pero también permiten trabajar con aceite. Los rangos de temperatura en los
cuales normalmente son utilizados están entre la temperatura ambiente y los 60 °C. También se pueden
seleccionar temperaturas de 100 °C, utilizando una tapa de características especiales. Los baños de María son
fabricados con cámaras cuya capacidad puede seleccionarse entre los 2 y los 30 litros.
Fig. 4a Baño Maria
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
14
Fig.4b. Partes del Baño Maria
14
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
15
PRACTICA N° 2
ESPECTROFOTOMETRÍA
I. COMPETENCIAS.
1. Explica las bases teóricas del uso y funcionamiento de un espectrofotómetro.

2. Manipula y opera correctamente el espectrofotómetro UNICO S2100 – UV.
3. Comprende el concepto de Espectrofotometría.
4. Aplica la técnica de la fotometría en la medición de la concentración desconocida
de un colorante a través de una curva de calibración previamente construida.
II. INTRODUCCIÓN.
El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas analíticas que
permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su caracterización físico-química y biológica. Uno
de los métodos más sencillos, accesibles, útiles y utilizados es la espectrofotometría, en general, y la
espectrofotometría ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y cuantificar biomoléculas en
solución y en muestras biológicas, con el empleo de reactivos específicos que reaccionan con el compuesto a
analizar y forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.
El fundamento de la espectrofotometría se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones,

entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una
molécula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura atómica y de las
condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica
constituye un valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas.
FUNDAMENTACIÓN
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía interna. Esto permite
poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada
como energía) es absorbida por una molécula se origina un salto desde un estado energético basal o
fundamental, E1, a un estado de mayor energía (estado excitado), E2. Y sólo se absorberá la energía que
permita el salto al estado excitado.
Cada molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de moléculas. Como
consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda presenta una molécula - esto es, su espectro de
absorción - constituye una señal de identidad de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la
energía absorbida hasta el estado energético fundamental. En espectrofotometría el término luz no sólo se
aplica a la forma visible de radiación electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles.
En espectrofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el
visible (400-780 nm).
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
16
La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una región de energía muy
alta. Provoca daño al ojo humano así como quemadura común. Los compuestos con dobles enlaces aislados,
triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas aromáticos, grupos carbonilos y otros heteroátomos tienen su
máxima absorbancia en la región UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación cualitativa y
cuantitativa de compuestos orgánicos. Diversos factores - como pH, concentración de sal y el disolvente - que
alteran la carga de las moléculas, provocan desplazamientos de los espectros UV.
La fuente de radiación ultravioleta es una lámpara de deuterio. En la región visible apreciamos el color visible
de una solución y que corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El color
que absorbe es el complementario del color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorción
es necesario utilizar la longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada. La fuente de radiación
visible suele ser una lámpara de tungsteno y no proporciona suficiente energía por debajo de 320 nm.
Longitud de Onda -  Color Color

(nm) Complementario
380-435 Violeta Verde-amarillo
435-480 Azul Amarillo
480-490 Azul-verdoso Anaranjado
490-500 Verde-azulado Rojo
500-560 Verde Púrpura
560-580 Verde-amarillo Violeta
580-595 Amarillo Azul
595-650 Anaranjado Azul-verdoso
650-780 Rojo Verde-azulado
Transmitancia y Absorbancia: Cuando un rayo de luz de una

determinada lo onda de intensidad Io incide perpendicularmente sobre una
disolución de un c químico que absorbe luz o cromóforo, el compuesto
absorberá una parte de la incidente (Ia) y dejará pasar el resto (It), de forma
que se cumple: Io = Ia + It
longitud de
Compuesto radiación
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS
La Transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad deCA
luz transmitida
que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It y la cantidad de luz que incidió sobre ella, Io,
y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x 100. La transmitancia nos da una medida física
de la relación de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la
concentración no es lineal, pero asume una relación logarítmica inversa.
La absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad
de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en consecuencia:
A = log 1/T = -log T = -log It/Io
Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la
muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0. La cantidad de luz
absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz a través de la solución del cromóforo y de la
concentración de éste.
Ley de Lambert-Beer
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda fija) y
concentración de un cromóforo en solución:
A = log I/Io = ε·c·l
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración – a mayor número de

moléculas mayor interacción de la luz con ellas -; también depende de la distancia que recorre la luz por la
solución – a igual concentración, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se
encontrará -; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad -denominada coeficiente de
extinción- que es específica de cada cromóforo. Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de
las de c y l. La segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre
que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de ε resultan ser M-1·cm-1. Este coeficiente así
expresado, en términos de unidades de concentración molar (o un submúltiplo apropiado), se denomina
coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por desconocerse el peso molecular del soluto, la concentración
de la disolución se expresa en otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las dimensiones de ε resultan
ser distintas, por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente de extinción
específico (εs).
La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía con la
concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas, cambios del medio, etc.
Espectrofotómetro UV-visible: La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos
aparatos llamados espectrofotómetros. Todos constan, según se indica en la figura, de:
Fig. 6 SISTEMA INTERNO DEL EXPECTROFOTÓMETRO

G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
PARTES DEL ESPECTROFOTÓMETRO 18
1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.

2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda: filtros, prismas, redes de
difracción.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas) que contenga la muestra. Pueden ser de
vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio
no transmite la radiación UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales eléctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.
Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud de onda a la que se va a
realizar la medida. Hay espectrofotómetros de un solo haz (con una sola celdilla para alojar la cubeta con la muestra)
y de doble haz (con dos celdillas para dos cubetas); en nuestro caso se trabajará con los de un solo haz, pero con
cámara para cuatro cubetas. Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que se le
asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente y transmitida sean iguales
(Io= It), y por tanto la absorbancia es cero. A continuación se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la
absorbancia de ésta.
El espectrofotómetro es un equipo utilizado para la medición de color; sin embargo, no mide directamente el color,
mide la luz reflejada o transmitida por un material. Esta información, después de una integración de estímulos, se
transforma en expresiones numéricas del color. Un espectrofotómetro moderno consiste en una fuente de energía
radiada, un sistema de dispersión para proporcionar radiaciones monocromáticas, y un sistema detector para medir la
cantidad de radiación que atraviesa el instrumento.
III. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1 Materiales y
equipos
Materiales:
10Tubos de ensayo
13x100 Azul de Metileno
0.1 mg/mL Safranina 0.1
mg/mL
Agua destilada 500 ml
Equipos e instrumentos:
01 Espectrofotómetro Único 2100 UV-VISIBLE
Micropipetas automáticas de 2-20, 100-1000 µL.
Otros:
10 cubetas para espectrofotómetro.
03 gradilla
03 Marcadores indelebles
Tips para micropipeta de rango variable
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS 19 CA
Procedimiento.
3.2 Determinación de los espectros de absorción:

1. Llenar hasta lo permitido una cubeta para espectrofotómetro con colorante azul de metileno
(realizar lo mismo con la solución de safranina).
2. Llevar a cero de absorbancia el equipo, con agua destilada.
3. Leer la absorbancia del colorante preparado para cada una de las longitudes de onda en el
espectrofotómetro, según lo señalado en la tabla 1 y anotar los resultados.
4. Reconocer cual es la longitud de onda, que corresponde a la máxima Absorbancia.
Construir una gráfica, colocando las absorbancias en las ordenadas y las longitudes de onda en las
abscisas.
3.2.1 Preparación de una curva de calibración:

1. Preparar 5 diluciones del colorante proporcionado (1:2, 1:4, 1:8, 1:16 y 1:32), utilizando agua
destilada como diluyente.
2. Leer cada dilución a la longitud de onda seleccionada en la experiencia anterior.
3. Construir un gráfico en un papel milimetrado colocando la Absorbancia en el eje de las ordenadas
y las concentraciones en el eje de las abcisas. Tener en consideración que la concentración menos
diluida es 1:32 (0.03125 de colorante y 1.9687 de agua).
4. Preparar una solución de colorante (0,1 mg/ml) utilizada, leer la absorbancia y utilizando la curva
de calibración determine su concentración.
I. RESULTADOS.
Tabla 1: Absorbancias para azul de metileno (0.1 mg/mL), según longitudes de onda.
Longitud de Absorbancia Azul de
onda  metileno
410
460
510
560
610
660
Tabla 2: Absorbancias para diluciones de azul de metileno (0.1 mg/mL), a una longitud de onda de:
Longitud de Absorbancia Azul de metileno

onda 
1:2
1:4
1:8
1:1
6
1:3
2
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS 20 CA
PRACTICA N° 3
OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE
SANGRE Y MANEJO DEL
SUERO Y PLASMA
I. COMPETENCIAS.
1. Reconoce áreas específicas para la obtención de muestras de sangre.

2. Obtiene una muestra de sangre capilar mediante el método de punción cutánea.
3. Obtiene una muestra de sangre venosa en tubo de ensayo con y sin anticoagulante
4. Comprende la importancia de la obtención correcta de muestras de sangre para un análisis bioquímico.
II. INTRODUCCION:
El objetivo del laboratorio clínico es la obtención de información sobre el estado de salud de una persona.
Esta información puede utilizarse para establecer un diagnóstico, evaluar la evolución y/o pronóstico de una
enfermedad, valorar la efectividad de un tratamiento, realizar un cribado en una población, etc. Para ello, a
partir de muestras biológicas, se realizan pruebas en las que se miden una serie de magnitudes de índole
diferente: bioquímicas, hematológicas, inmunológicas, microbiológicas, parasitológicas, toxicológicas, etc.
La toma de muestras es el acto en el que se obtiene, una parte de tejido, líquido, secreción o excremento de
una persona, para su estudio en un laboratorio, cuando dicha obtención se efectúa con un método invasivo
se denomina extracción. Las muestras que se requieren para los estudios hematológicos son: sangre (venosa
y capilar), médula ósea y L.C.R.
Se puede considerar que la sangre es un tejido conectivo fluido, porque está compuesto por células y una
“sustancia intercelular” líquida: el plasma sanguíneo. La cantidad total de sangre en un individuo adulto es de
aproximadamente 5-6 litros, representando así el 7-8% del peso corporal. El plasma corresponde al 54% del
volumen sanguíneo, mientras que la porción celular, representa el 46% restante. La sangre es el líquido más
frecuentemente utilizado con finalidades analíticas. Los tres procedimientos generales para la obtención de
sangre de un individuo son: punción arterial, punción venosa, punción cutánea.
En los tres casos, si inmediatamente de extraída la sangre se mezcla en un tubo con un anticoagulante, se
tiene lo que se llama sangre entera, y se mantiene en ese estado por un tiempo prolongado. Si luego el tubo se
centrifuga a baja velocidad, se obtienen dos fracciones claramente definidas:
a. Un precipitado de células, compuesto por eritrocitos comprimidos (aproximadamente 45% del volumen
total) por encima de los cuales existe un volumen de glóbulos blancos y plaquetas (aprox. 1%)
b. un sobrenadante fluido que corresponde al plasma y representa el 54% restante.
Si no se agregan anticoagulantes a la sangre, y se deja reposar el tubo durante unos minutos, se produce la
coagulación de esa muestra, obteniéndose también dos fracciones:
a. el coágulo, constituido principalmente por las células y
b. el líquido excluido del coágulo denominado suero.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
21
En resumen, el suero se diferencia del plasma porque carece de fibrinógeno (que ha sido convertido
en la fibrina del coágulo), protrombina y otros factores de la coagulación consumidos durante dicho proceso,
y por contener además, en baja concentración, sustancias de importancia fisiológica liberadas por las
plaquetas durante la coagulación, por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas
(PDGF).
La técnica de elección para la obtención de muestras de sangre dependerá de los parámetros que se deseen
analizar. La punción venosa es técnicamente más fácil y es la usualmente utilizada para la mayoría de las
determinaciones de rutina, pero proporciona valores incorrectos de saturación de O2 y pCO2, parámetros que
deben medirse a partir de una punción arterial. Estas determinaciones de los gases en sangre son críticas
para valorar los problemas de oxigenación que se encuentran en enfermedades tales como el asma,
neumonías, embolia pulmonar.
La sangre obtenida por punción de la piel (a veces denominada incorrectamente sangre capilar) es una
mezcla de sangre procedente de arteriolas, vénulas y capilares, y contiene también líquido intersticial e
intracelular. Por lo tanto, está compuesta por una fracción arterial y una fracción venosa. La mayor presión en
las arteriolas hace que la muestra sea más rica en sangre arterial.
1.1 Extracción de sangre venosa

La sangre venosa es la muestra hematológica por excelencia, por la riqueza de datos que aporta y su relativa
facilidad para obtenerla.
Normas básicas para la extracción de sangre venosa
a. Identificar SIEMPRE al paciente antes de realizar la extracción. En el caso de extraer muestras para
una transfusión sanguínea esta identificación se hará de forma inequívoca.
b. Colocar el compresor (o torniquete) entre 7 y 10 cm por encima del lugar elegido para la venopunción,
soltarlo inmediatamente después de canalizar la vena. NUNCA DEBE ESTAR COLOCADO
MÁS DE DOS MINUTOS pues altera el equilibrio entre el líquido y los elementos formes de la sangre
(aumento 10% el valor del hematocrito, del 15% de la coagulación, etc.)
c. Realizar una punción lo más “atraumática” posible, sobre todo si incluye estudio de coagulación, cuanto
más limpia sea la punción menos factores titulares se liberarán.
d. Evitar las causas de hemólisis de la muestra: El uso de jeringa y aguja para la extracción multiplica el
riesgo de hemolizar las muestras: tirar con excesiva fuerza del émbolo de la jeringa, usar llave de tres vías,
forzar el paso de sangre por la aguja o llenar el tubo sin dejar deslizar la sangre por la pared interna del
mismo
e. Si se usa jeringa y aguja para realizar la extracción, hay que recordar: No destapar NUNCA los tubos, al
volver a cerrarlos puede producirse un exceso de presión dentro y hacer que salte el tapón durante el
transporte.
f. Respetar el volumen de llenado de cada tubo, y en especial el de coagulación.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
22
g. Llenar los tubos dejando resbalar la sangre por la cara interna de los mismos, no dejarla caer directamente
al fondo, ni forzar el paso de la sangre por la aguja.
1.2 Extracción de sangre en situaciones especiales
a. Evítese la extracción de sangre del brazo donde el paciente tenga colocada una vía de perfusión, la
muestra obtenida estará diluida. Si no hubiera otra opción (vías en ambos brazos por ejemplo), y siempre que
sea posible, cierre la perfusión y espere al menos dos minutos para realizar la extracción.
b. La extracción de sangre de un catéter debe asegurar que ni la solución perfundida ni el uso de heparina
van a interferir en el resultado del análisis. Siempre debe desecharse un volumen de al menos dos o tres
veces el de la luz del catéter, si la extracción es para un estudio de coagulación no debe usarse este método
si no es en el momento de la implantación de la vía. Se recomienda utilizar un adaptador de vacío para el
llenado de los tubos.
c. La obtención de sangre arterial para realizar estudios hematológicos no está aconsejada. En cualquier caso
tenga en cuenta que las jeringas de extracción arterial están heparinizadas, por lo que no pueden usarse
para la extracción de un estudio de coagulación.
d. No obstante, en la práctica diaria se dan situaciones en las que no es posible usar otra opción que las
descritas en los puntos anteriores, en estos casos debe informarse al Laboratorio de las características de la
extracción y de la imposibilidad de realizarla de otra forma.
1.3 Sangre capilar
La mal denominada sangre capilar es la obtenida mediante punción cutánea. En realidad es una mezcla de
sangre procedente de arteriolas, vénulas y capilares con líquidos intersticiales e intracelulares; su
composición depende fundamentalmente de la cantidad de flujo sanguíneo en la zona de punción y de la
profundidad de penetración de la lanceta. En el laboratorio de bioquímica este tipo de muestra se usa para
tres determinaciones, el tiempo de sangría, determinación de hematocrito y la determinación del grupo
sanguíneo.
En adultos la zona de punción ideal es el lateral de los dedos de la mano, en recien nacidos se usa también
la superficie plantar externa o interna del talón (sin superar los 2,4 mm de profundidad).
Aspectos que deben considerarse en una punción cutánea:

a. Una vez desinfectada la zona de punción debe dejarse secar el antiséptico usado para que no interfiera en
el análisis posterior de la muestra y para que haya un mejor flujo de las gotas.
b. Desechar la primera gota que fluye; está contaminada de factores y líquidos tisulares.
c. Si las gotas no fluyen libremente aplicar una ligera presión sobre la zona, no se debe exprimir ni forzar el
flujo, esto puede hemolizar la muestra o incrementar la proporción de fluidos intersticiales en ella.
d. El precalentamiento de la zona de punción puede favorecer su vascularización.
e. Utilizar siempre lancetas para realizar esta técnica. El uso de agujas hipodérmicas está totalmente
desaconsejado. (Una de las primeras causas de pinchazos accidentales).
Rotulación de muestras
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
23
Las muestras se rotulan con las iniciales del paciente, la hora y fecha de la toma de muestra y los exámenes
a realizar.
III. MATERIAL Y
MÉTODOS:
Material
Algodón hidrofílico.
Alcohol al 70% o alcohol yodado.
Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo.
Jeringas de 5 mL.
Agujas descartables Nº 21 de 1 1/2"
Viales o tubos con anticoagulante EDTA (heparina – citrato).
Viales o tubos sin anticoagulante.
Procedimiento para la obtención de muestras de

sangre Punción venosa
Se deben seguir los siguientes pasos:
a. Verificar que los elementos por utilizar estén listos, y que el paciente se sienta cómodo.
b. Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la flexión del codo o de 7 a 10 cm del
codo, sujetar con un medio nudo (Fig. 7.1).
c. Limpiar la zona con alcohol al 70% o alcohol yodado, en un área de 2 pulgadas (Fig.7.2).
d. El paciente deberá abrir y cerrar la mano durante unos segundos y después la mantendrá cerrada, esto
ayudará a visualizar las venas superficiales (Fig.7.3).
e. Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de tal manera que el bisel se encuentre hacia
arriba (Fig. 7.4).
f. Se coloca la aguja en dirección paralela a la vena (haciendo un ángulo de 45º), se perfora la piel haciendo
avanzar la aguja 0,5-1 cm en el tejido subcutáneo, luego se perfora la vena (Fig. 7.5).
g. Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido.
h. Se retiraa el torniquete y se indica al paciente que deje de hacer puño. Colocar el algodón seco encima de
la punción y se retirar la aguja (Fig.7.6).
i. Retirar la aguja de la jeringa. Verter la muestra lentamente por las paredes del vial con anticoagulante. No
olvidar colocar una gota en la lámina portaobjeto para realizar el frotis. Agitar el vial en círculos sobre la mesa
para homogeneizar la muestra con el anticoagulante.
Fig 7a. Venas para la punción

G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
24
Fig. 7b Venas distales de extremidades superiores
Fig. 7c. Venopunción
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
25
Fig. 7d. Patrones de trayecto de las venas superficial en la fosa cubital derecha. Los
patrones se clasificaron en cuatro tipos: vena cefálica (CV), vena basílica (BV), vena cubital
medial (MCV), vena antebraquial mediana (MABV)
Fig. 7 Procedimiento para la extracción
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
26
Punción cutánea
Cuando la cantidad de sangre que se precisa es muy pequeña o cuando por diferentes motivos no pueda
practicarse una punción venosa, debe recurrirse a la punción capilar.
Materiales requeridos:
Algodón.
Alcohol al 70%.
Lancetas desechables.
Papel de filtro No 2
Procedimiento:
a. La sangre capilar se obtiene de la cara lateral del dedo medio o anular en los adultos y del dedo gordo del
pie o talón en los niños.
b. Desinfectar la zona con alcohol al 70%, secar con algodón estéril.
c.Punzar la piel con una lanceta estéril desechable (2 mm de profundidad).
d.Usar gasa estéril para desechar la primera gota y recoger las siguientes en tubos capilares. Evitar
comprimir la extremidad para obtener sangre porque se altera la composición sanguínea.
Fig. 8 Áreas para la toma de muestra

G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
27
PRACTICA N° 4
METABOLISMO DE
CARBOHIDRATOS:
DETERMINACIÓN DE GLICEMIA
I. COMPETENCIAS
1. Comprende y explica la importancia de la glucosa en el metabolismo humano y su relación con diversas

patologías.
2. Determina la concentración de glucosa en estado basal en una muestra biológica mediante el método
enzimático colorimétrico.
3. Explica la importancia de este procedimiento y su aplicación en la práctica clínica
II. INTRODUCCIÓN
Los carbohidratos se definen como aldehídos y cetonas polihidroxílicos (aldosas y cetosas, respectivamente). Los
carbohidratos simples como la glucosa se denominan monosacáridos. Dos monosacáridos ligados por un puente
llamado glucosídico forman un disacárido. Más de dos monosacáridos unidos por puentes glucosídicos se
denomina polisacárido. Los carbohidratos de la dieta consisten de monosacáridos tales como la glucosa, fructosa
y galactosa; de disacáridos tales como la sacarosa, lactosa y maltosa y de polisacáridos tales como el almidón.
Las enzimas intestinales convierten a los disacáridos y polisacáridos en monosacáridos.
La principal función bioquímica de la glucosa es la de proporcionar energía para los procesos de la vida. El
adenosín trifosfato ("ATP") es la fuente de energía universal para las reacciones biológicas. La oxidación de la
glucosa por las vías glucolítica y del ácido cítrico es la fuente principal de energía para la biosíntesis del ATP. El
sistema para regular los niveles de glucosa sanguínea funciona para lograr dos fines. El primero es para
almacenar glucosa en exceso en relación a las necesidades corporales inmediatas en un reservorio compacto
(glucógeno) y el segundo es para movilizar la glucosa almacenada de manera que mantenga el nivel de glucosa
sanguínea.
La regulación de la glucosa sanguínea es esencial para mantener al cerebro, cuya fuente energética primaria es la
glucosa, abastecido por una cantidad constante de la misma. La función de la insulina es desviar la glucosa
extracelular a los sitios de almacenamiento intracelular en la forma de macromoléculas (como el glucógeno, lípidos
y proteínas). Es así que la glucosa es almacenada en tiempos de abundancia para los momentos de necesidad.
En respuesta a la baja glucosa en sangre, como en períodos de ayuno, una serie de agentes hiperglucemiantes
actúa en las vías metabólicas intermediarias para formar glucosa a partir de las macromoléculas almacenadas. De
esta forma las proteínas y el glucógeno son metabolizados para formar glucosa-6-fosfato (gluconeogénesis), la
cual es hidrolizada a glucosa en el hígado y liberada a la sangre para mantener los niveles de glucosa sanguínea.
Los agentes hiperglucemiantes más importantes son el glucagón, la epinefrina, el cortisol, la tiroxina, la hormona
de crecimiento y ciertas hormonas intestinales. El comportamiento de cada uno de estos agentes es diferente en
la regulación de la glucosa sanguínea; mientras que la insulina favorece el metabolismo anabólico (síntesis de
macromoléculas), estas hormonas, en parte, inducen el metabolismo catabólico para romper grandes moléculas.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
28
Cuando se tiene un exceso de glucosa en la sangre por arriba del límite superior normal para una edad, se
presenta la hiperglucemia. Aunque los valores altos de glucosa sérica en ayunas se relacionan con suma
frecuencia con la presencia de diabetes sacarina, el número de enfermedades y trastornos fisiológicos que pueden
llevar a incrementos mayores es vasto. El aumento de la concentración de glucosa sérica se dan en: respuesta a
la tensión, enfermedad de Cushing, diabetes mellitus, acromegalia, hipertiroidismo, pancreatitis crónica,
administración de algunos fármacos como diuréticos clorotiacídicos porque suprimen la secreción de insulina,
coma hiperosmolar no cetónico.
La hipoglucemia es un trastorno caracterizado por una concentración de glucosa en ayunas, menor al límite
inferior normal para el grupo de edad y esto sucede en: enfermedad hepática, desnutrición, posgastrectomía,
tolerancia deficiente a la glucosa, administración excesiva de insulina, hipoglucemia funcional o espontánea,
ingestión de alcohol en ayunas. Debido a que la concentración de glucosa sérica por lo general se vuelve anormal
sólo cuando hay un trastorno grave de esta interacción, el verificar la glucosa sérica ayuda a evaluar la función e
integridad del sistema. La prueba de glucosa en ayunas evalúa de modo aproximado la capacidad del cuerpo para
regular la glucosa y proporciona información acerca de la clase de anormalidad, si es que la hay. No se tomarán
alimentos ni bebidas, excepto agua, cuando menos por ocho horas antes de tomar la muestra.
FUNDAMENTO:
La oxidación de la glucosa a ácido glucónico es catalizada por la glucosa oxidasa produciendo también peróxido
de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno reacciona con la 4-aminoantipirina y el ácido p-hidroxibenzoico en
presencia de la peroxidasa para dar lugar a un derivado quinónico, cuya coloración es proporcional a la
concentración de glucosa en la muestra.
UTILIDAD DIAGNÓSTICA
La determinación de glucosa en suero u orina se utiliza para la evaluación de los trastornos del metabolismo de
los hidratos de carbono. La glucosa es la fuente más importante de energía de las células del organismo. La
insulina, producida en las células pancreáticas, facilita la entrada de glucosa en las células de los tejidos.
El aumento de la glucosa en sangre está relacionada con una disminución de la actividad de la insulina o con una
deficiencia de ella. En suero o plasma se encuentran valores elevados de glucosa principalmente en pacientes con
diabetes mellitus pero también con pancreatitis aguda, síndrome de Cushing, acromegalia y gigantismo.
La hipoglucemia puede darse como respuesta al ayuno, o bien puede ser debida a fármacos, venenos o errores
congénitos del metabolismo. La presencia de glucosa en la orina sin que el individuo tenga diabetes suele ser una
señal de enfermedad en los túbulos renales.
La determinación de glucosa en LCR tiene interés principalmente en caso de meningitis bacterianas, en las que su
concentración es mínima o no se detecta.
Una única prueba de laboratorio no permite establecer un diagnóstico clínico. Este debe basarse en la totalidad de
los datos clínicos y de laboratorio.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
29
3.1. MATERIAL Y MÉTODOS
Material
 Espectrofotómetro calibrado a 505 nm.
 5 Tubos de ensayo de 13 x100mm, 1 micropipeta de 10 µL y 1 micropipeta de 1000 µL.
 Puntas para micropipeta, gradilla.
 Muestra Clínica: Suero o plasma venoso libre de hemólisis. Se obtendrá en el laboratorio.
1. La muestra debe recolectarse en ayuno (sin ingesta de alimentos durante ocho horas cuando menos
antes de la prueba). Debe recolectarse en tubo colector de tapón rojo para suero el cual no contiene
anticoagulante, o de color lila el cual contiene EDTA anticoagulante para obtener plasma.
2. La muestra debe centrifugarse a 3500 rpm durante 5 minutos para separar el suero o plasma. La glucosa
en suero o plasma es estable al menos 3 días a 2-8ºC.
3. La muestra es inaceptable si: a) Si el suero se obtiene turbio, b) Si la identificación es inadecuada, c) Si el
tubo de recolección no es el adecuado, d) Cuando se haya excedido el tiempo máximo de análisis
permisible, e) No se han observado interferencias por hemoglobina(4 g/L); bilirrubina (20mg/L); creatinina
(100mg/L), galactosa (1g/L).
3.2. Reactivos:
Kit 1 x 100 mL., Contiene:
A. 1 x 100 mL Reactivo
B. 1 x 5 mL Estándar
3.3. PREPARACIÓN
El reactivo y el estándar están listos para su uso.
Composición del reactivo
La concentración en la disolución reactiva es:
Tampón fosfato pH 6,8 100 mM
Ac. p-hidroxibenzoico 39,5 mM
4-aminoantipirina 0,8 mM
Fenol 4,5 mM
Glucosa oxidasa ≥ 18 kU/L
Peroxidasa ≥ 1,1 kU/L
Estabilizantes no reactivos
Estándar: Disolución acuosa equivalente a 100 mg de glucosa/dL (5,55 mmol/L).
3.4. MÉTODO
MUESTRA
1. Obtener la muestra de modo convencional (Suero, plasma o LCR.)
La glucosa en suero o plasma (no así en sangre total, a causa de los fenómenos glucolíticos) se
conserva como máximo 2-3 días a 2-8º C.
El LCR debe ser limpio y sin restos celulares. En estas condiciones la glucosa es estable 48 horas
a 2-8ºC
2. Rotular tubos de ensayo: con las letras B (blanco), M (muestra), P (patrón/Estándar))
3. Colocar en cada uno de ellos las cantidades que se indican en la tabla:
B M P
(blanco) (muestra) (patrón/estánda
r)
Reactivo de trabajo (mL) 1,0 1,0 1,0
Muestra (µL) 10
Patrón (µL) 10
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS
4. Mezclar e incubar a 37ºC 5 - 10 min. o 20-25 min. a 20 - 25ºC CA
5. Colocar el contenido de los tubos en cubetas para lectura en el espectrofotómetro. Leer la absorbancia (Abs)
del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable como mínimo 30 minutos.
6. Leer absorbancias a una longitud de onda de 505 nm. La estabilidad del color está determinada como mínimo
de 1 h, protegido de la luz solar directa
III. RESULTADOS
Cálculos:
(Abs) Muestra X 100 (Conc. Patrón) = mg/dL de glucosa en la muestra

(Abs) Patrón
Factor de conversión: mg/dL x 0,0555 =

mmol/L Unidades S.I.
mg/dL x 0,0555 = mmol/L
VALORES DE REFERENCIA
Suero, plasma (en ayunas):
Adulto: 74 - 115 mg/dL (4,1-6,4 mmol/L)
Niño: 60 - 100 mg/dL (3,3-5,6 mmol/L)
Neonato : 30 - 80 mg/dL (1,7-4,5 mmol/L)
Neonato prematuro: 20 - 60 mg/dL (1,1-3,3 mmol/L)
LCR:
Adulto: 40 - 70 mg/dL (2,2-3,9 mmol/L)
Niño: 60 - 80 mg/dL (3,3-4,5 mmol/L)
Orina: 1 - 15 mg/dL (0,1-0,8 mmol/L)
Estos valores son a título orientativo. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de
referencia.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
31
PRACTICA N° 5
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DEL COLESTEROL
LÍQUIDO
I. COMPETENCIAS
1. Conoce el manejo adecuado de la técnica para la determinación cuantitativa del Colesterol.

2. Explica la importancia del colesterol en el metabolismo humano y su relación con diversas patologías.
3. Determinar la concentración de colesterol líquido mediante el método enzimático colorimétrico.
II. INTRODUCCIÓN
El colesterol es una de las moléculas más importante del organismo humano. Es el compuesto esencial de las
membranas celulares. Además es el precursor de tres clases importantes de compuesto biológicos activos, el
ácido biliar, las hormonas esteroideas y la vitamina D. Los desórdenes del metabolismo del colesterol juegan un
papel importante en la etiología de la enfermedad cardiovascular.
El colesterol presente en el organismo tiene un doble origen, el exógeno, que procede de la dieta, se encuentra
en su mayor parte en forma libre –no esterificado-. El colesterol esterificado es hidrolizado por la colesterol
esterasa pancreática dando colesterol libre y ácidos grasos.El colesterol endógeno se forma fundamentalmente
a nivel hepático e intestinal y es eliminado por el hígado –con la bilis- o utilizado para la síntesis de ácidos
biliares.
El colesterol acompañado de triacilgliceroles y fosfolípidos, es transportado en lipoproteínas. Las más comunes

son las HDL y las LDL. Su importancia radica en que son capaces de proveer los medios para el transporte de
grasa entre los diferentes órganos y tejidos. Su importancia clínica radica en el papel que desempeñan en el
desarrollo de la ateroesclerosis: un fenómeno que posee un rango de enfermedades del sistema cardiovascular,
tal como la enfermedad cardiaca o el paro. Estas enfermedades son actualmente la principal causa de
mortalidad en las poblaciones occidentales.
El Colesterol puede causar problemas cuando existe en el organismo en cantidad mayor que la necesaria. El
exceso de Colesterol se puede depositar en diversas partes del cuerpo, como las paredes de las arterias. Las
LDL transportan el Colesterol por todo el organismo y son las causantes de los depósitos que obstruyen las
arterias, por lo que son consideradas como la fracción de Colesterol dañino".
En tanto se cree que las HDL extraen el Colesterol de la pared de las arterias, siendo por tanto, un indicador
favorable. El Colesterol sanguíneo proviene de dos fuentes: una fuente endógena, que corresponde a la
producción propia del organismo, en especial en el hígado y representa el 60 a 80% del Colesterol total y una
fuente exógena, que proviene de los alimentos que consumimos.
SIGNIFICADO CLÍNICO
Niveles elevados de colesterol en sangre se van a encontrar en casos de:
1. Dietas ricas en colesterol y grasas saturadas; estas últimas pueden elevar hasta en un 15-20% la cifra de
colesterol sanguíneo.
2. Hipotiroidismo, como consecuencia de la disminución del metabolismo lipídico
3. Diabetes mellitus: debido al incremento notable del metabolismo lipídico
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
32
4. En enfermedades de retención renal: en estos casos se eleva tanto el colesterol sanguíneo como los
triglicéridos y los fosfolípidos. Se cree que es debido a la inhibición de la lipoprotein lipasa, de manera que se
elevan considerablemente las grasas sanguíneas.
5. En casos de ictericia obstructiva
Niveles bajos de colesterol en sangre suelen ser indicativos de hepatitis grave y cirrosis.
El estudio del nivel sérico permite la detección y clasificación de las diversas hiperlipidemias y la evaluación del
riesgo de enfermedades cardíacas.
Los valores de colesterol son bajos en hipolipoproteinemias, hipertiroidismo y en algunos tipos de anemias.
Una única prueba de laboratorio no permite establecer un diagnóstico. Los resultados se han de evaluar en el
contexto de todos los datos clínicos y de laboratorio obtenidos.
PRINCIPIO DEL MÉTODO

El colesterol presente en el suero o plasma, a través de las cadenas de reacción indicadas, forma un complejo
coloreado que se puede cuantificar espectrofotométricamente.
III. MATERIALES Y MÉTODOS
 Suero o plasma del paciente

 Gradillas y tubos de prueba de 13 x 100 mm
 Pipetas automáticas de rango variable.
 Cronómetro
 Jeringas de 5 ml. Descartables
 Tips para micropipetas y torundas con algodón
 Ligaduras de látex y gasa
 Centrífuga, Espectrofotómetro y Baño maría
1. REACTIVOS
Kit 1 x 100 mL., contiene:
PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE TRABAJO
El reactivo y estándar están listos para su uso.
COMPOSICIÓN DEL REACTIVO
Tampón Mes pH 6,5 75 mM
Fenol 6 mM
2,4-diclorofenol 0,2 mM
Colesterol esterasa ≥ 500 kU/L
Colesterol oxidasa ≥ 300 kU/L
Peroxidasa ≥ 1200 kU/L
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
33
Estándar: Disolución de colesterol en isopropanol/agua equivalente a 200 mg/
dL(5,18 mmol/L).
2. MUESTRAS
Suero o plasma: No usar anticoagulantes con citrato.
No utilizar muestras hemolizadas. Separar el suero de los hematíes lo antes posible.
3. PROCEDIMIENTO
1. Obtener la muestra de modo convencional
B M P
r)
Muestra (µL) 10
Patrón (µL) 10
4. Mezclar e incubar durante 5min a 37ºC 5 o 10 min. a 20 - 25ºC
5. Colocar el contenido de los tubos en cubetas para lectura en el espectrofotómetro. Leer la absorbancia
(Abs) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo a una longitud de onda de 505nm. El color es
estable como mínimo 30 minutos.
6. La estabilidad del color está determinada como mínimo de 1 h, protegido de la luz solar directa
4. RESULTADOS
CÁLCULOS:
Factor de conversión:
Unidades SI
(mg/100 mL) x 0,0259 = mmol/L
Interpretación clínica
Según las recomendaciones de la Sociedad Europea de Aterosclerosis:
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
34
PRACTICA N° 6
DETERMINACIÓN
CUANTITATIVA DE
TRIGLICÉRIDOS LÍQUIDOS
I. COMPETENCIAS
1. Conoce el método para realizar una determinación cuantitativa de triglicéridos.
2. Fundamenta la reacción en la determinación triglicéridos y comprende la importancia de su cuantificación en
relación a diversas patologías
3. Determina la cantidad de Triglicéridos en una muestra se suero sanguíneo.
4. Conoce los valores de normales de triglicéridos en suero sanguíneo y relaciona las patologías a valores
alterados de éste.
II. INTRODUCCIÓN
Los triglicéridos son lípidos al igual que el colesterol y los fosfolípidos. Los triglicéridos son la forma ideal para el
almacenamiento de energía en nuestro organismo. Un hombre adulto y delgado tiene unos 15 kg de triglicéridos,
lo que representa un depósito de energía suficiente como para vivir tres meses sin comer. El lugar donde se
almacenan se llama tejido adiposo y, además de servir como depósito, tiene otras funciones importantes. Por
ejemplo, debido a que los triglicéridos son líquidos a temperatura ambiente, las capas de grasa alrededor de
algunos órganos, como los riñones, actúan como una especie de almohadón líquido que proporciona una
importante protección; también el tejido adiposo subcutáneo determina que el aspecto físico de una mujer y el de
un hombre sean diferentes, y actúa como una capa aislante térmica.
Existen dos fuentes importantes de producción. Una de ellas es la fuente externa, es decir, los triglicéridos que
ingerimos con los alimentos, y otra es la fuente interna, que consiste en los triglicéridos que produce el hígado.
Los triglicéridos de ambas fuentes van a circular por la sangre para llegar a todo el organismo en un medio de
transporte que recibe el nombre de lipoproteínas; las que transportan a los triglicéridos procedentes de la dieta se
llaman quilomicrones y las otras, VLDL. No debemos de olvidar que estos medios de transporte no son exclusivos
de los triglicéridos, sino que también transportan a otros lípidos como el colesterol.
Se considera ideal tener unos triglicéridos por debajo de 150 mg/dl, y valores superiores a 200 mg/dl constituyen
lo que se llama una hipertrigliceridemia, es decir, un exceso de triglicéridos por encima de los límites saludables;
esta se considera leve hasta valores de 400 mg/dl, moderada hasta valores de 1.000 mg/dl y grave o severa por
encima de esas cifras.
La asociación entre hipertrigliceridemia y enfermedad coronaria (infarto, angina de pecho, trombosis...) no está
totalmente clara. Sin embargo, hemos de tener en cuenta que las personas que tienen los triglicéridos altos
suelen tener también bajo el colesterol-HDL (colesterol bueno) y esto sí que representa un riesgo para desarrollar
una de estas enfermedades. Además, con mucha frecuencia la elevación de los triglicéridos se asocia con la
obesidad, que suele cursar, no solo con valores altos de triglicéridos, sino también de colesterol-LDL (colesterol
malo). La hipertrigliceridemia también suele asociarse con hipertensión arterial (tensión alta) y con diabetes,
factores todos ellos que se asocian a un alto riesgo de padecer enfermedad coronaria.
Si la hipertrigliceridemia es muy importante, el principal riesgo es padecer una grave enfermedad que se conoce
con el nombre de pancreatitis, que se trata de una inflamación del páncreas. Si bien la mayoría de las pancreatitis
asociadas a hipertrigliceridemia aparecen en personas con triglicéridos muy altos, pueden también producirse en
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
personas con triglicéridos en ayunas moderadamente altos si, por ejemplo, hacen una comida muy rica en grasa.
Determinadas enfermedades cursan con aumento de triglicéridos. Entre las más frecuentes están la diabetes, las
enfermedades del hígado, del tiroides y del riñón. Las embarazadas pueden también tener cifras elevadas de
triglicéridos en sangre. Junto con la diabetes, las causas más frecuentes de triglicéridos elevados son la obesidad
y el consumo de alcohol.
El aumento del nivel de triglicéridos en sangre es un factor de riesgo en el desarrollo de enfermedades coronarias.
Alrededor del 50% de los lípidos de las lesiones ateromatosas que ocurren en las arterias coronarias son
triglicéridos, por lo que es posible relacionarlos con la patogénesis de la ateroesclerosis coronaria.
La determinación de triglicéridos permite evaluar en forma temprana el riesgo a desarrollar ateroesclerosis
coronaria.
Los TGL pueden estar aumentados por quilomicronemia (Fredickson tipo I y V), hipertrigliceridemia tipo IV, en
diabetes mellitus, insulinoresistencia, obesidad, hipotiroidismo, pancreatitis, enfermedad del almacenamiento del
glucógeno, síndrome nefrótico, hipertrigliceridemia sensible a los hidratos de carbono, enfermedad de Tangier,
enfermedad de Von Gierke, anemia perniciosa, pancreatitis aguda, síndrome de Down, cirrosis biliar, septicemia.

Los triglicéridos presentes en la muestra se hidrolizan enzimáticamente por la acción de las lipasas dando lugar a
glicerol y ácidos grasos. En presencia de glicerol quinasa (GK), el ATP fosforila el glicerol para dar glicerol-3-
fosfato y el correspondiente ADP. Mediante la glicerolfosfato oxidasa (GPO) el glicerol -3- fosfato es oxidado a
dihidroxiacetona-fosfato y peróxido de hidrógeno.
En la última etapa, con la peroxidasa como catalizador, el peróxido de hidrógeno reacciona con la 4-
aminoantipirina y el 4-clorofenol para dar lugar a la quinoneimina. La intensidad del color generado es
proporcional a la cantidad de triglicéridos presentes en la muestra.
Suero o plasma del paciente

Gradillas y tubos de prueba de 13 x 100 mm
Pipetas automáticas de rango variable.
Cronómetro
Jeringas de 5 ml. Descartables
Tips para micropipetas y torundas con algodón
Ligaduras de látex y gasa
Centrífuga, Espectrofotómetro y Baño maría
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
36
1. REACTIVOS
Kit 1 x 100 mL., contiene:
El reactivo y estándar están listos para su uso.
COMPOSICIÓN DEL REACTIVO:
Tampón Pipes pH 6,8 50 mM
4-clorofenol 4,2 mM
ATP 2 mM
Aspartato Mg 40 mM
Glicerol-quinasa ≥ 800 U/L
Glicerol-3-fosfato oxidasa ≥ 2000 U/L
Peroxidasa ≥ 500 U/L
Lipasas ≥ 9000 U/L
Estándar: Disolución de glicerol en agua equivalente a 200 mg/dL (2,29 mmol/L)
2. MUESTRAS
Suero o plasma: No usar anticoagulantes con citrato. Los triglicéridos se conservan 4 días si se mantiene la
muestra a 2-8ºC, y hasta 3 meses a - 20ºC
No utilizar muestras hemolizadas. Separar el suero de los hematíes lo antes posible.
3. PROCEDIMIENTO:
B M P
r)
Muestra (µL) 10
Patrón (µL) 10
4. Mezclar e incubar durante 5min a 37ºC 5 o 10 min. a 20 - 25ºC
5. Colocar el contenido de los tubos en cubetas para lectura en el espectrofotómetro. Leer la absorbancia (Abs)
del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo a una longitud de onda de 546; 505 nm. La estabilidad del
color está determinada como mínimo de 1 h, protegido de la luz solar directa
4. RESULTADOS
CÁLCULOS:
Factor de conversión:
Unidades S.I.
(mg/dL triglicéridos) x 0,01143 = mmol/L triglicéridos
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
37
Mujeres: 40 - 160 mg/dL; 0,457 – 1,828 mmol/L
Hombres: 35 - 135 mg/dL; 0,400– 1,543 mmol/L
Estos valores son a título orientativo. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de
referencia.
Interpretación clínica
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
38
PRACTICA N° 7
DETERMINACIÓN
CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS
TOTALES Y ALBÚMINA
I. COMPETENCIAS
1. Conoce el método para realizar una determinación de la cantidad de proteínas totales.

2. Fundamenta la reacción en la determinación de proteínas totales y comprende la importancia de su
cuantificación en relación a diversas patologías
3. Determina la cantidad de albúmina en una muestra se suero sanguíneo.
4. Conoce los valores de referencia de proteínas totales y de albúmina en el suero sanguíneo relacionándolos
con patologías a valores alterados de éstos.
II. INTRODUCCIÓN
La sangre está formada por una solución acuosa que contiene moléculas de tamaño variable y tipos de
elementos celulares. Los elementos formes de la sangre se encuentran formando una suspensión en agua
denominada plasma. Aunque el plasma es el medio natural de las células sanguíneas, la mayoría de las
determinaciones químicas se hacen en suero. Las proteínas del plasma pueden clasificarse en dos grupos: las
que son sintetizadas por el hígado (albúmina) y las inmunoglobulinas (producidas por las células plasmáticas
de la médula ósea).
El plasma humano tiene una concentración en proteínas de 60--‐80 g/L (frecuentemente se expresa en g/dL; 6-
-‐8 g/dl). Casi la mitad de esta proteína plasmática es albúmina, cuyo rango de concentración es 35--‐45 g/L.
En el plasma, las proteínas contribuyen a mantener el volumen del fluido circulante, transportan sustancias
relativamente insolubles y actúan en la inactivación de compuestos tóxicos y en la defensa contra agentes
invasores. La determinación de proteínas totales es útil para el monitoreo de cambios ocasionados por diversos
estados de enfermedad. En condiciones patológicas como pérdidas renales, desnutrición, infecciones
prolongadas, etc., suelen presentarse hipoproteinemias, mientras que en otras como mieloma múltiple,
endocarditis bacteriana y hemoconcentración de diversos orígenes, (ej.: deshidratación) se observan
hiperproteinemias.
La albúmina es una proteína de 62.000 D que actúa como proteína de reserva, además de importante
transportador (ácidos grasos, bilirrubina y fármacos) y regulador osmótico. Es producida por el hígado. Su
concentración aumenta en casos de deshidratación y disminuye en casos de ascitis/edema y daño hepático
severo. La determinación de la concentración de proteínas en sangre puede ser llevada a cabo por diferentes
métodos. Su determinación es útil en la detección de: 1. Hiperproteinemia producida por hemoconcentración,
deshidratación o aumento en la concentración de proteínas específicas, 2. Hipoproteinemia por hemodilución
debida a un defecto en la síntesis proteica, perdidas excesivas (hemorragias) o catabolismo proteico excesivo.
El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
39
La albúmina es una de las más importantes proteínas plasmáticas producidas en el hígado. Entre sus múltiples
funciones se incluye nutrición, mantenimiento de la presión oncótica y transporte de sustancias como Ca++,
bilirrubina, ácidos grasos, drogas y esteroides.
UTILIDAD DIAGNÓSTICA DE LA DETERMINACION DE PROTEÍNA TOTAL

La determinación de la proteína total en suero se utiliza en el estudio del estado nutricional o de procesos
edematosos. Los niveles de proteína total son elevados (> 9,0g/dL) en: hiperinmunoglobulinemia, gammapatías
mono o policlonales, deshidratación, enfermedad hepática crónica y neoplasias, sobre todo en mielomas.
Los valores inferiores a lo normal (< 6,0g/dL) están asociados a la pérdida de proteínas en casos de
gastroenteropatías, quemaduras, síndrome nefrótico o son debidos a la disminución de la síntesis de proteínas
en enfermedad hepática crónica, agammaglobulinemia, síndrome de malabsorción o malnutrición.
En casos de embarazo, administración de líquidos intravenosos, alcoholismo crónico, insufi ciencia cardíaca o
hipertiroidismo, los valores de proteína en sangre son también inferiores a los normales.
Alteraciones en los valores de albúmina indican enfermedades del hígado, desnutrición, lesiones de la piel
como dermatitis, quemaduras severas o deshidratación. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en
cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.
En esta práctica vamos a utilizar uno de los métodos que se utilizan con más frecuencia: el método de Biuret.
En él la disolución de proteína se mezcla con un reactivo que determina que aparezca o se intensifique un
color (azul) que se cuantifica midiendo la absorbancia a una determinada longitud de onda frente a un blanco
de reactivo. El color generado es poco estable y depende de las condiciones de reacción, por lo que hay que
realizar una curva patrón con soluciones de una proteína de concentración conocida (albúmina bovina).
UTILIDAD DIAGNÓSTICA DE LA DETERMINACION DE LA ALBÚMINA

Se encuentran valores de Albúmina disminuidos en infecciones graves, fiebre reumática, enfermedades
hepáticas, como cirrosis o hepatitis crónica activa. También los valores son inferiores a lo habitual en procesos
de malabsorción u obstrucción intestinal y en casos de síndrome nefrótico.
En quemaduras graves se observa disminución de los valores de Albúmina, mientras que estos aumentan en
procesos de deshidratación.
PRINCIPIO DEL MÉTODO PROTEÍNAS TOTALES: En la determinación de Proteínas totales, Los

enlaces peptídicos de las proteínas en medio alcalino reaccionan con el ion cúprico, para dar un complejo
color violeta azulado con máximo de absorción a 540 nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración
de proteínas totales en la muestra ensayada.
PRINCIPIO DEL METODO ALBÚMINA: La albúmina se combina con el verde de bromocresol a pH

ligeramente ácido, produciéndose un cambio de color del indicador, de amarillo verdoso a verde azulado
(complejo coloreado) proporcional a la concentración de albúmina presente en la muestra ensayada.
III. A. MATERIALES Y MÉTODO PROTEÍNAS
TOTALES Materiales:
Suero o plasma heparinizado
Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 540 nm.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
42
40
Cubetas de 1,0 cm de paso de luz.
Tubos de ensayo de 13 X100mm.
1 micropipeta cap. 1.0 mL.
1 Micropipeta cap. 25 µL.
Puntas para Micropipetas.
Gradilla.
1. REACTIVOS
Kit 3 x 100 mL. . Contiene:
A. 3 x 100 mL Reactivo Biuret
El reactivo y el estándar están listos para su uso
NaOH 0,47 M
Yoduro potásico 23,3 mM
Sulfato de cobre (II) 6,5 mM
Tartrato sódico-potásico 22,1 mM
Conservantes y estabilizantes
Estándar: Disolución acuosa de proteínas equivalente a 5 g/dL (50 g/L).
2. MUESTRA
Suero o plasma sin hemólisis. Las muestras son estables 5 días, conservadas a 2 - 8ºC.
Para el uso del reactivo con otros fl uídos corporales (líquido amniótico, orina, exudados, etc.) debe tenerse
presente el margen de valores a detectar, que son variables según el tipo de muestra, y la sensibilidad del
reactivo.
3. PROCEDIMIENTO:
B M P
r)
Muestra (µL) 20
Patrón (µL) 20
4. Mezclar bien y dejar 10 min a temperatura ambiente (20 - 25ºC)
5. Colocar el contenido de los tubos en cubetas para lectura en el espectrofotómetro. Leer la absorbancia
(Abs) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo a una longitud de onda de 540 nm. La
estabilidad del color está determinada como mínimo de 3 h, protegido de la luz solar directa
4. RESULTADOS
CÁLCULOS:
Factor de conversión
Unidades S.I.
(g/dL) x 10 = g/L
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
VALORES DE REFERENCIA 43
41
Adultos: 6,4 - 8,3 g/dL
NIños:
Recién nacidos: 4,6 - 7,0 g/dL
< 1 año: 5,1 - 7,3 g/dL
1 - 2 años: 5,6 - 7,5 g/dL
> 3 años: 6,0 - 8,0 g/dL
Estos valores son a título orientativo. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios
valores de referencia.
III. B. MATERIALES Y MÉTODO PARA DETERMINACIÓN

DE ALBÚMINA DETERMINACIÓN DE ALBÚMINA
Materiales:
Suero o plasma heparinizado
Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 540 nm.
Tubos de ensayo de 13 X100mm.
1 micropipeta cap. 1.0 mL.
1 Micropipeta cap. 25 µL.
Puntas para Micropipetas.
Gradilla.
1. REACTIVOS
Kit 2 x 250 mL.. Contiene:
A. 2 x 250 mL Verde de bromocresol
El Reactivo está listo para su uso.
Las concentraciones en la disolución reactiva son:
Tampón succinato pH 4,2 50 mM
Verde de bromocresol 0,75 g/L
Tensoactivos
Estándar: Disolución acuosa equivalente de 5 g/dL de albúmina (50 g/L). Listo para su uso.
2. MUESTRA
Suero o plasma sin hemólisis. Las muestras son estables 5 días, conservadas a 2 - 8ºC.
Para el uso del reactivo con otros fl uídos corporales (líquido amniótico, orina, exudados, etc.) debe
tenerse presente el margen de valores a detectar, que son variables según el tipo de muestra, y la
sensibilidad del reactivo.
3. PROCEDIMIENTO:
B M P
r)
Muestra (µL) 10
Patrón (µL) 10
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
44
42
4. Mezclar bien y dejar 5 min a temperatura ambiente (20 - 25ºC)
5. Colocar el contenido de los tubos en cubetas para lectura en el espectrofotómetro. Leer la
absorbancia (Abs) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo a una longitud de onda de
630 nm.
INTERFERENCIAS
Mientras que la reacción entre el verde de bromocresol y la albúmina es instantánea, otras
fracciones proteicas producen con el reactivo una coloración adicional con el tiempo. Se
recomienda, por lo tanto, no demorar la lectura para evitar las interferencias.
4. RESULTADOS
CÁLCULOS:
Factor de conversión: Unidades SI (g/dL) x 10 = g/L
3,5 - 5,0 g/dL
Los valores indicados son a título orientativo; cada laboratorio debe establecer su propio rango de valores de
referencia.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
43
PRACTICA N° 8
DETERMINACIÓN DE AMILASA
LÍQUIDA
I. COMPETENCIAS
1. Aplica el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la amilasa en una muestra biológica
2. Establece los valores de referencia de la enzima α-amilasa y compara con el valor de nuestra muestra
problema a analizar.
3. Señala las principales patologías que se presentan por variaciones de los valores de α-amilasa en una
muestra biológica.
4. Aplicar el manejo adecuado de la técnica para la determinación de la lipasa en una muestra biológica.
5. Establecer los valores de referencia de la enzima Lipasa y compara con el valor de nuestra muestra
problema a analizar.
6. Señala las principales patologías que se presentan por variaciones de los valores Lipasa en una muestra
biológica
II. INTRODUCCIÓN
El páncreas puede ser la “glándula maestra” del cuerpo si se consideran los graves trastornos digestivos y
metabólicos que aparecen cuando se pierden sus funciones exocrinas y endocrinas. El principal trastorno al
que conduce la pérdida de la función endocrina es la diabetes mellitus, que cuenta con mayor morbilidad y
mortalidad que todas las otras enfermedades pancreáticas juntas. Las pruebas de laboratorio importantes a
este respecto, son la determinación de glucosa en sangre, fructosamina y hemoglobina A1c con objeto de
conocer el control glucémico a corto y largo plazo.
La pérdida de la función exocrina es común en la fibrosis quística y en algunos sujetos con ataques repetidos
de pancreatitis generalmente causados por el abuso crónico del alcohol. El páncreas tiene una gran reserva y
la pérdida de la función produce síntomas sólo después de que 85% de las células acinares se ha perdido.
Existen algunas pruebas de función pancreática que junto con la de grasa en materia fecal son las más
importantes. Las pruebas en suero, como la tripsina inmunorreactiva, son las menos sensibles y menos
específicas a pesar de ser las más fáciles de realizar.
La pancreatitis aguda es una de las principales emergencias médicas; el alcoholismo y las enfermedades del
tracto biliar son las causas predominantes, aunque sólo tenemos algunas evidencias conjeturales de cómo se
inicia una pancreatitis. Los cambios observados en las enzimas pancreáticas como amilasa y lipasa pueden ser
de moderados a intensos, desafortunadamente sólo es posible obtener una estimación gruesa de la gravedad
del padecimiento con los estudios de laboratorio. La pancreatitis crónica generalmente es la secuela de
múltiples brotes de la enfermedad aguda y los resultados de laboratorio normalmente no son muy útiles para el
diagnóstico.
El adenocarcinoma de páncreas, la forma común de la enfermedad maligna, es funesta para casi todos los
pacientes debido a la naturaleza invasiva del cáncer y su progresión rápida y silenciosa. No existen pruebas
adecuadas de escrutinio para el cáncer pancreático y la muerte se presenta típicamente de seis meses a un
año del diagnóstico. Las neoplasias de los islotes de Langerhans son un reto bioquímico para su diagnóstico.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
44
Excepto los gastrinomas que producen el síndrome de Zollinger-Ellison, la mayoría de estos tumores no son
malignos pero pueden poner en peligro la vida debido a la liberación no controlada de factores endocrinos y la
estimulación a sus órganos blancos. Para establecer el diagnóstico se requiere realizar pruebas que
determinen las hormonas normalmente producidas en las células del islote de Langerhans y otros factores.
La amilasa alfa (AMS) es una metaloenzima que requiere calcio y pertenece a la clase de
hidrolasas. La reacción enzimática que cataliza la amilasa alfa es la hidrólisis aleatoria de enlaces
glicosídicos alfa-1,4 internos del almidón, glucógeno y otros polímeros de la glucosa. Los productos de
digestión de la amilasa, que es una mólecula de almidón lineal que contiene sólo enlaces alfa 1,4, son
maltosa, maltotrinosa y otras dextrinas.
Las principales fuentes tisulares de esta enzima son las glándulas salivales y las células acinares del páncreas.
La actividad de amilasa alfa no es específica para estos tejidos, ya que también se encuentra en el epitelio
intestinal, trompas de Falopio, mucosa del cuello uterino, endometrio y tejido del seno durante la lactancia. La
principal función de la amilasa alfa se debe a la fracción pancreática, que ayuda a la digestión del almidón,
glucógeno y sus productos de descomposición en el intestino delgado. La AMS de la saliva inicia la digestión
de almidón en la cavidad oral, pero su acción termina con rapidez a consecuencia del pH ácido del jugo
gástrico durante la deglución.
Durante años los niveles de α-amilasa en suero nos han evidenciado la necesidad de su determinación para el
diagnóstico de pancreatitis aguda. Las primeras técnicas estaban basadas en los cambios de la absorción
máxima del complejo entre el almidón y el yodo, ya que la α-amilasa degrada al almidón. Otros métodos están
basados en la producción de p-nitrofenol a partir de sustratos oligosacáridos específicos con grupos
bloqueantes en el azúcar terminal. Estos métodos utilizan una variedad de enzimas para hidrolizar la corta
cadena de oligosacáridos para producir p-nitrofenol.
SIGNIFICADO CLÍNICO DE LA AMILASA:

La α-amilasa (AMS) es una enzima que ayuda a digerir el glucógeno y el almidón. Se produce
principalmente en las glándulas salivales y el páncreas exocrino. Su determinación se realiza principalmente
para diagnosticar o controlar enfermedades del páncreas como pancreatitis crónica o aguda. Puede reflejar
también enfermedad de la vesícula biliar, algunos problemas gastrointestinales y otros trastornos. El
diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.
PRINCIPIO DEL MÉTODO PARA LA DETERMINACION DE LA AMILASA

El sustrato, un oligosacárido de maltosa, está unido por uno de sus extremos al grupo cromógeno, mientras
que por el otro está bloqueado por un grupo etilideno. La degradación del sustrato se inicia al adicionar la α-
amilasa de la muestra y los oligosacáridos de cadena más corta producidos interaccionan con el enzima α-
glucosidasa con lo que se libera el grupo p-nitrofenol.
El aumento de Abs a 405 nm es proporcional a la actividad α-amilasa de la muestra.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
45
a. DETERMINACION DE
AMILASA MATERIALES
Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 405 nm (400 -420 nm)
Baño maría (37ºC )
Centrífuga
Cubetas de 1,0 cm de paso de luz
Suero o plasma heparinizado (suero libre de hemólisis)
Material habitual para extracción de sangre.
1. REACTIVOS
Kit 1 x 60 mL.
A. 1 x 50 mL Tampón / Enzimas
B. 1 x 10 mL Tampón / Substrato
Los reactivos A y B, están listos para su uso. En caso de que se quiera trabajar como Monorreactivo: mezclar
las cantidades deseadas, pero manteniendo la proporción 5 partes de A (Tampón / Enzimas) + 1 parte de B
(Tampón / Sustrato).
COMPOSICIÓN DEL REACTIVO DE TRABAJO

Tampón Hepes Ph 7,1 65 mM
NaCl 95 mM
MgCl2 15 mM
Etilideno-G7 PNP 17 mM
α-glucosidasa ≥ 4500 U/L
Estabilizantes y conservantes
2. MUESTRA
Suero, plasma heparinizado u orina. Utilizar muestras exentas de hemólisis.
En ausencia de contaminación bacteriana, la actividad α-amilásica en suero o plasma se mantiene en
refrigerador a 2-8ºC, durante 6 días. En orina dicha actividad se mantiene 10 días a 2-8ºC y 2 días a temp.
ambiente (≤ 25ºC).
3. PROCEDIMIENTO:
2. Llevar el reactivo de trabajo y el instrumento a 37ºC. Pipetear en el tubo de reacción
4. Mezclar e incubar durante 3 min. Pasar a cubeta termostatizada, 1 cm de paso de luz

A los 3 minutos poner el cronómetro en marcha y anotar la absorbancia. Repetir las lecturas exactamente
después de 1, 2 y 3 minutos. Determinar la ΔAbs/minuto promedio de las tres lecturas.
Blanco: medida frente a aire
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS 46 CA
4. RESULTADO CÁLCULOS:
Se utiliza la fórmula indicada para obtener el factor para calcular las U/L:
Donde:
Vt: Volumen total de la mezcla de reacción
Vs: Volumen de muestra
l: Paso de luz de la cubeta
Є: Coeficiente de extinción molar de p-nitrofenol, 10.600
Determinar la ΔAbs/min promedio y multiplicar por el factor:
U/L (37ºC) = 2930 x ΔAbs 405 nm /min
µkal / L (37ºC) = 48.8 x ΔAbs 405 nm /min
Suero / Plasma: 28 – 100 U/L (0,47 – 1,67 µktal/L)
Orina: ≤ 460 U/L (≤ 7,67 µktal/L)
Los valores indicados son a título orientativo. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
47
PRACTICA N° 9
DETERMINACION DE CALCIO
I. COMPETENCIAS
1. Demuestra manejo adecuado de la técnica para la determinación de calcio en una muestra
biológica.
2. Reconoce valores normales de referencia de las actividades de este elemento en suero humano
y compara con el valor de la muestra problema a analizar.
3. Reconoce cuales son las principales patologías que se presentan por variaciones de valores de este
elemento en una muestra biológica
II. INTRODUCCION
El calcio es necesario para la contracción muscular, la trasmisión del impulso
nervioso, la secreción hormonal, la coagulación, división y motilidad celular, etc.
La concentración sérica de calcio incluye la fracción de calcio unido a proteínas
(fundamentalmente la albumina) y el calcio iónico, que representa aproximadamente
el 50% del calcio total y que es fisiológicamente activo. Son sus ascensos o
descensos los que originan las manifestaciones clínicas.
Como para la determinación del calcio iónico se requiere de la realización de una
gasometría, en la práctica clínica, si no se sospecha alteración de pH, se suele
realizar la determinación del calcio total corrigiéndose la calcemia en función de la
concentración de la albumina o de las proteínas totales.
En general, para cada aumento o descenso de 1 g/dl de la albumina sérica sobre el
valor normal, el calcio aumenta o disminuye 0,8 mg/dl.
Los niveles de calcio en suero aumentan (Hipercalcemia) se produce cuando la
entrada de calcio en el torrente sanguíneo es superior a su excreción renal en casos
de aumento de la resorción ósea por hiperparatiroidismo, neoplasias, inmovilización
prolongada, hipervitaminosis A; aumento de absorción intestinal por ingesta de calcio
elevada o hipervitaminosis D; insuficiencia suprarrenal aguda, condrodisplasia.
La bibliografía define a la Hipocalcemia como la disminución del calcio sérico a
niveles inferiores a 8,5 mg/dl. Ante una cifra baja de calcemia debe determinarse el
calcio iónico o realizar la corrección del calcio en función de las proteínas para
descartar seudohipocalcemia, relativamente frecuente en pacientes hospitalizados
crónicos por hipoalbuminemia.
Una hipocalcemia verdadera puede deberse a: deficiente aporte de calcio desde el
hueso (por hipoparatiroidismo, deficiencia de vitamina D, precipitación de calcio en
hueso o tejidos)
SIGNIFICANCIA CLINICA
El calcio es esencial en la mayoría de las reacciones de la coagulación sanguínea y en la
regulación de la excitabilidad de las fibras musculares.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS 48 CA
Su concentración en suero y orina está regulada por la acción de factores tales como niveles de
parathormona, vitamina D y fósforo, observándose fluctuaciones fisiológicas debidas a edad,
sexo, embarazo, actividad física, cambios estacionales (por acción de la luz solar).
La hipercalcemia está relacionada con distintas patologías: hiperparatiroidismo, neoplasias
óseas, intoxicaciones con vitamina D.
La hipocalcemia se asocia con desórdenes tales como hipoparatiroidismo, deficiencia
de vitamina D, malabsorción
III. FUNDAMENTO DEL METODO
El calcio reacciona con arsenazo III dando un complejo de color azul que se mide
fotocolorimétricamente a 650 nm.
IV. MATERIALES Y METODOS
REACTIVOS PROVISTOS
A. Reactivo A: solución de arsenazo III 100 mg/l y 8-hidroxi- quinolina sulfonato 1,4 g/l en buffer
Tris 100 mM, pH 8,5.
S. Standard*: solución de calcio 10 mg/dl.
REACTIVOS NO PROVISTOS
- Agua destilada o desionizada.
- Calibrador A plus de Wiener lab. cuando se emplea la técnica automática. Puede también
emplearse en calibración de técnicas manuales.
MUESTRA
Suero, plasma heparinizado u orina
a) Recolección:
- Suero o plasma: obtener de la manera usual.
- Orina: recolectar orina de 24 horas sobre 20 ml de ácido clorhídrico al 50%. Llevar a 2 litros
con agua y homogeneizar.
PROCEDIMIENTO
En tres tubos marcados B (Blanco), S (Standard o Cali- brador) y D
(Desconocido) colocar:
B S D
Muestra - - 10 ul
Standard o Calibrador - 10 ul -
Agua destilada 10 ul - -
Reactivo A 1 ml 1 ml 1 ml
Mezclar e incubar 2 minutos a temperatura ambiente (15-25 C). Leer la

o
absorbancia en espectrofotómetro a 650 nm o en fotocolorímetro (620-650

nm), llevando el aparato a cero con el Blanco.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
49
VALORES DE REFERENCIA:
SUERO 8,5 – 10,5 mg/dl
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
50
PRACTICA N° 10
DETERMINACIÓN DE
FOSFATASA ALCALINA
I. COMPETENCIAS
1. Demuestra manejo adecuado de la técnica para la determinación de la enzima fosfatasa alcalina en una
muestra biológica.
2. Reconoce valores normales de referencia de las actividades de esta enzima y compara con el valor de la
muestra problema a analizar.
3. Reconoce cuales son las principales patologías que se presentan por variaciones de valores de esta enzima
en una muestra biológica.
II. INTRODUCCIÓN
La fosfatasa alcalina (Ortofosfórico monoéster fosfohidrolasa) es una enzima ampliamente distribuida que
hidroliza el enlace éster fosfórico entre un grupo fosfato y un radical orgánico a pH básico (pH óptimo entre 9 y
10) liberando fosfato inorgánico. Es una enzima que está presente en la totalidad de tejidos corporales,
principalmente en el epitelio intestinal (donde participa en el transporte de lípidos) y en los osteoblastos (donde
interviene en el proceso de remodelación ósea), y también en la placenta (sobre todo en el tercer bimestre del
embarazo), y en el hígado, donde se halla en las membranas de los sinusoides y canalículos.
Está presente en riñón, hígado, intestino y hueso. La medida de niveles anormales de fosfatasa alcalina en el
suero indican la existencia de enfermedades óseas degenerativas (raquitismo, osteomalacia,
hiperparatiroidismo secundario, osteosarcoma) o bien daños hepáticos. El aumento fisiológico de los niveles
plasmáticos de fosfatasa alcalina se produce en animales en fase de crecimiento (se está formando tejido
óseo) o en hembras gestantes (fosfatasa alcalina de la placenta).
Ante una concentración aumentada de fosfatasa alcalina en el plasma puede considerarse la posibilidad de
que la enzima provenga de tejidos no hepáticos. Para confirmar el origen hepatobiliar de la fosfatasa alcalina
se puede medir la concentración de otras enzimas procedentes del tracto biliar, como la 5’-nucleotidasa o la δ-
glutamiltransferasa: una concentración elevada en el plasma de cualquiera de las dos indica que la fosfatasa
alcalina es de procedencia hepatobiliar y no ósea. No obstante debe tenerse en cuenta que la concentración de
5’-nucleotidasa puede elevarse en el embarazo, mientras que la δ-glutamiltransferasa puede inducirse por
diversos fármacos o por abuso de alcohol.
La concentración de fosfatasa alcalina es de sensibilidad diagnóstica para Colestasis. Cuando se produce una
obstrucción biliar, se induce la síntesis enzimática en los hepatocitos adyacentes al canalículo biliar y se forma
una mayor cantidad de fosfatasa alcalina, que pasa a los sinusoides. Este aumento se refleja en una
concentración en el plasma elevado. Las causas más probables de aumento del nivel de FAL: Enfermedad
ósea de Paget, obstrucciones hepáticas, hepatitis, hepatotoxicidad por medicamentos y osteomalacia. Causas
más probables de disminución del nivel de FAL: Cretinismo y déficit de vitamina C.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
51
El control de la liberación del p-nitrofenol por la acción de la fosfatasa alcalina sérica sobre el sustrato p-
nitrofenilfosfato, permite la determinación de la actividad del enzima.
En condiciones óptimas de reacción, la ΔAbs/min es proporcional a la concentración de fosfatasa alcalina
presente en la muestra.
La velocidad de formación del p-Nitrofenol, determinado fotométricamente, es proporcional a la concentración

catalítica de fosfatasa alcalina en la muestra ensayada (SUERO).
El p-nitrofenol (pNF) en solución alcalina es amarillo y su concentración puede ser determinada

espectrofotométricamente. La absorbancia de la solución (intensidad del color amarillo) es una medida de la
concentración del producto.
La fosfatasa alcalina es un enzima cuya concentración sérica puede estar alterada por diversas enfermedades.
Su principal aplicación clínica tiene relación con aquellos casos de enfermedad obstructiva hepática, con
elevaciones importantes del nivel basal, especialmente en obstrucciones extrahepáticas y en enfermedades
metabólicas óseas asociadas a un aumento de la actividad osteoblástica.
El aumento de actividad asociado a metástasis óseas sólo se produce en el caso de lesiones
osteoescleróticas.
MATERIALES
Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 405 nm
Centrífuga
Cubetas de 1,0 cm de paso de luz
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
52
Suero o plasma heparinizado (suero libre de hemólisis)
Material habitual para extracción de sangre.
1. REACTIVOS
Kit 1 x 60 mL.
A. 1 x 50 mL Tampón / Enzimas
B. 1 x 10 mL Tampón / Substrato
Los reactivos A y B, están listos para su uso. En caso de que se quiera trabajar como Monorreactivo:
mezclar los volúmenes deseados manteniendo la proporción 4 partes de A (Disol. tampón) + 1 parte de B
(Sustrato).
Tampón 2-Amino-2-metil-1-propanol pH 10,4 0,70 M
p-nitrofenilfosfato 12 mM
HEDTA 1,55 mM
Acetato de magnesio 1,50 mM
Sulfato de zinc 0,95 mM
Estabilizantes y conservantes
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Los componentes del kit almacenados a 2-8ºC, son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta.
Una vez mezclados los componentes A y B, la disolución monorreactiva es estable 3 semanas a 2-8º C y 1
semana a temperatura ambiente (≤ 25º C), siempre que se mantenga al abrigo de la luz.
2. MUESTRA
Suero o plasma con heparina. Utilizar muestras exentas de hemólisis.
Los sueros mantenidos a 2-8ºC, son estables durante 7 días.
3. PROCEDIMIENTO:
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS
4. Utilizar agua para el blanco CA
5. Mezclar bien. Poner en marcha el cronómetro.
6. Transferir a la cubeta de lectura y leer las absorbancias después de 1, 2, 3 y 4 min.
7. Determinar la ΔAbs/min promedio de las lecturas
4. RESULTADO
CÁLCULOS
Se utiliza la fórmula indicada para obtener el factor para calcular las U/L:
Donde:
Vt: Volumen total de la mezcla de reacción;
Vs: Volumen de muestra
l: Paso de luz de la cubeta
Є: Coeficiente de extinción molar de p-nitrofenol en medio alcalino a 405 nm: 18.500
Monorreactivo 405 nm Factor: 2760
Birreactivo 405 nm Factor: 3432
U/L = ΔAbs/ min x Factor
Adultos: Hombres Mujeres
53 – 128 U/L 42 – 141 U/L (*)
Menores de 18 años: Niveles muy variables, entre 42 – 383 /L

(*) En mujeres embarazadas el valor puede ser el doble que en mujeres no embarazadas.
Los valores indicados son a título orientativo. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
54
PRACTICA N° 11
DETERMINACIÓN DE
TRANSAMINASAS AST / ALT
I. COMPETENCIAS
1. Conoce el manejo adecuado de la técnica para la determinación práctica de las transaminasas.
2. Conoce la utilidad que tiene la determinación de la actividad de la TGP y la TGO en el suero.
3. Interpreta bioquímicamente la elevación de las enzimas en el suero.
4. Conoce la importancia de las enzimas en el diagnóstico clínico.
II. INTRODUCCIÓN
Las transaminasas son enzimas que catalizan la transferencia reversible de un grupo amino entre un aminoácido
y un cetoácido. Esta función es esencial para la producción de los aminoácidos necesarios para la síntesis de
proteínas en el hígado. La aspartato aminotransferasa (= AST = glutámico oxalacético transaminasa = GOT ) se
localiza sobre todo en la mitocondria y está presente en otros órganos, además del hígado, como son, en orden
de frecuencia, el miocardio, músculo esquelético, riñones, cerebro, páncreas, pulmón, leucocitos y eritrocitos.
Por el contrario, la alanina aminotransferasa (= ALT = glutámico pirúvico transaminasa = GPT) se localiza
fundamentalmente a nivel citosólico en el hepatocito, lo que explica su mayor especificidad.
Ambas están presentes en suero en concentraciones inferiores a 30-40 UI/l, aunque el valor considerado como
normal varía entre laboratorios, y se debería ajustar según sexo e índice corporal, presentando también algunas
diferencias étnicas. La elevación plasmática de las transaminasas es un indicador sensible de daño
hepatocelular, aunque no específico. Prácticamente cualquier enfermedad hepática que comporte un daño
necroinflamatorio puede ser la causa. El aumento de transaminasas en sangre aparece cuando existe daño de la
membrana celular y no siempre requiere la necrosis de los hepatocitos.
De hecho, hay escasa correlación entre el daño celular hepático y el grado de elevación de las transaminasas.
Además, enfermedades no hepáticas también pueden ocasionar la elevación, aguda o crónica, de las cifras de
transaminasas, sobre todo de la AST. Es el caso, por ejemplo, de procesos musculares como distrofias,
polimiositis o traumatismos, o el infarto agudo de miocardio, incluso cuadros muy banales, tales como un
proceso gripal, pueden producir elevaciones transitorias de las transaminasas. Es importante recordar que la
elevación de un parámetro de laboratorio la definimos en función de criterios estadísticos que establecen la
normalidad. Esto es, se define como normal el rango que incluye a la media de la determinación de un parámetro
concreto en grupo de personas sanas, ± 2 desviaciones estándares. Por lo tanto, el 2,5% de las personas sanas
de ese grupo tendrán dicha determinación, en este caso las transaminasas, por encima del rango que
consideraremos normal.
Principio:
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
55
GPT
Ac. α-cetoglutárico + L-Alanina Ac. L-Glutámico + Ac. Pirúvico
LDH
Ac. Pirúvico + NADH+ + H Ac. L-Láctico + NAD+
GOT
Ac. α-cetoglutárico + Ac. L-Aspártico Ac. L-Glutámico + Ac. Oxalacético
MDH
Ac. Oxalacético + NADH+ + H Ac. L-Málico + NAD+
Se observan incrementos de la actividad GOT y GPT en suero en casos de daño hepático: hepatitis de
diversos tipos, necrosis o deño en hepatocitos, icteria colestática.
Se observan también niveles elevados en enfermedades que afectan al músculo cardíaco.
En hepatitis alcohólica y en infarto agudo de miocardio, el aumento de la actividad GOT es mayor que el
de la actividad GPT, por el contrario en las hepatitis víricas el aumento de GPT es siempre mayor que el
de GOT. El aumento de la actividad enzimática GPT es un indicador más específi co de daño hepático que
el cociente GOT/GPT.
Una única prueba de laboratorio no permite establecer un diagnóstico. Los resultados se han de evaluar
en el contexto de todos los datos clínicos y de laboratorio obtenidos
III. MATERIALES Y
MÉTODO
MATERIALES
Pipetas de vidrio de 1 y 2 mL.
Micropipeta de rango variable.
Cubetas para espectrofotómetro.
Centrífuga
Espectrofotómetro UV-VISIBLE marca UNICO 505 nm.
1. REACTIV
OS
GOT/AST
Kit Contiene:
A. 1 x 100 mL Disol. de sustrato
B. 1 x 100 mL Revelador de color
C. 1 x 100 mL NaOH 4N
D. 1 x 10 mL Standard
GPT/ALT
Kit Contiene:
A. 1 x 100 mL Disol. de sustrato
B. 1 x 100 mL Revelador de color
C. 1 x 100 mL NaOH 4N
D. 1 x 10 mL Standard
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
56

Tanto las disoluciones de sustrato como el reactivo de color y el standard están listas para su uso. El NaOH 4N
deberá diluirse 1/10 con agua desionizada, antes de su uso.
Disolución de sustrato para GOT:
Ac. α-cetoglutárico 2 mM
Ac. L-aspártico 100 mM
Disolución de sustrato para GPT:
Ac. α-cetoglutárico 2 mM
L-alanina 200 mM
Revelador de color:
2,4-dinitrofenilhidracina (DNFH) 1 mM
Standard: Disolucion acuosa de piruvato sódico.
Los componentes del kit almacenados a 2-8ºC, son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la
etiqueta. La disolución de NaOH diluída puede mantenerse a temp. ambiente (≤ 25ºC) en botella de polietileno,
bien tapada para evitar la carbonatación.
2. MUESTRA
Suero o plasma con heparina o EDTA como anticoagulante. Utilizar muestras exentas de hemólisis.
Los sueros mantenidos a 2-8ºC, pierden aproximadamente el 10% de actividad a los 3 días.
3. PROCEDIMIENTO:

4. Utilizar agua para el blanco

G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
57
5. Mezclar bien. Estabilidad de color: un mínimo de 1 hora
6. Leer las ABs.
4. RESULTADO
S CÁLCULOS
Para hallar el valor de la actividad de la GOT o GPT, se interpola la Absorbancia obtenida en la curva de
calibración. Los resultados se expresan en U/mL
Curva de calibración
Preparar una batería de tubos según el siguiente esquema:
Añadir 0,5 mL de reactivo de color (DNFH) a cada tubo. Mezclar y dejar 20 min. a temp. ambiente (≤ 25ºC).
Adicionar, por último, 5 mL. de NaOH 0,4 N y, transcurridos 15 min. leer la Abs frente a un blanco de agua.
Con los valores hallados preparar una curva de calibración, disponiendo en abscisas las U/mL y en ordenadas las
Abs leídas.
Sueros que den valores de GOT superiores a 215 U/mL o de GPT superiores a 126 U/mL, deberán diluirse 1/10 con
disolución salina (NaCl 0,9%) y repetir la determinación. Multiplicar el resultado por 10.
Nota
Con el fi n de facilitar los pasos de la reacción colorimétrica, cuando se determinen simultáneamente GOT y GPT,
iniciar 30 min. antes la incubación del sustrato GOT.
Unidades S.I.
Para la conversión de U/mL en UI/L se utiliza el factor: UI/L = (U/mL) x 0,483
GOT: 8 - 40 U/ mL (3,5 - 19 UI/ L)
GPT: 5 - 30 U/ mL (2,5 - 15 UI/ L)
Los valores indicados son a título orientativo. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de
referencia.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
58
PRACTICA N° 12
DETERMINACIÓN DE CREATININA Y BILIRRUBINA TOTAL Y
DIRECTA
I. COMPETENCIAS
1. Conoce el manejo adecuado de la técnica para la determinación de creatinina y bilirrubina en una

muestra biológica.
2. Reconoce los valores de referencia de la creatinina y bilirrubina total y directa, y compara con el valor
una muestra problema a analizar.
3. Define cuáles son las principales patologías que se presentan valores altos o bajos de creatinina y
bilirrubina en una muestra biológica.
II. INTRODUCCIÓN
La creatinina es un producto final del metabolismo muscular. Se origina a partir de la creatina por pérdida
de una molécula de agua. A su vez, la creatina se produce por hidrólisis del fosfato de creatina, por acción
de la creatin-fosfo-kinasa (CPK), apareciendo como metabolitos de dicha reacción el fosfato energético y la
creatina. El radical fosfato puede aportar energía directamente por dicha reacción o a través de su
acoplamiento a una molécula de ADP para formar ATP y posterior hidrólisis por acción de ATPasa.
La eliminación de creatinina en el cuerpo humano tiene lugar casi exclusivamente a través de la filtración
glomerular, siendo un importante índice del funcionalismo renal. A diferencia de la urea, la eliminación de
creatinina por la orina no viene afectada por la diuresis, al mismo tiempo que para una misma persona es muy
constante su eliminación diaria con casi independencia de la dieta alimenticia, siendo la masa muscular el factor
condicionante más directo de su excreción total por día. La eliminación de creatinina en un intervalo de 24 horas
es un valor constante, dependiente principalmente de la masa muscular del individuo, y que por otro lado el
cálculo del aclaramiento de la creatinina será un parámetro directo del funcionalismo renal.
La creatinina es el resultado de la degradación de la creatina, componente de los músculos y puede ser

transformada en ATP, fuente de energía para las células. La producción de creatinina depende de la
modificación de la masa muscular. Varía poco y los niveles suelen ser muy estables. Se elimina a través del
riñón. En una insuficiencia renal progresiva hay una retención en sangre de urea, creatinina y ácido úrico.
Niveles altos de creatinina son indicativos de patología renal. El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en
cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.
La bilirrubina se origina por degradación del grupo hemo de la hemoglobina, que a su vez aparece en el
plasma como consecuencia de la destrucción de los glóbulos rojos en el sistema retículo endotelial. La
hemoglobina, una vez liberada en el interior del eritrocito, se combina con las haptoglobinas, proteínas
plasmáticas específicas para su transporte. En una primera etapa y tras su liberación de la haptoglobina, se
forma, por acción de una oxigenasa, un grupo formilo, con lo que se rompe el anillo tetrapirrólico del hemo,
formándose el compuesto denominado biliverdina, que en una etapa posterior y por acción de una reductasa
se transforma en bilirrubina.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS 59 CA
Desde un punto de vista analítico y clínico, interesa conocer los niveles de bilirrubina total y diferenciar
cuantitativamente la "bilirrubina libre" o prehepática que aumenta principalmente en procesos de tipo hemolítico,
de la "bilirrubina conjugada" o hepática que está incrementada en la disfunción hepática y más concretamente en
fallos de los mecanismos de su eliminación, a través del sistema biliar, cuyo primer paso es introducirse del
hepatocito a los canalículos biliares.
Casi todas las técnicas de cuantificación de la bilirrubina se basan en la reacción de Malloy-Evelyn, que valora
colorimétricamente por la formación de azobilirrubina, de color rojo cereza, cuando a la bilirrubina se la hace
reaccionar en determinadas condiciones con el ácido sulfanílico diazotado.
La bilirrubina se origina por la degradación de la hemoglobina. Es transportada del bazo al hígado y se excreta
en la bilis. La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. Causas más
probables de la hiperbilirrubinemia: Bilirrubina Total: Aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas, anemia
neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas.
PRINCIPIO DEL TEST DE CREATININA

En medio alcalino la creatinina forma con el ác. pícrico un compuesto coloreado, picrato alcalino de creatinina,
que se determina fotométricamente. El color producido en la reacción es proporcional a la concentración de
creatinina de la muestra, en condiciones óptimas de ensayo.
La reacción química aplicable para fotometría es la descrita por Jaffe, basada en el color anaranjado (Complejo
rojizo) que se produce al reaccionar la creatinina con el picrato alcalino. Hay varias substancias en el suero y
orina que actúan como cromógenos inespecíficos, lo que es un problema principalmente para el cálculo del
aclaramiento. Por este motivo tiene una gran importancia la adecuación de todas las variables de la reacción,
muy especialmente el pH, con el fin de obtener la máxima sensibilidad para la creatinina y la mínima
interferencia de cromógenos.
Adaptando la reacción a una medida cinética, se logra una gran especificidad debido a que la creatinina
reacciona con el picrato alcalino con más rapidez que los cromógenos (metilguanidina, picramato), por lo que la
medida del incremento de color en un breve período de tiempo inicial de la reacción valorarán principalmente
creatinina, con poca influencia de los cromógenos inespecíficos, por esto es recomendable, de ser posible, la
determinación cinética.
PRINCIPIO DEL TEST DE BILIRRUBINA
La bilirrubina total se determina por reacción con el ácido sulfanílico diazoado, en presencia de cafeína, que da
lugar a la formación de un azopigmento. La bilirrubina directa se determina mediante la reacción anterior, en
ausencia de cafeína.
La bilirrubina conjugada, muy polar, reacciona en medio acuoso con el reactivo de diazotación, por lo que se le
llamó directa, pues al poner en contacto el suero y el reactivo aparecía directamente el color. Sin embargo, la
bilirrubina libre, poco polar, no da directamente la reacción y es preciso añadir un tercer reactivo que inicialmente
fue el metanol- para que produzca la reacción de diazotación con la consiguiente aparición del color; por este
motivo se llamó bilirrubina indirecta.
Como fundamento se dice que la bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el ácido sulfanílico diazotado
midiéndose fotométricamente. De las dos fracciones presentes en suero, bilirrubin-glucurónido y bilirrubina libre
ligada a la albúmina, sólo la primera reacciona en medio acuoso (bilirrubina directa) precisando la segunda la
solubilización con cafeína para que reaccione (bilirrubina indirecta).
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
60
En la determinación de la bilirrubina indirecta se determina también la directa, correspondiendo el resultado
a la bilirrubina total. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de bilirrubina
presente en la muestra ensayada.
SIGNIFICADO CLÍNICO DE LA CREATININA

La creatinina aumenta en suero en casos de insufi ciencia renal, aguda o crónica, en hipertiroidismo y en acromegalia
o gigantismo activos.
En orina el aumento se presenta en diabetes mellitus e infecciones. También, el ejercicio favorece el aumento de su
excreción por la orina.
Durante el embarazo o por disminución de la masa muscular, la concentración de Creatinina en suero se reduce,
mientras que en orina se encuentra disminuida en insufi ciencia renal, miopatías, anemias o hipotiroidismo.
SIGNIFICADO CLÍNICO DE LA BILIRRUBINA
La bilirrubina es un producto del metabolismo de la hemoglobina que se transporta al hígado, allí se conjuga con
ácido glucurónico y el hígado la segrega a través de la bilis. Esta bilirrubina conjugada es la llamada bilirrubina
directa, mientras que la bilirrubina no conjugada se denomina bilirrubina indirecta. La bilirrubina total en el suero
equivale a la bilirrubina directa más la bilirrubina indirecta.
La bilirrubina directa aumenta en la obstrucción de vías biliares, cirrosis y hepatitis.
El aumento de la bilirrubina indirecta o de la total puede indicar enfermedades hemolíticas, ictericia neonatal fi
siológica, enfermedad Gilbert o intolerancia a la fructosa.
A). CREATININIA
1. MATERIALES:
Espectrofotómetro o analizador para lecturas a 546 nm .
Equipamiento habitual de laboratorio.
Suero o plasma heparinizado.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
61
Orina: Diluir la muestra al 1/50 con agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado
obtenido por 50 (factor de dilución)
2. REACTIVOS
Kit 2 x 100 mL. Contiene:
A. 1 x 100 mL Disolución ác. pícrico
B. 1 x 100 mL Disolución alcalina
C. 1 x 5 mL Estándar
Mezclar volúmenes iguales de los dos reactivos (A y B) antes de proceder al ensayo.
Ac. pícrico 55 mM
DMSO 2,8 mM
NaOH 0,50 M
Estándar. Disolución acuosa de creatinina equivalente a 2,0 mg/dL ( 176,8 μmol/L). Lista para su uso
Los componentes del kit almacenados a temperatura ambiente (≤ 25ºC), son estables hasta la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta. Los reactivos A y B una vez mezclados son estables 21 días a
temperatura ambiente (≤ 25ºC). Conservar en la oscuridad.
3. PROCEDIMIENTO:
2. Llevar el reactivo de trabajo a temperatura ambiente. Pipetear en el tubo de reacción
B (blanco) M (muestra) P (patrón/estándar)
Reactivo (mL). 1 1 1
Muestra (µL) 100
Patrón ( estándar) (µL) 100
4. Mezclar bien y colocar en las cubetas. El blanco es el contenido del reactivo

5. Anotar las Abs a 20 y 80 seg.
4. RESULTADO
CALCULO
Concentración de creatinina
Determinar la ΔAbs obtenida para la muestra y el ST según la fórmula:
Unidades S.I. :(mg/dL) x 88,4 = μmol/L

Suero/plasma Orina(*)
Hombres: 0,6-1,1 mg/dL 21-26 mg/Kg/24 h.
Mujeres: 0,5-0,9 mg/dL 16-22 mg/Kg/24 h
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
62
B).BILIRRUBINA
TOTAL MÉTODO:
1. MATERIALES:
2. REACTIVOS
Kit 1 x 250 mL.
A. 1 x 50 mL Ac. Sulfanílico.
B. 2 x 100 mL Cafeína.
C. 1 x 2 mL Nitrito sódico.
Preparación del reactivo diazo: Mezclar 1 parte de la disolución C con 50 partes de la disolución A.
COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS
Las concentraciones en las disoluciones reactivas son:
A. Ác. sulfanílico 6 mM
HCl 0,17 M
B. Cafeína 0,25 M
Benzoato sódico 0,50 M
C. Nitrito sódico 0,4 M
MUESTRA
Suero o plasma exento de hemólisis.
La bilirrubina sérica disminuye en un 50 % después de 1 hora a temperatura ambiente (≤ 25ºC), y expuesta a
la luz solar directa. Las muestras mantenidas a 2-8ºC en la oscuridad son estables aproximadamente 3 días.
3. PROCEDIMIENTO:
3. Colocar en cada uno de ellos las cantidades que se indican en la tabla, Blanco: Agua:
4. Mezclar bien, incubar a temperatura ambiente (20-25°)

5. Leer exactamente a los10 min.
4. RESULTADOS
CALCULOS:
Δ Abs = Abs muestra (M) – Abs (BM) de la muestra
Δ Abs x 12,8 = mg bilirrubina total / dL
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
63
Unidades SI
mg / dL x 17,1 = μmol / L
Adultos: hasta 1 mg/dL de bilirrubina total
Recién nacidos Prematuros No-Prematuros

< 1 día 1,0 - 8,0 mg/dL 2,0 - 6,0 mg/dL
< 2 días 6,0 - 12,0 mg/dL 6,0 - 10,0 mg/dL
3-5 días 10,0 - 14,0 mg/dL 4,0 - 8,0 mg/dL
Estos valores son orientativos. Se recomienda que cada laboratorio establezca
sus propios valores de referencia.
C).BILIRRUBINA DIRECTA
1. MATERIALES:
2. REACTIVOS
Kit 1 x 250 mL. Contiene:
A. 1 x 50 mL Ác. Sulfanílico.
B. 2 x 100 mL Disolución salina.
C. 1 x 2 mL Nitrito sódico.
Preparación del reactivo Diazo: Mezclar 1 parte de la disolución C con 50 partes de la disolución A.
COMPOSICIÓN DE LOS REACTIVOS
Las concentraciones en las disoluciones reactivas son:
A. Ac. Sulfanílico. 6 mM
HCl 0,17 M
B NaCl 0,9%ª
C. Nitrito sódico. 0,4 M
Los componentes del kit almacenados a temperatura ambiente (≤ 25ºC) son estables hasta la fecha de
caducidad indicada en la etiqueta. El reactivo diazo es estable 15 días a temperatura ambiente (≤ 25ºC).
MUESTRA
Suero o plasma exento de hemólisis.
La bilirrubina sérica disminuye en un 50 % después de 1 hora a temperatura ambiente (≤ 25ºC), y expuesta
la luz solar directa. Las muestras mantenidas a 2-8ºC en la oscuridad son estables aproximadamente 3 días.
3. PROCEDIMIENTO:
3. Colocar en cada uno de ellos las cantidades que se indican en la tabla, Blanco: Agua:
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS 64 CA
4. Mezclar bien, incubar a temperatura ambiente (20-25°)

5. Leer exactamente a los 5 min.
4. RESULTADOS
CALCULOS:
Δ Abs = Abs PR - Abs
BL M Donde:
Abs. M: Absorción de la muestra
Abs BM: Absorción del blanco de muestra
Δ Abs x 12,8 = mg bilirrubina directa / dL
Unidades SI
mg / dL x 17,1 = μmol / L
Adultos: hasta 0,25 mg/dL de bilirrubina directa
Estos valores son orientativos. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de
referencia.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
65
PRACTICA N° 13
EXAMEN COMPLETO DE ORINA
I. COMPETENCIAS
1 .Conoce el procedimiento para el análisis completo de orina.

2. Evalúa los diferentes componentes del sedimento de urinario, como indicadores de posibles procesos, daño
corporal o patologías
3. Determina la importancia del examen general de orina como pruebas de apoyo para el diagnóstico de
enfermedades renales.
II. INTRODUCCIÓN
El Análisis de orina es la evaluación física, química y microscópica de la orina. Dicho análisis consta de muchos
exámenes para detectar y medir diversos compuestos que salen a través de la orina. Un examen completo consta
de varias determinaciones: un examen macroscópico, un examen físico-químico, un examen microscópico y, si
fuera necesario, un Urocultivo. El análisis físico-químico se puede efectuar mediante tiras reactivas cuyos
resultados se leen de acuerdo a los cambios de color.
Este análisis proporciona información valiosa para la detección, diagnóstico diferencial y valoración de
alteraciones nefro-urológicas, y ocasionalmente, puede revelar elementos de enfermedades sistémicas que
transcurren silentes o asintomáticas. Su interpretación data desde los albores de la medicina, y gracias al
desarrollo de técnicas bioquímicas aplicadas a la orina, la información que aporta, así como su exactitud, están en
continuo crecimiento.
INTERPRETACIÓN DEL ANÁLISIS DE ORINA
Albuminuria: también llamada proteinuria. Se utiliza para buscar enfermedades de riñón y desórdenes
del hígado, además para evaluar aspectos nutricionales, sobre todo en pacientes hospitalizados. El límite
superior de la proteinuria normal se estima en unos 10 miligramos (mg) por cada 100 mililitros (ml), o 100 mg en la
orina de 24 horas, aunque en la actualidad el límite superior con este tipo de recogida se sitúa en 200 mg. A
partir de 250 mg/24 horas se requieren exploraciones por parte del nefrólogo y del urólogo y por encima de 1 o 2
gramos (g)/24 horas hay sospechas de nefropatía importante.
Microalbuminuria: también es conocida como microproteinuria y se suele realizar una vez al año en
pacientes diabéticos o hipertensos para detectar enfermedades del riñón y cardiovasculares. El nivel mínimo se
sitúa entre 30 y 300 mg/24 horas.
Glucosuria: se trata del nivel de glucosa en orina y detecta patologías metabólicas y del hígado e
infecciones urinarias. Normalmente no existe glucosa en orina, o prácticamente no se puede detectar. Sólo
aparece cuando la glucemia rebasa el umbral de 180 mg/100 ml.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
66
Cetonuria: detecta la presencia anormal de Cetonuria y otros cuerpos cetónicos, que aparecen en caso
de cetosis, provocada por el consumo exagerado de grasas o por falta absoluta o relativa de hidratos de
carbono. Habitualmente se eliminan 125 mg/día y el límite máximo son 0,5 g/24 horas.
Coluria: también conocida como bilirrubinuria, localiza la presencia de bilirrubina en la orina. Para que la
coluria sea negativa, es decir, esté dentro de unos niveles considerados como normales, la bilirrubina en sangre
tiene que situarse por debajo de 2 mg/100 ml.
Urobilinuria: se localiza en la orina en casos en que la bilirrubina llega al intestino. Según el método los
niveles normales de urobilina en orina serán de 0,03 a 0,48 mg por día (método de Royer) o de 1 a 4 mg/día
(método de Watson). Si la Urobilinuria fuese mayor de la normal podrían aparecer problemas en el hígado o en
la sangre.
Sedimento urinario: su análisis es útil para muchos enfermos, entre ellos aquellos que tengan síntomas
renales, urológicos, infecciosos o pacientes hipertensos. Su análisis se realiza mediante microscopio, ya sea
cuantificando las cantidades por campo microscópico o por número de cruces. A través del análisis del
sedimento podemos obtener datos referentes a la citología, bacteriología, cilindros, cristales, etc. El estudio de
células en el sedimento, como los leucocitos, ofrece información de posibles problemas en el riñón y las vías
urinarias.
El estudio de los cilindros aporta información hematológica y urológica. Un aumento de cristales en el sedimento
no implica una mayor eliminación de éstos por la orina, ya que depende de otros aspectos como la concentración,
y aporta información útil acerca del riñón o las vías urinarias. En el sedimento también se pueden encontrar
gérmenes y según el tipo de bacteria que encontremos, podrá ser una señal de infección renal o urinaria.
Hematuria: analiza la presencia de glóbulos rojos o hematíes en la orina. También se analiza en el sedimento
de la orina y de la misma forma, es decir, mediante microscopio, por campo o por cruces.
Preparación de la muestra
La técnica para el análisis del sedimento urinario es como la que a continuación se describe: Colocar 10 ml de
orina en un tubo para Uroanálisis o en su defecto en un tubo de ensayo limpio, enseguida centrifugar a 3500rpm
durante 3min. Posteriormente, decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento mediante agitación mecánica
manual. Colocar una gota sobre un portaobjetos limpio extendiéndolo de manera homogénea, finalmente colocar
un cubre objetos limpio y observar al microscopio convencional.
El sedimento obtenido mediante centrifugación de la orina contiene todos aquellos materiales insolubles
(denominados también elementos formes) que se han acumulado en la orina durante el proceso de formación
(células, microorganismos, cilindros, etc.) contiene también cristales de distintas formas y tamaños dependiendo
del pH de la orina. Muchos laboratorios utilizan la microscopía de contraste de fases para la interpretación del
sedimento urinario, en especial la observación de cilindros.
IDENTIFICACIÓN DE ELEMENTOS ESPECÍFICOS EN EL SEDIMENTO

Clasificación:
1. Sedimento
organizado
Hematíes
Leucocitos
Células epiteliales: Células escamosas, Células de transición, Células renales.

MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS
Microorganismos: Bacterias, Levaduras, Protozoos, Parásitos. CA
67
Espermatozoides.
Cilindros: Hialinos, Epiteliales, Granulosos, Eritrocitarios, Leucocitarios, Céreos, Cilindroides
Sedimento no organizado
Cristales: Uratos, Ácido úrico, Fosfatos triples, Fosfatos amorfos, Carbonato cálcico, Oxalato
cálcico, Cistina, Colesterol, Tirosina, Leucina.
MATERIALES Y MÉTODOS
1.1. MATERIALES:
Microscopio compuesto y Centrifuga clínica
Tubos de ensayo de 13 x 100 mm, Portaobjetos y cubreobjetos
Pipeta Pasteur con bulbo de goma
Muestra de orina patológica y Normal.
MÉTODOS
1. Mezclar la muestra y se colocar aproximadamente 10 o 15 ml de orina en un tubo de centrifuga y
centrifugar a 2000 rpm durante 5 minutos.
2. Eliminar el sobrenadante y suspender el sedimento en la orina que queda en el tubo.
3. Realizar golpecitos en la parte inferior del tubo para mezclar el sedimento. Se coloca una gota de en un
porta objeto limpio. Se cubre con un cubreobjetos y se examina inmediatamente.
4. Cerrar parcialmente el iris del diafragma y ajustar luego el condensador hacia abajo hasta lograr el
contraste optimo: si hay demasiada luz algunas estructuras se pasaran por alto. Ajustar continuamente el
tornillo micrométrico.
5. Realizar el examen a 100X y registrar cilindros, cristales y elementos que se presenten en algunos
campos. Los cilindros tienden a moverse hacia los del cubreobjetos, por eso debe examinarse la totalidad
de su perímetro. El examen con poco aumento pueden verse cilindros, cristales y otros elementos, dando
una estimación de su número. Para los cilindros puede hacerse el promedio del número existente en 10 o
15 campos a 100X. Por ejemplo si el número de cilindros hialinos en 10 campos diferentes es de 1, 3, 2, 1,
1, 2, 2, 3, 1 y 3 entonces se informa; 1-3 cilindros hialinos por campo en poco aumento. Algunos
laboratorios prefieren dar los informes sobre cilindros, células epiteliales y demás estructuras diferentes de
leucocitos y hematíes como raros, pocos moderados, muchos y numerosos. En cuanto a los cristales
epiteliales se encuentran con elevado aumento 400X y se informa el número promedio de 10 – 15 campos.
USO DE TIRAS REACTIVAS

1. Retirar una tira reactiva, no toque las áreas de sensibilidad. Cerrar el tubo
inmediatamente protegiendo las tiras restantes contra humedad y conservando
la calidad del producto hasta la fecha de vencimiento.
2. Sumergir la tira reactiva en la orina recién recolectada por 1 segundo.
3. Eliminar el exceso de orina pasando la lateral de la tira en el borde del
recipiente.
4. Leer el resultado comparando las áreas reactivas con la escala cromática
después de 30 60 segundos.
5. Leer el resultado del área para leucocitos después de 60–120 segundos. No
considere cambios de color desarrollados tras 2 minutos.
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
68
G
Guzmán Vigo César, Alarcón Benavides Edwin, Moreno Echeandía Gustavo 2019 - 1
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
69
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
70
69
PRACTICA N° 14
DETERMINACIÓN DE ÍNDICES HEMATIMÉTRICOS
I. COMPETENCIAS
Cuantifica y evalúa los diferentes grupos celulares en una muestra de sangre.

Obtiene índices hematimétricos.
Determina la importancia clínica del diagnóstico Hematimétrico.
II. INTRODUCCIÓN
En un estudio rutinario de hematimetría se van a cuantificar y evaluar diferentes grupos celulares, los
glóbulos rojos (hematíes), los glóbulos blancos (leucocitos), las plaquetas, el contenido de hemoglobina, y
otros parámetros relacionados con su cantidad, forma y contenido. Los índices hematimétricos son los
parámetros que relacionan el índice hematocrito, la hemoglobina y el número de hematíes o glóbulos rojos.
Éstos índices son: 1. El VCM (volumen corpuscular medio), es una forma de expresar el tamaño de
los eritrocitos .El valor normal es de 80-100 fl (femtolitros por hematíe) 2. La HCM (hemoglobina
corpuscular media), corresponde al contenido de la hemoglobina en cada eritrocito (Hemoglobina/número
de hematíes). Su valor normal es de 26 a 32 picogramos y 3. La CHCM es la concentración de hemoglobina
comparado con el hematocrito. En los adultos sus valores normales son de 32 a 36 %. El l tamaño de
los glóbulos rojos (VCM) nos puede definir si una anemia es microcítica cuando el VCM es menor a lo
normal, normocítica si es normal y macrocítica si es superior a lo normal. Si el valor de la Hemoglobina
corpuscular media (HCM) es normal la anemia será normocrómica, si es bajo será una anemia hipocrómica
o hipercrómica si está elevado su valor. Los parámetros que se estudian y los valores normales se
señalan en la siguiente tabla:
PARÁMETRO VALORES NORMALES

NÚMERO DE HEMATÍES 4 – 5,5 millones/ml
HEMOGLOBINA 12 – 16 g/dl
HEMATOCRITO 37 – 52%
VCM 80 – 99 fl
HCM 27 – 32 pg
CMHC 32 – 36 g/dl
PLAQUETAS 135 – 450 miles/ml
VPM 9,6 fl
NÚMERO DE LEUCOCITOS 4,5 – 11 miles/ml
NEUTRÓFILOS 42 – 75%
LINFOCITOS 20.5 – 51.1 %
MONOCITOS 1.7 – 9.3 %
EOSINÓFILOS 0 – 1%
BASÓFILOS 0 – 0.2 %
El estudio se realiza con la finalidad de:
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
70
1. Cuantificar los hematíes puede ofrecer datos de salud o de la presencia de una anemia, enfermedades
generales, o diferentes tipos de cáncer. Como los hematíes son los encargados de transportar la
hemoglobina (proteína que porta el oxígeno a los tejidos), su disminución produce cansancio y sensación de
fatiga.
2. Concentrar hemoglobina para obtener datos complementarios sobre la posible alteración del número de
hematíes.
3. Obtener el hematocrito, que es el porcentaje de la masa del eritrocito con relación al volumen sanguíneo. Con
esos datos se puede calcular los índices hematimétricos (VCM, HCM, VMHC). La alteración de estos
parámetros nos ayudarán a orientar diferentes enfermedades que causan alteraciones en estos índices
(Ejemplo: diferentes tipos de anemias).
4. Cuantificar (recuento diferencial) glóbulos blancos (leucocitos), que son los encargados de la defensa de la
persona, por ello en cuadros de infección están aumentados, o en ciertas enfermedades están disminuidos.
También es importante saber cuáles son las poblaciones de cada tipo de leucocitos, por ello en los resultados
aparecen los neutrófilos, monocitos, linfocitos, basófilos y eosinófilos. Según los resultados de cada una de
estas poblaciones se puede orientar hacia una u otra enfermedad.
5. Cuantificar las plaquetas, que son células que tienen por función formar coágulos de sangre y ayudar a sanar
las heridas y a prevenir el sangrado; por ello si su número disminuye pueden aparecer cuadros de
hemorragias (sangrados) que puede deberse a diferentes problemas y enfermedades, y su número aumenta
en diferentes enfermedades reumáticas o autoinmunes.
MATERIALES Y MÉTODOS
1.1. Materiales:
ANTICUAGULANTES:
HEPARINA: Tiene afinidad por las proteínas, actúa como antitrombina y antitromboplastina.
SOLUCION DE HAYEM: (líquido diluyente para Hematíes). Composición: 1. Bicloruro de Hg. 0.500
g 2. Cloruro de sodio 1.000 g, 3. Sulfato de sodio 5.000 g 4. Agua destilada 200.00 ml.
SOLUCION DE TURK: (líquido diluyente para Leucocitos). Composición: 1. Ácido acético glacial
2.000 mL 2. Violeta de genciana sol acuosa 1% 1.00 mL 2. Agua destilada 100.00 mL.
MICROPIPETAS DE RANGO VARIABLE
CAMARA CUENTA GLÓBULOS: Existe numerosos modelos, los más empleados son: la de
Thoma – Zeiss, büker y la Newbauer, las características de esta última se puede ver en el grafico
siguiente.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
72
TUBOS DE HEMATOCRITO: Los más utilizados son los tubos de Wintrobe, consiste en un tubo de
vidrio de 10 cm de longitud, dividido en 100mm. También pueden utilizarse los tubos
heparinizados para determinar el microhematocrito. Este último presenta la ventaja de emplear
micromuestras de sangre, los tubos capilares tienen una longitud promedio de 75mm x 1.2 mm de
diámetro externo, los que deben leerse en una tabla de valores.
1.2. MÉTODOS
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA DE SANGRE: Las técnicas más usadas para la obtención de

muestras de sangre, son de 2 tipos:
a. Por puntura de la piel. Ésta se puede realizar en el pulpejo del dedo del adulto, talón en el
recién nacido o lóbulo de la oreja.
b. Por venopuntura.- cualquiera de las venas superficiales del cuerpo (se prefiere las venas de la
flexura del codo). La técnica que se elige para la obtención de la muestrea estará de acuerdo al
volumen de sangre que se necesita.
RECUENTO DE HEMATÍES
1. Trasladar 4 ml del líquido para dilución de eritrocitos (solución de Hayem’s) en un frasco pequeño
con la pipeta de 5 ml.
2. Con la micropipeta pipetear 20 µL (0.02 mL) de sangre venosa o capilar.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
73
3. Depositar la sangre en el frasco que contiene los 4 mL de solución diluyente y mezclar bien. La
dilución de esta sangre será de 1 x 200.
4. Rotular el frasco con el código o nombre del paciente.
5. Hacer el recuento tan pronto como sea posible. Después de realizada la dilución y si esto no es
posible debe agitarse nuevamente antes del recuento, ya que los glóbulos tienden a sedimentar.
6. Descartar las 3 primeras gotas de sangre diluida antes de llenar la cámara que debe estar
perfectamente limpia y seca. Poner en contacto una gota con el borde del cubreobjetos que se ha
colocado sobre la cámara de Neubauer, de manera que el líquido discurra por debajo, llenando la
cámara.
7. Colocar la cámara en el microscopio y localizar el mm cuadrado central con pequeño aumento,
pasando después a un aumento mayor.
8. Contar las células en los 4 campos de las esquinas y en el centro de 16 cuadrados cada uno. Incluir
en cada cuadrado las células que se encuentran sobre las líneas superior e izquierda de cada
cuadrado. Sumar los glóbulos contados en los cinco campos exigidos de 16 cuadraditos cada uno.
CALCULO
N x 400 x 10 x 200
80
Dónde:
N = Número de Hematíes en los 80 cuadraditos contados.
4,000 = Representa el producto de la superficie de cada cuadradito (1/400) por la altura (1/10).
200 = El grado de dilución.
Las dimensiones de la cámara y el grado de dilución, constituye la base del cálculo. Como cada uno de
los cuadraditos más pequeños tiene una superficie de 1/400 de mm2, de los cuales se han contado 80, la
profundidad es de 1/200; para calcular el número de hematíes por mm3.
Regla Práctica:
Contar 80 cuadraditos pequeños y agregarle 4 ceros, cuyo resultado indicará el número de glóbulos rojos
por mm3.
RECUENTO DE LEUCOCITOS
La técnica de tomar la muestra es la misma que para los hematíes, y se realiza de la siguiente manera:
1. Trasladar 950 µL (0.95 mL) del líquido para dilución de leucocitos (solución de Turk) en un frasco
pequeño con la pipeta de 1 ml o la micropipeta de 1000 µL.
2. Con la micropipeta pipetear 50 µL (0.05 mL) de sangre venosa o capilar.
3. Depositar la sangre en el frasco que contiene los 0.95 mL de solución diluyente y mezclar bien. La
dilución de esta sangre será de 1 x 20.
4. Rotular el frasco con el código o nombre del paciente.
5. Continuar igual que para el recuento de eritrocitos.
6. Colocar con ayuda de una pipeta paster una gota del liquido en la cámara y contar los leucocitos con
pequeño aumento en los 4 mm2 de las esquinas y SUMARLOS.
CALCULO
N X 10 X 20
4
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
74
Dónde:
N: número de glóbulos blancos, contados en los cuatro mm 2.
MICROHEMATOCRITO:
Llenar con sangre el tubo capilar heparinizado hasta una altura convencional que representa el 100%,
sellar el extremo inferior por donde ingresó la sangre con plastilina; luego, agitar convenientemente
empleando una pequeña barra metálica introducida en el capilar, la cual se desplaza por la fuerza de un
pequeño imán que se moviliza externamente. Centrifugar a 2,450 r.p.m. durante 20 minutos (el método
original wichselbaun recomienda centrifugar a 10,000 r.p.m. durante 4 minutos). Efectuar la lectura en la
tabla con escala milimetrada.
CONSTANTES CORPUSCULARES
Para esta determinación es necesario conocer previamente la cantidad de Hematíes por mm 3, el
Hematocrito, y la cantidad de Hemoglobina. Estas constantes corpusculares son: volumen corpuscular
medio (V. C. M), Hemoglobina corpuscular media (Hb. C. M) y concentración de Hemoglobina corpuscular
media (C. Hb. C. M).
V.C.M. Es el volumen medio correspondiente a un eritrocito, expresado en micras cúbicas.
Hto % x 10 = V. C. M. u3
Número de Hematíes
En millones
Hb. C. M. Es la cantidad media de Hemoglobina correspondiente a un eritrocito, expresado en

microgramos (uug).
Hb g % x 10 = Hb. C. M. uug
Número de Hematíes
En millones
C. Hb. C.M. Es la concentración de Hemoglobina dentro del eritrocito, expresado en %.
Hb g % x 100 = C. Hb. C. M. %
Hematocrito
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
75
PRACTICA N° 15
PRUEBAS GENERALES DE COAGULACIÓN
I. COMPETENCIAS
1. Conoce las pruebas generales de coagulación.

2. Determinar el tiempo que transcurre desde la sección de un grupo de capilares, hasta la formación
del trombo blanco plaquetario.
3. Determina en un compañero el tiempo de coagulación.
4. Compara los valores obtenidos en las pruebas generales de coagulación de sus compañeros con los
parámetros normales y emite un juicio crítico.
II. INTRODUCCIÓN
La coagulación es el resultado de una interacción coordinada de las proteínas sanguíneas, las células
circulantes, células de la vasculatura y las proteínas de la matriz extracelular en la pared de los vasos. Este
complejo mecanismo hace difícil su evaluación en el laboratorio, que sólo se limita a medir las proteínas de la
coagulación circulantes y células circulantes, mientras que los elementos vasculares no son medibles. La
Figura esquematiza la activación de la coagulación.
Didácticamente se puede dividir el mecanismo de activación de la coagulación en en tres etapas:1. La

generación de la tromboplastina o activador de la protrombina (primera fase de la coagulación sanguínea) 2.
generación de la trombina (segunda fase de la coagulación sanguínea). 3. La formación de la fibrina (tercera
fase de la coagulación sanguínea).
Actualmente se dispone de pruebas de laboratorio que evalúan diferentes vías de la coagulación: el tiempo
de sangrado, de acuerdo con la técnica de Duke, consiste en la medición de la duración de la hemorragia
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
76
producida por la punción hecha en el lóbulo de la oreja con una lanceta; normalmente dura de tres a siete
minutos. En una forma muy general permite evaluar la retracción del capilar, la cantidad y calidad de las
plaquetas; con cifras menores de plaquetas el tiempo de sangrado se prolonga, pero su mayor utilidad es
para evaluar la función de las plaquetas cuando la cifra es normal como sucede en trombastenia de
Glanzman, enfermedad de von Willebrand, uremia, uso de aspirina.
Fig. Formación del coagulo por lesion del vaso
Para evaluar la función plaquetaria es indispensable tener la cuenta plaquetaria que se obtiene con la
realización de la biometría hemática. Las técnicas automatizadas que actualmente se utilizan permiten
conocer también el volumen plaquetario medio que normalmente va de 5 a 12 fentolitros (fL). Una cuenta
normal es de 150 a 450,000/mL. La disminución de las plaquetas puede ser consecuencia de un anticuerpo
sensible a ácido etilendiaminotetracético que propicia la aglutinación de las plaquetas, conocida como
pseudotrombocitopenia.
La trombocitopenia real puede ser secundaria a aumento de su destrucción en sangre periférica, que con
frecuencia se asocia a un volumen plaquetario medio incrementado, mientras que la falta de su producción en
la médula ósea se asocia a uno disminuido. La causa más frecuente de elevación en el número de plaquetas
circulantes es la deficiencia de hierro, seguida de algunas otras causas reactivas como una infección; sin
embargo, si la trombocitosis persiste por más de 6 meses debe pensarse en la posibilidad de un trastorno
mieloproliferativo.
Estos resultados son extremadamente útiles para cualquier área de la medicina, ya que entregan una visión
al médico del estado del paciente respecto a estos procesos, fundamentales al momento de programar por
ejemplo una cirugía, o un parto normal. Además, en pacientes con diversas patologías, estos exámenes le
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
76
permiten al clínico realizar un seguimiento de los tratamientos aplicados. Las pruebas de Coagulación
contemplan los siguientes exámenes:
Tiempo de Protrombina (TP)

Tiempo Parcial de Tromboplastina Activada (TTPK o TTPA)
Tiempo de Coagulación
Tiempo de Sangría
Otros exámenes de coagulación son el Fibrinógeno, los Productos de Degradación del Fibrinógeno(PDF), el
Anticoagulante Lúpico, la Antitrombina III y los estudios completos de Trombofilia. Estos exámenes son más
específicos y no son parte de la rutina de los exámenes de coagulación.
Dentro de los análisis de rutina, los exámenes de coagulación son los más sensibles a las condiciones de
extracción de la muestra, preparación del paciente y transporte. Estas muestras se alteran fácilmente si no se
realizan los procesos pre-analíticos adecuados. De esta manera, un profesional experto en esta área, debe ser
capaz de reconocer un resultado alterado y hacer la diferencia si éste es por alguna patología o por un error
pre-analítico.
TIEMPO DE PROTROMBINA (PT): Se define como el tiempo en segundos necesario para la

formación del coágulo después de la adición de calcio y tromboplastina al plasma. El plasma debe ser
separado de las células lo más rápido posible y refrigerarlo si no es procesado inmediatamente, teniendo
en cuenta que su procesamiento debe hacerse antes de cuatro horas después de haber tomado la muestra.
Su procesamiento se puede hacer de forma manual o automatizada. Este examen es el más frecuente de
los que se realiza en estudios de coagulación. Es de extrañar que no estuviera en el protocolo de un pre-
operatorio y es además el usado en los controles de Tratamiento Anticoagulante en forma rutinaria y su
resultado normalmente requerido en el día para la toma de una conducta clínica (adecuar dosis de
anticoagulante).
TIEMPO DE SANGRÍA: El tiempo de sangría mide la interacción de las plaquetas con los vasos
sanguíneos y la posterior formación del coágulo o tapón hemostático. Mide adecuadamente la fase
vascular de la coagulación. No debe faltar en ningún estudio de coagulación, porque es un procedimiento
simple que alerta deficiencias plaquetarias, para intensificar su estudio. Se toma con una leve punción en el
antebrazo o lóbulo de la oreja (Duke, esta descontinuado, pero a veces se solicita y por esto es necesario
conocerlo), recogiendo las gotas de sangre en un papel de filtro hasta que espontáneamente cesan. Se mide
el tiempo que transcurre entre la aparición de la primera gota de sangre y la última. El método de Ivy es el
más utilizado hoy en día y sus valores normales van de 3 a 11 minutos. En la Toma de Muestra es
fundamental saber si el paciente estuvo ingiriendo fármacos anticoagulantes (ejemplo aspirina) o
antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo ibuprofeno, naproxeno).
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
78
MATERIAL Y MÉTODOS
Materiales:
Reloj con segundero o cronómetro.
Papel de filtro o secante.
Lancetas estériles.
Algodón.
Alcohol al 70%.
Tubos de ensayo.
Jeringas con aguja No 21 – 24
Baño maría.
Cronómetro
Procedimiento:
Toma de Muestra:
1. Se utiliza sangre venosa

2. Los anticoagulantes son sustancias que previenen la formación de coágulos. Existen diferentes
tipos de ellos en polvo o líquidos. Debe seleccionarse siempre el anticoagulante apropiado según el
estudio que se quiera realizar. Las pruebas de coagulación se deben tomar en tubos con
anticoagulante citrato, de tapa celeste. Los resultados de coagulación se ven fuertemente afectados
por una mala relación sangre/anticoagulante, por lo que se debe tener especial cuidado al momento
de llenar estos tubos.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
79
3. Las muestras destinadas a la coagulación deben ser tomadas en segundo lugar, después de los
tubos sin anticoagulante, si se utiliza sistema al vacío. Esto obedece a minimizar las
contaminaciones con tromboplastina tisular (una proteína involucrada en el proceso de la
coagulación).
4. Se debe cuidar de homogenizar completamente la muestra con el anticoagulante a fin de evitar la
formación de pequeños coágulos que dañarían la calidad de la muestra.
5. Es recomendable tomar estas muestras con ayuno de 8 horas, si bien con tres horas de ayuno
también es permitido. Esto a fin de evitar un plasma lipémico que interfiera con el análisis.
Tiempo de Sangría: MÉTODO DE DUKE
Con una lanceta hacer un corte pequeño en el lóbulo de la oreja. La sangre sale por este corte y se
mide el tiempo que transcurre hasta que se detiene el sangrado. El corte no debe ser hecho sobre
venas visibles, ni en lesiones de piel.
Este examen se usa para los siguientes casos.

a. Para diagnósticas enfermedades hemorrágicas.
b. Antes de realizar operaciones quirúrgicas.
c. Antes de realizar una punción en el hígado o el bazo.
Método:
1. Limpiar con suavidad el lóbulo de la oreja utilizando una

pieza de algodón con alcohol al 70%. No frotar. Dejar secar.
2. Hacer un pequeño corte de 3 mm de profundidad con la

lanceta, en el borde inferior del lóbulo de la oreja. A la vez,
poner a funcionar el cronómetro.
3. Dejar que la sangre salga libremente. No exprimir el lóbulo de

la oreja. Recoger la primera gota en una esquina del papel de
filtro. No tacar la piel con el papel.
4. Esperar 30 segundos y recoger la segunda gota de sangre

en el papel secante, pero un poco más delante de la primera
gota.
5. Recoger las siguientes gotas de sangre una cada 30 segundos.

Las gotas serán cada vez más pequeñas. Cuando las gotas
dejen de salir y el papel de filtro ya no absorba sangre, detener
el funcionamiento del reloj o del cronómetro.
6. Anotar el tiempo transcurrido, según el cronómetro. También

se pueden contar el número de gotas recogidas en el papel
de filtro y multiplicarla por 30 segundos.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
80
Ejemplo: Si se han recogido 7 gotas. El tiempo de sangrado es de 7x30 segundos = 210 segundos,
convertidos en minutos es 3.5 minutos.
Resultados:
El tiempo de sangría normal aplicando el método de Duke es de 1 – 5 minutos.
Comunicar el resultado indicando el valor normal que corresponde al método usado (método de
Duke).
Si el tiempo se prolonga el paciente requiero un estudio de plaquetas.
Tiempo de Coagulación de la sangre completa: MÉTODO DE LEE Y WHITE
 Este examen es útil para evaluar la eficacia del mecanismo de coagulación.

 Su utilidad es limitada, pues detecta deficiencias graves de la coagulación y no detecta las
deficiencias leves de la coagulación.
 Se requiere de sangre venosa en un tupo de ensayo. Se toma nota del tiempo que requiere la
sangre para coagularse. El coágulo formado es una masa sólida de color sangre.
Materiales:
Dos tubos de ensayo de 75 x 10 mm, marcados para el nivel de 1 mL.
Un cronómetro.
Un baño maría a 37 oC.
Jeringa de 5 mL descartable, estéril.
Algodón no absorbente.
Alcohol al 70%.
Método:
1. Obtener sangre venosa por punción. Poner a funcionar el cronómetro
tan pronto como la sangre empiece a entrar en la jeringa, extraer 2,5
mL.
2. Llenar con esta sangre cada uno de los dos tubos de ensayo
hasta la marca de 1 mL. Taponar ambos tubos con algodón no
absorbente.
3. Colocar los tubos en baño maría a 37 oC. después de 3 minutos

sacar el primer tubo del baño maría. Inclinar el tubo hasta un
plano de 45º para observar si la sangre se ha coagulado. Realizar
lo mismo con el segundo tubo.
4. Si la sangre no ha coagulado, colocar los tubos otra vez en el

baño maría y examinarlos cada 30 segundos hasta que se
observe la formación del coágulo. La formación del coagulo
corresponde al momento en el que resulta posible invertir cada
tubo sin que se derrame su contenido.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
81
ATENCIÓN: Al observar la formación del coágulo, detener el cronómetro y anotar separadamente
el tiempo de coagulación requerido para cada tubo.
Resultados:
El resultado definitivo del tiempo de coagulación es el promedio de los dos resultados.
Ejemplo: el primer tubo necesitó 5 minutos, el segundo tubo necesitó 7 minutos. El resultados
final es el promedio de ambos resultados:
(5 + 7) / 2 = 6 minutos
Las cifras normales para el método de Lee y White son de 5 – 12 minutos.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
82
81
PRACTICA N° 16
EVALUACION DEL ESTADO NUTRICIONAL
I. COMPETENCIAS
1. Identificar medidas antropométricas más usadas en la evaluación del estado nutricional (peso, talla,
circunferencia braquial, etc).
2. Medir, evaluar y analizar datos antropométricos, relacionándolos con el crecimiento físico, la nutrición y la
salud.
3. Utilizar correctamente los instrumentos disponibles, estándares de referencia, sistemas de guía y métodos
para la evaluación de la composición corporal
4. Describir la importancia de la evaluación nutricional y del monitoreo del crecimiento del adulto
II. INTRODUCCION
La evaluación del estado nutricional constituye una actividad prioritaria en la atención individual de la salud, a nivel
colectivo o poblacional. Nos permite proponer políticas, guiar programas, intervenciones, acciones educativas y
modificarlas de ser necesario, a fin de lograr una correcta atención y utilización efectiva de los recursos.
La evaluación del estado nutricional puede realizarse a través de estudios transversales (en un momento
determinado), longitudinales o de sistemas de vigilancia. Para ello, puede utilizarse métodos indirectos, directos o
ambos. Los métodos indirectos más comunes incluyen el uso de indicadores socioeconómicos, de disponibilidad y
consumo de alimentos. Estos métodos generalmente requieren de personal especializado, tiempo y representatividad
de muestras, lo que los hace costosos. Dentro de los métodos directos se encuentran los indicadores
antropométricos, bioquímicos y la evaluación clínica. Los indicadores bioquímicos son utilizados para medir
deficiencias específicas de nutrientes; se realizan a través de submuestras y por lo general son costosos; mientras
que los métodos clínicos sólo son útiles cuando se ha manifestado la enfermedad. Por el contrario, los estudios
antropométricos son los utilizados con mayor frecuencia en los servicios de salud y comunidad; son fáciles de
obtener, de muy bajo costo y muy útiles.
Las medidas antropométricas más usadas en la evaluación del estado nutricional son: el peso, la talla, la
circunferencia braquial y los pliegues cutáneos. Los valores de estas medidas no tienen significado por si solos, a
menos que se relacionen con la edad, entre ellos u otros diámetros. Cuando se establecen relaciones entre ellos se
llaman índices. Los índices más usados son el peso para la edad P(E), la talla para la edad T(E) y el peso para la talla
P(T).
DETERMINACIÓN DE LA VALORACIÓN NUTRICIONAL ANTROPOMÉTRICA
La antropometría evalúa el tamaño corporal y la proporción entre talla y peso. Igualmente, permite estimar de forma
indirecta los distintos compartimentos corporales (agua, masa magra y masa grasa).
Cambios en el peso y en las circunferencias de la cintura y de la cadera, entre otros, son indicadores de variaciones
en el estado nutricional, que pueden valorarse por comparación con los valores previos o con los intervalos de
normalidad obtenidos en estudios poblacionales.
Las medidas antropométricas son fáciles de obtener, aunque su fiabilidad depende del grado de entrenamiento de
quién toma la medida, requieren un instrumental sencillo (balanza, calibrador de pliegues cutáneos, cinta métrica
flexible, tallímetro) y su costo es bajo.
La principal causa de error en la determinación e interpretación de los parámetros antropométricos se debe a la falta
de precisión, pues los valores obtenidos dependen mucho de quién, cómo y donde se miden. La hidratación, el tono
muscular y la edad también influyen.
CLASIFICACIÓN DE LA VALORACIÓN NUTRICIONAL SEGÚN IMC
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
83
La clasificación de la valoración nutricional antropométrica se debe realizar con el índice de masa corporal (IMC). En
ese sentido, los valores obtenidos de la toma de peso y medición de la talla serán utilizados para calcular el IMC a
través de la siguiente fórmula: IMC = Peso (kg)/(talla (m)² , y el resultado deberá ser comparado con el Cuadro 1 de
clasificación del estado nutricional según IMC.
Clasificación de la valoración nutricional de las personas adultas mayores según índice

de masa corporal (IMC)
Fuente: Organización Panamericana de la Salud (OPS). Guía Clínica para Atención Primaria a las Personas Adultas Mayores. Módu lo 5.
Valoración Nutricional del Adulto Mayor. Washington, DC 2002.
La clasificación de la valoración nutricional con el IMC es referencial en esta etapa de vida, debido a que las
modificaciones corporales que ocurren durante el proceso de envejecimiento, afectan las medidas antropométricas
como el peso y la talla requiriendo que la persona adulta mayor sea evaluada de manera integral.
INTERPRETACIÓN DE LOS VALORES DE ÍNDICE DE MASA CORPORAL (IMC):
IMC ≤ 23,0 (delgadez)
Las personas adultas mayores con un IMC ≤ 23,0 son clasificadas con valoración nutricional de “delgadez”, que es una
malnutrición por déficit, y puede estar asociado a diferentes problemas, tales como: psíquicos (depresión, trastornos de memoria
o confusión, manía, alcoholismo, tabaquismo), sensoriales (disminución del sentido del gusto, visión, auditivo), físicos
(movilidad, astenia), sociales (soledad, malos hábitos dietéticos, maltrato), bucales (falta de piezas dentarias), digestivos
(malabsorción), hipercatabólicas (cáncer, diabetes), entre otras.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
84
IMC > 23 a < 28 (normal)
Las personas adultas mayores con un IMC de > 23 a < 28, son clasificadas con valoración nutricional “normal”, y es el
IMC que debe tener y mantener esta población, de manera constante.
IMC ≥ 28 a < 32 (sobrepeso)
Las personas adultas mayores con un IMC de ≥ 28 a < 32, son clasificadas con valoración nutricional de “sobrepeso”,
que es una malnutrición por exceso, caracterizado por la ingesta elevada de calorías, malos hábitos alimentarios,
escasa actividad física, entre otros.
IMC ≥ 32 (obesidad)
Las personas adultas mayores con un IMC ≥ 32, son clasificadas con valoración nutricional de “obesidad”, que es una
malnutrición por exceso, e indica un mayor riesgo de sufrir de enfermedades cerebrovasculares, enfermedades
cardiovasculares, cáncer de mamas, diabetes mellitus tipo 2 no insulinodependiente, enfermedad por reflujo
gastroesofágico, osteoartrosis, y pérdida de la movilidad.
VALORACIÓN DE COMPARTIMIENTO PROTEICO
Constituye el 15-20% del peso corporal total y está representado por las proteínas corporales, tanto estructurales
como funcionales.
a) Compartimento proteico somático
Las proteínas musculares se determinan por índices indirectos:
1. Peso corporal
Refleja la masa muscular, dado que ésta representa alrededor del 20% de ese peso.
2. Excreción urinaria de creatinina (Índice creatinina-altura = ICA)
La producción endógena y la excreción de creatinina reflejan indirectamente la masa muscular corporal total, ya que
alrededor del 2% del fosfato de creatina del músculo se transforma diariamente a creatinina.
Resulta de comparar la excreción de creatinina de un paciente con la atribuída a otro sujeto de altura semejante y
peso ideal (ICA % = excreción actual / excreción ideal de creatinina x 100) (Tabla )
b) Compartimento proteico visceral
Representado por la concentración plasmática de las proteínas circulantes (fundamentalmente por las proteínas de
síntesis hepática: albúmina, transferrina, proteína ligadora de retinol y prealbúmina).
Limitaciones: Los niveles séricos de las proteínas de síntesis hepática dependen no sólo de una nutrición proteica
adecuada, sino también de la capacidad de síntesis hepática, del índice de aprovechamiento metabólico, del estado
de hidratación y de la excreción.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
85
Albúmina
Su medición es el parámetro tradicional de valoración del compartimiento proteico visceral. El hígado es su único
lugar de síntesis.
Interpretación:
Normalidad: 3,5-4,5 g/dl
Malnutrición leve: 2,8-3,4 g/dl
M. moderada: 2,1-2,7 g/dl
M. grave: < 2,1 g/dl
Limitaciones:
Pool intravascular del 40%
Vida media prolongada: 20 días
Cambios de decúbito a bipedestación ↑ el pool intravascular (hasta el 16%)
Niveles ↓ en hepatopatías, edema idiopático, síndrome nefrótico, hipotiroidismo, enteropatía pierdeproteínas,
quemaduras térmicas
Niveles ↑ en transfusiones (sangre y plasma).
Transferrina
El hígado es el principal lugar de síntesis, y la regula por medio de la ferritina presente en el hepatocito.
Interpretación:
Normalidad: 220-350 mg/dl
M. proteica leve: 150-200 mg/dl
M. P. moderada: 100-150 mg/dl
M. P. grave: < 100 mg/dl
Limitaciones:
Vida media: 8-10 días
Niveles ↓ en procesos agudos, anemia perniciosa, anemia de procesos crónicos, hepatopatía, sobrecarga de hierro,
síndrome nefrótico, enteropatía pierde-proteínas, terapia con esteroides Niveles ↑ en hipoxia, embarazo, tratamiento
con estrógenos o anovulatorios, deficiencia de hierro
Proteína fijadora del retinol (PFR)
Síntesis hepática. Vida media corta (10-12 horas), por lo que rápidamente refleja alteraciones de la síntesis proteica
hepática. Niveles normales en adultos de 3-6 mg/dl.
Interpretación:
M. proteica: < 3 mg/dl.
Limitaciones:
↓ brusco en estrés metabólico agudo
Se filtra y metaboliza en riñón (no es válido en insuficiencia renal)
Prealbúmina
Síntesis hepática. Vida media corta de 2-3 días. Valores normales: 20-50 mg/dl.
Interpretación:
M. proteica: < 20 mg/dl
Limitaciones:
↓ brusco en estrés metabólico agudo
Se afecta más por la restricción energética que por la proteica
VALORACIÓN DEL COMPARTIMIENTO GRASO
El tejido adiposo constituye, en el sujeto con normopeso, alrededor de un 25% del peso corporal total. Las reservas
grasas pueden ser estimadas por el peso corporal y mediante la cuantificación de la grasa subcutánea.
a) Grasa subcutánea
Su medida es una estimación fiable del compartimiento graso, ya que el 50% del tejido adiposo se encuentra en el
espacio subcutáneo. Las mediciones del pliegue tricipital han sido las más utilizadas, pero las mediciones en más de
un lugar proporcionan una valoración más precisa del volumen de este compartimiento.
Pliegues utilizados: tricipital, subescapular, suprailíaco, abdominal, bicipital. Las más utilizadas son las dos primeras.
Pliegue tricipital
Se realiza aplicando un calibrador regulado a presión durante 3 segundos en el punto medio entre acromion y
olécranon del brazo no dominante, pellizcando piel y tejido celular subcutáneo, repitiendo la operación 3 veces y
anotando la media de las 3 determinaciones. Se compara con referencias poblacionales.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
86
85
Pliegue subescapular
Se realiza aplicando el calibrador 1 cm por debajo de la punta de la escápula derecha, con el paciente en
sedestación, promediando 3 determinaciones y comparando con referencias poblacionales.
M. calórica leve o moderada: si < p25 y grave si < p10. Requiere la no existencia de enfermedades cutáneas ni
edema, así como cierta experiencia del investigador.
b) Grasa corporal total (GCT)
Se puede calcular conociendo los pliegues tricipital (PT) y subescapular (PS).
c) Porcentaje de grasa corporal (% GC)

GCT/Peso actual X 100. Según la ecuación de Siri:
siendo C para el varón de 1,1143 y para la mujer de 1,1278; y M para el varón de 0,0618 y para la mujer de 0,0775.
M. calórica leve o moderada: si % GC es < Percentil 25 y grave si < P 10 .
La impedancia bioeléctrica (bi o tetrapolar, esta última la preferible), es útil en la valoración del contenido total de
grasa corporal, pero no del patrón de distribución, y del resto de compartimentos, y siempre en sujetos con IMC entre
17 y 35.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
87
86
III. MATERIAL Y MÉTODOS

MATERIAL
Calibrador (Personal body fat tester)
El Personal Body Fat Tester (PBFT) Fig. , es un calibrador de muy bajo costo para la medición del porcentaje de
grasa corporal es ligero y fácil de usar. Este es un calibrador muy básico, aunque sorprendentemente da medidas
bastante repetibles y precisas cuando se usa correctamente. Su pequeño tamaño ligero lo hace adecuado para tomar
sus propias medidas de pliegue cutáneo en la privacidad del hogar, y con gráficos proporcionados se puede
fácilmente convertir las medidas en porcentaje de grasa corporal.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
88
87
MÉTODO
A. Determinación de Parámetros antropométricos y composición corporal
1. Registro de la talla: se determina con la persona descalza, de espaldas al vástago vertical del tallímetro, con
los brazos relajados y la cabeza en una posición de forma que el meato auditivo y el borde inferior de la órbita de los
ojos estén en un plano horizontal.
2. Registro del peso: El peso es un buen parámetro de evaluación del estado nutricional individual. Se debe
medir, preferiblemente, con una balanza digital calibrada, con el sujeto de pie, apoyado de forma equilibrada en
ambos pies, con el mínimo de ropa posible o con bata clínica, después de evacuar la vejiga y el recto. Hay que
distinguir entre: 1. Peso habitual: es el que usualmente tiene el individuo. 2. Peso actual: es el que se determina
en el momento de realizar la valoración. Peso ideal: se obtiene a partir de la talla y la complexión en tablas de
referencia. Se dispone de distintas tablas que pueden ser visitadas en :
http://www.healthchecksystems.com/heightweightchart.htm.,
http://www.lifeinsurancerecommendations.com/policy-review/height-and-weight-chart/ ,
http://www.who.int/childgrowth/standards/weight_for_height/en/. También puede calcularse con alguna de las
numerosas ecuaciones que se han propuesto con dicho fin.
3. Determinación del IMC: A partir del peso (kg) y de la talla (m). calcular el IMC o índice de Quetelet,
mediante la siguiente fórmula: IMC = Peso (kg) / Talla2 (m)
4. Circunferencia de la cintura: Valores de más de 88 cm en la mujer y 102 cm en el hombre, están
asociados con un riesgo sustancialmente aumentado de complicaciones metabólicas.
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
89
88
5. Registro del del Pliegue cutáneo suprailiaco

Este pliegue cutáneo es medido justo arriba de la cresta ilíaca en la linea midaxilar. El eje longitudinal sigue las líneas
naturales de desdoblamiento de la piel (lineas topológicas llamadas líneas de Langer) y corre diagonalmente. El
sujeto debe permanecer recto de pié con los pies juntos y los brazos colgando a los lados, aunque el brazo puede
estar separado del cuerpo y flexionado ligeramente para mejorar el acceso al sitio. La persona que realiza la medición
debe sujetar el pliegue cutáneo a 1 cm posterior de la linea midaxilar y medir el pliegue sobre dicha línea.
Seguir los pasos que a continuación se grafican:
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
90
89
Paso 1 El sitio a utilizar para la medición es el pliegue cutáneo suprailíaco (aproximadamente una pulgada por encima
del hueso de la cadera derecho, vea la figura 1).
Paso 2 Mientras está de pie, pellizque firmemente el pliegue suprailíaco entre el pulgar y el índice izquierdo, ver las
figuras 2 y 3. Coloque las pinzas BFT sobre el pliegue cutáneo mientras continúa sosteniendo el pliegue cutáneo con
la mano izquierda, ver la figura 4 .
Paso 3 Presione con el pulgar indicado en el BFT hasta que sienta un ligero clic. La parte deslizante se detendrá
automáticamente en la medida correcta, ver la figura 5. Después de leer la medición, regresar la parte deslizante a la
posición de inicio de la derecha. Repita tres veces y utilice el promedio como medida. Consulte la tabla de
interpretación de grasa corporal para determinar el porcentaje de grasa corporal y su significado.
6. Registro del pliegue Tricipital
Debido a su accesibilidad, el tríceps es el sitio más comúnmente medido. El sitio de pliegue cutáneo del tríceps
(tricipital) está en la cara posterior del brazo, sobre el músculo tríceps, a medio camino entre la proyección lateral del
proceso acromión de la escápula y el margen inferior del proceso olécranon del cúbito. Estas marcas óseas son
fácilmente distinguibles. El punto medio entre los procesos acromión y olécranon debe ser marcado a lo largo del lado
lateral (exterior) del brazo con el codo flexionado a 90 grados. El brazo del sujeto debe luego colgar suelto hacia un
lado, con la palma dirigida anteriormente para determinar apropiadamente la línea media posterior.
El sitio de pliegue cutáneo debe ser marcado a lo largo de la linea media posterior del brazo al mismo nivel del punto
medio marcado previamente. La persona que realiza la medición deberá colocarse detrás del sujeto, sosteniendo el
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
91
pliegue con la mano izquierda a 1 cm proximal del sitio del pliegue. Las puntas del plicómetro deberán estar a 1 cm
del pulgar y el índice, perpendicular al eje longitudinal del pliegue.
6. Registro del pliegue Bicipital

El pliegue cutáneo bicipital es un pliegue vertical en el aspecto anterior del brazo, sobre la loma del músculo bíceps,
directamente opuesto al sitio de pliegue tricipital.
7. Registro del pliegue subescapular

El sitio subescapular está a 1 cm por debajo del ángulo inferior de la escápula. El eje longitudinal del pliegue cutáneo
está en un ángulo de 45 grados directamente abajo y hacia el lado derecho (en las mediciones en el lado derecho del
cuerpo, y a la inversa en las mediciones del largo izquierdo del cuerpo). El sitio puede ser localizado buscando
suavemente el ángulo inferior de la escápula o haciendo que el sujeto coloque su brazo por detrás de la espalda.
La medición se realiza con el sujeto de pié, con ambos brazos relajados a los lados. La piel es sujetada 1 cm por
arriba y medial al sitio de medición a lo largo del eje.
IV.RESULTADOS
V: CONCLUSIONES
VI.BIBLIOGRAFÍA
G
MANUAL DE BIOQUÍMI
PRÁCTICAS CA
92
BIBLIOGRAFÍA
1. Aguilar L, Contreras M, Del Canto J, Vílchez W. Guía técnica para la valoración nutricional antropométrica de la
persona adulta mayor. Lima: Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2013.
2. Althof Klinder Heintz; Sedimento Urinario; 6ª.ed; ed. Médica Panamericana; México 2003.
3. Anderson, Shauna C, Susan Cockayne; Química Clínica; 1ª ed; trad. Ma.Teresa Aguilar; ed. Interamericana-
McGraw-Hill; México, 1995.
4. Bayern. Manual de usuario Rapidchem 744/754.
5. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L. Bioquímica. 6ta. Edic. Edit. Reverté, S. A. Barcelona (España). 2011
6. Caballero E., de Cooper J., Gilkes E. Laboratorio Clínico, Manual de Flebotomía. Madrid, C.S.C.; disponible
en: www.ilustrados.com/documentos/manualflebotomia.doc.
7. Campbell MK, Farrell SO. Bioquímica. 6ta Edic. Edit. CENGAGE Learning. México (México). 2009.
8. Examen de sangre. Internet:http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/esp_imagepages/100 htm.
9. Fabiani F. Información y consejos para reducir el riesgo cardiovascular. ¿Qué son los triglicéridos?. Sociedad
Española de Arteriosclerosis. Disponible en: http://www.se-arteriosclerosis.org/assets/54.pdf
10. Flaschka H.A. Química Analítica Cuantitativa; 9ª.ed; trad. Antonio Eroles Gómez; ed. Continental S.A. de C.V;
México 1984.
11. Gaw A, Murphy M, Srivastava R, Cowan R, O´Reilly D. Bioquímica Clínica. 5ta. Edic. Edit. ELSEVIER.
Barcelona (España). 2015.
12. González J.M., Arilla E., Rodríguez-Segada M., Sanchez Pozo A; Bioquímica Clínica; 1ª ed; ed. McGraw-Hill;
México, 1998.
13. Graff Sister. Análisis de Orina, Atlas a color; 1ª ed; trad. Pablo Rubén Koval; ed. Médica Panamericana S.A;
México 1983.
14. Hyunsu Lee, Sang-Hoon Lee, Sung-Jin Kim, Woo-Ik Choi, Jae-Ho Lee, and In-Jang Choi. Variations of the
cubital superficial vein investigated by using the intravenous illuminator. Anat Cell Biol. 2015 Mar;48(1):62-65.
15. Kaolan A., Pesce A.Química Clínica Teoría, análisis y correlación; 3ª ed; trad. Tania Carreón Valencia; ed.
Javier Ortega Ceseña; México 1996.
16. López-Santiago N. Pruebas de coagulación. Coagulation tests. Acta Pediatr Mex. 2016 jul;37(4):241-245.
17. Mesejo A, Martínez J. Martínez C. Manual Básico de Nutrición Cclínica y Dietética. Cap I. Valoración del
estado nutricional. 2ª Edición. Hospital Clínico Universitario de Valencia, 2012. Disponible en:
http://www.bartolomebeltran.com/actualidad/archivos/ManualNutricion.pdf
18. Morán Luis; Obtención de muestras sanguíneas de Calidad analítica; 1ª ed; ed. Médica Panamericana S.A. de
C.V; México D.F. 2001.
19. OMS. Módulos de vaoración clínica Parte I. Módulo 5. Valoración nutricional del adulto mayor. OPS. Oficina
Regional de la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. Disponible en:
http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/gericuba/modulo5.pdf
20. Presidencia de La República; CGEA, Guía técnica para la elaboración de manuales de procedimientos;
Colección guías técnicas, serie organización y métodos núm. 9.
21. Reactivos para diagnostico clínico, Quimica Clínica Aplicada. Disponible en:https://www.qca.es
22. Terrés Speziale Arturo M; Clínica y Laboratorio: Ciencia y Tecnología; 2ªed; ed. Graphimedic S.A. de C.V;
México 2002.
23. Tresler K. Laboratorio clínico y pruebas de diagnóstico; 3ª ed; trad. Dr. Jorge Mérigo; ed. El manual moderno;
México, D.F, 1998.
24. Velázquez R. Manual de Prácticas de Bioquímica Clínica. Universidad Nacional Autónoma de México.
Facultad de Química. D.F. 2009.
25. Whitehead T.P.; Manual, Principios de Control de Calidad (Lab/76.1); Organización Mundial de la Salud;
Química Clínica 1984.
G

Manual de Bioquímica 2019-1

Caricato da

Informazioni sul documento

Copyright

Formati disponibili

Condividi questo documento

Condividi o incorpora il documento

Opzioni di condivisione

Hai trovato utile questo documento?

Questo contenuto è inappropriato?

Copyright:

Formati disponibili

Manual de Bioquímica 2019-1

Caricato da

Copyright:

Formati disponibili

2019 - 1

DATOS DEL ESTUDIANTE

 CÓDIGO DE ESTUDIANTE: APODERADO:

 Correo crece: @crece.uss.edu.pe

 SEMESTRE ACADÉMICO: CICLO y SECCIÓN:

 TURNO DE PRÁCTICA: No DE MESA:

NORMAS, RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO

PRÁCTICA No 1: BIOSEGURIDAD Y MANEJO DE EQUIPOS E INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN

PRÁCTICA No 3: OBTENCIÓN DE MUESTRAS DE SANGRE Y MANEJO DE SUERO Y PLASMA 20

PRÁCTICA No 4: METABOLISMO DE CARBOHIDRATOS: DETERMINACIÓN DE GLICEMIA 27

PRÁCTICA No 5: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE COLESTEROL LÍQUIDO 31

PRÁCTICA No 6: DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE TRIGLICÉRIDOS 34

PRÁCTICA No 7: DETERMINACION CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS TOTALES 38

PRÁCTICA No 8: DETERMINACIÓN DE AMILASA LÍQUIDA 43

PRACTICA N⁰ 9: DETERMINACIÓN DE CALCIO 47

PRÁCTICA No 10: DETERMINACIÓN DE FOSFATASA ALCALINA 50

PRÁCTICA No 11: DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS AST /ALT 54

PRÁCTICA No 12: DETERMINACIÓN DE CREATININA Y BILIRRUBINA TOTAL Y DIRECTA 58

PRÁCTICA No 13: EXAMEN COMPLETO DE ORINA 65

PRÁCTICA No 14: DETERMINACIÓN DE ÍNDICES HEMATIMÉTRICOS 70

PRÁCTICA No 15: PRUEBAS GENERALES DE COAGULACIÓN 75

PRÁCTICA N° 16: EVALUACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONAL 82

NORMAS, RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES PARA EL TRABAJO EN EL

II. NORMAS DE UTILIZACIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS

1. Antes de utilizar un compuesto químico, asegurarse de que es el que se necesita.

III. NORMAS DE UTILIZACIÓN DEL MATERIAL DE VIDRIO

Se define como bioseguridad al conjunto de combinaciones específicas (normas) de trabajo, equipo de

Los objetivos de estas normas son:

TIPOS DE ÁREAS DE TRABAJO:

1. Área contaminada.- Área donde se manipulan microorganismos de riesgo. Ejemplo: Laboratorios

MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPOS DE RIESGO

Grupo de riesgo Microorganismo infectante

Agrupa microorganismos que pueden - Brucella - Paracoccidiodis

Agrupa microorganismos que - Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

2. DE ADVERTENCIA: Triangulares, con pictogramas de color negro y fondo amarillo o naranja.

3. DE SEGURIDAD: Rectangulares o cuadrangulares, con pictogramas de color blanco y fondo verde.

4. DE OBLIGATORIEDAD: Circulares y con pictogramas de color blanco con fondo azul.

GESTIÓN EN MANEJO DE RESIDUOS

2. Clasificación de los Residuos según su

Peligrosidad: Clase A: Residuos

Clase C: Residuos Comunes: Similares a los domésticos. Incluye a los generados en

3. Manejo de Residuos Sólidos:

MANEJO DE EQUIPOS E INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN BIOQUÍMICA

El Espectrofotómetro es un instrumento para medir la trasmitancia o absorbancia de una muestra, en función

Fig 1. Espectrofotómetro UNICO S2100UV

Fig. 2 Micropipeta mostrando sus partes

Fig. 3 Centrífuga digital

a .Centrifugación analítica: Mide propiedades físicas de partículas que sedimentan (coeficiente de

b. Centrifugación preparativa: Aisla partículas, células o moléculas.

Según el medio en el que se centrifuga y la forma como se aplica:

a. Centrifugación diferencial (frontera móvil): el comportamiento de cada componente de la muestra depende de

c. Centrifugación isopícnica o de equilibrio de sedimentación: Se utiliza una gradiente de densidad, pero el

Fig. 4a Baño Maria

Fig.4b. Partes del Baño Maria

1. Explica las bases teóricas del uso y funcionamiento de un espectrofotómetro.

El fundamento de la espectrofotometría se debe a la capacidad de las moléculas para absorber radiaciones,

Longitud de Onda -  Color Color

Transmitancia y Absorbancia: Cuando un rayo de luz de una

A = log I/Io = ε·c·l

La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración – a mayor número de

Fig. 6 SISTEMA INTERNO DEL EXPECTROFOTÓMETRO

1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.

III. MATERIAL Y MÉTODOS

3.2 Determinación de los espectros de absorción: