LABORATORIO DE

BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA
MOLECULAR I
Grado en Bioquímica – 2º Curso

Curso 2019-2020
Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, UCM
Contenido
BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EXPERIMENTAL EN EL LABORATORIO DE
BIOQUÍMICA  
1.1. EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA ............................................................................ 1 
1.1.1. Seguridad. Normas básicas de funcionamiento del laboratorio ............................... 1 
1.1.2. El cuaderno de laboratorio ....................................................................................... 2 
1.1.3. El laboratorio de Bioquímica .................................................................................... 3 
1.1.4. Operaciones básicas (I): pesada y medida de volumen........................................... 5 
EXPERIMENTO 1.1 Reconocimiento del material y equipo del laboratorio ...................... 7 
EXPERIMENTO 1.2 Comprobación de la exactitud y la precisión de las pipetas ............ 7 

1.2. PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES. IMPORTANCIA DEL pH .............................. 10 

1.2.1. Disoluciones y medios fisiológicos. ........................................................................ 10 
1.2.2. Importancia del pH. Disoluciones tampón. ............................................................. 10 
1.2.3. Operaciones básicas (II) ........................................................................................ 12 
EXPERIMENTO 2.1 Preparación de una disolución tampón ......................................... 14 
EXPERIMENTO 2.2 Comprobación de la capacidad de tamponamiento ...................... 14 
EXPERIMENTO 2.3 Titulación de un aminoácido ......................................................... 15 

1.3. DILUCIONES Y CURVAS DE CALIBRADO. ................................................................ 19 

1.3.1. Realización de medidas en el laboratorio. Expresión numérica del resultado. ...... 19 
1.3.2. Presentación de datos: Tablas y Figuras ............................................................... 20 
1.3.3. Operaciones básicas (III) ....................................................................................... 21 
EXPERIMENTO 3.1 Preparación de diluciones a partir de una disolución concentrada 24 
EXPERIMENTO 3.2 Preparación de diluciones seriadas ............................................... 24 
EXPERIMENTO 3.3 Cuantificación de la concentración de hemoglobina en muestras
problema empleando una curva de calibrado ................................ 25 

1.4. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS ..... 27 

1.4.1. Espectrofotometría ................................................................................................. 27 
1.4.2. Aplicaciones de la espectrofotometría UV-VIS ...................................................... 28 
1.4.3. Determinación cuantitativa de la concentración de proteínas ................................ 30 
EXPERIMENTO 4.1 Determinación de la concentración de proteínas de una muestra
mediante el método de Lowry ........................................................ 32 
EXPERIMENTO 4.2 Determinación de la concentración de la disolución de BSA ......... 34 

1.5. MUESTRAS BIOLÓGICAS........................................................................................... 36 

1.5.1. Obtención, manejo y conservación de muestras biológicas................................... 36 
1.5.2. Técnicas para la preparación de muestras biológicas ........................................... 37 
EXPERIMENTO 5.1 Precipitación fraccionada de proteínas con sulfato amónico ......... 39 
EXPERIMENTO 5.2 Diálisis de una mezcla de colorantes ............................................. 41 
EXPERIMENTO 5.3 Liofilización de una muestra proteica ............................................. 41 

BLOQUE 2: TÉCNICAS BÁSICAS EN EL ESTUDIO DE MACROMOLÉCULAS 

2.1. DETERMINACIÓN DE LA MASA MOLECULAR DE PROTEÍNAS MEDIANTE
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR .................................................. 43 
2.1.1. Métodos de determinación de la masa molecular de una proteína ........................ 43 
2.1.2. Fundamento de la cromatografía de exclusión molecular ...................................... 43 
2.1.A Preparación de la columna de Sephadex y aplicación de muestras ....................... 46 
 2.1.B Determinación del volumen de exclusión y volumen total de la columna .............. 48 
2.1.C Calibrado de la columna y determinación de la masa molecular de las proteínas
problema ....................................................................................... 49 

2.2. DETERMINACIÓN DE LA MASA MOLECULAR DE PROTEÍNAS MEDIANTE

ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN PRESENCIA DE SDS .. 52 
2.2.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (PAGE-SDS) ...... 52 
2.2. A Determinación de la masa molecular de las proteínas problema mediante
electroforesis PAGE-SDS  .........................................................................  53 

2.3. EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DNA GENÓMICO .................................... 57 

2.3.1. Purificación de ácidos nucleicos ............................................................................ 57 
2.3. A Extracción de DNA genómico de cebolla .............................................................. 58 
2.3. B Caracterización espectroscópica de DNA ............................................................. 59 
2.3. C Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa ....................................... 60 

2.4. CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA DE PROTEÍNAS ................................ 65 

2.4.1. Introducción ...................................................................................................... 65 
2.4. A Caracterización espectroscópica de proteínas: albúmina de suero bovino ........... 68 
2.4. B Caracterización espectroscópica de proteínas: hemoglobina ............................... 68 

2.5. DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE UNA ENZIMA.............. 70 

2.5.1. Introducción ...................................................................................................... 70 
2.5.2. La enzima fosfatasa alcalina ................................................................................. 71 
2.5. A Determinación de los parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina ..................... 72 

BLOQUE 3: PURIFICACIÓN DE ENZIMAS: LISOZIMA DE CLARA DE HUEVO DE GALLINA 

3.1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 78 
3.2. OBJETIVOS EXPERIMENTALES ................................................................................ 79 
3.3. PURIFICACIÓN DE LA LISOZIMA DE CLARA DE HUEVO DE GALLINA ............... 79 
3.4. ENSAYO ENZIMÁTICO .............................................................................................. 82 
3.5. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS ........................... 83 
3.6. ELECTROFORESIS PAGE-SDS ................................................................................ 84 
3.7. SEGUIMIENTO DEL PROCESO: TABLA DE PURIFICACIÓN .............................. 85 
3.8. CARACTERIZACIÓN DE LA LISOZIMA PURIFICADA ........................................... 86 
3.9. RESULTADOS EN EL CUADERNO DE LABORATORIO .......................................... 86 

BLOQUE 4: LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES: CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE

LA β-GLUCOSIDASA DE ALMENDRA 
4.1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 88 
4.2. OBJETIVOS EXPERIMENTALES ................................................................................ 95 
4.3. MÉTODOS ................................................................................................................... 95 
4.4. EXPERIMENTACIÓN................................................................................................... 96 
4.4.1. Estandarización de las condiciones de ensayo ..................................................... 96 
4.4.2. Determinación de los parámetros cinéticos ........................................................... 97 
4.4.3. Efecto de la temperatura en la catálisis ................................................................. 97 
4.4.4. Estudios de inhibición reversible ........................................................................... 99 
4.5. DISCUSIÓN ................................................................................................................. 99 
4.6. REFERENCIAS .......................................................................................................... 100
4.7. ANEXOS .................................................................................................................... 104
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BLOQUE 1: INTRODUCCIÓN AL TRABAJO EXPERIMENTAL EN EL

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

1.1. EL LABORATORIO DE BIOQUÍMICA

1.1.1. Seguridad. Normas básicas de funcionamiento del laboratorio
El Laboratorio es un lugar potencialmente peligroso. Dadas las características del
trabajo que se realiza pueden ocurrir accidentes de diversa consideración, tales como
intoxicaciones, quemaduras, incendios o explosiones. Para poder controlar los efectos de los
posibles accidentes, hay que disponer de los elementos de actuación adecuados. Además, es
importante seguir una serie de normas de seguridad que eviten los posibles accidentes.

Elementos de seguridad. Cuando se empieza a trabajar en un laboratorio, lo primero que se

debe hacer es informarse sobre:
 Localización de las salidas de emergencia.
 Situación de los elementos de seguridad: lavaojos, duchas, extintores, mantas
ignífugas y botiquín.
 Situación de los recipientes para residuos.
 Normas generales de trabajo e instrucciones sobre la actuación en caso de accidente.

Medidas de seguridad.
a) Normas personales
 Durante la estancia en el laboratorio se deberá llevar obligatoriamente bata. Según la
operación a realizar, también deben protegerse adecuadamente los ojos (gafas de
seguridad), las manos (guantes), y/o las vías respiratorias (mascarilla).
 Es recomendable llevar el pelo largo recogido y los pies adecuadamente protegidos.
 Está terminantemente prohibido consumir alimentos o bebidas y fumar.
 Nunca se debe trabajar estando solo en el laboratorio.
 El orden y la limpieza son componentes importantes de la seguridad

b) Empleo de productos químicos

 Antes de utilizar un compuesto, hay que asegurarse de que es el que se necesita. Leer
la etiqueta con atención, especialmente los pictogramas de seguridad. Si no se tiene
otra información, se debe considerar que todos los productos químicos son
potencialmente tóxicos.
 No oler, ni tocar con las manos, y aún menos con la boca, los productos químicos.
 No pipetear con la boca. Utilizar siempre un aspirapipetas.
 No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados.
 Las disoluciones preparadas se guardan en un frasco limpio y convenientemente
rotulado, indicando su composición y fecha de preparación.

c) Utilización de la instrumentación
 Leer las instrucciones escritas sobre el manejo de los aparatos (se encuentran
normalmente en la proximidad de los mismos).
 Evitar contaminación del instrumento y descontaminar en caso de derrame accidental.
Hay que mantener perfectamente limpio y seco el lugar dónde se encuentre situado.
 Ante cualquier duda o problema con los aparatos, preguntar al profesor.
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d) Eliminación de residuos y accidentes
 En el laboratorio existen contenedores debidamente etiquetados donde se desecharán
los residuos peligrosos generados.
 Si se vierte o se cae un producto químico o biológico sobre alguna superficie, hay que
aplicar la medida de contención o limpieza más apropiada a la mayor brevedad
posible.
 Si se vierte sobre una persona cualquier producto corrosivo o nocivo, hay que lavarse
inmediatamente con mucha agua y avisar al profesor. Las prendas de ropa
contaminadas o que dificulten la eliminación de la contaminación deben quitarse
inmediatamente.
 En caso de tener que evacuar el laboratorio, salir de forma ordenada siguiendo en todo
momento las instrucciones que haya impartido el profesor.

1.1.2. El cuaderno de laboratorio

Un aspecto primordial dentro del trabajo desarrollado en una Ciencia Experimental es
el registro de los resultados obtenidos en el Laboratorio. El cuaderno de laboratorio es un
instrumento de organización del trabajo, donde quedan recogidos de forma clara y
reproducible los experimentos que se han realizado. El cuaderno tiene que estar estructurado
para que lo entiendan y lo utilicen con facilidad otras personas. Para ello conviene seguir
ciertas pautas:
 Cuaderno de tapa dura con las hojas unidas de modo permanente (no es aceptable el
empleo de hojas sueltas). Las hojas deben estar numeradas consecutivamente. Es
conveniente que las hojas estén cuadriculadas.
 Utilizar un material de escritura indeleble, por ejemplo, bolígrafo de tinta negra o azul.
 Dejar un par de hojas libres al principio para la portada y la tabla de contenidos.
 El lenguaje empleado debe ser claro y preciso. El estilo ha de ser conciso. Se emplean
preferentemente las formas impersonales de los verbos.
 El orden, la estructura y la presentación son importantes.
 Los experimentos deben registrarse con suficiente detalle para que sea posible
reproducirlos, averiguar exactamente lo que se observó y cómo se interpretó.
 Los resultados deben anotarse directamente en el cuaderno según se van obteniendo.
El cuaderno no debe pasarse a limpio.
 Nunca debe borrarse nada. Si se cometen errores, deben tacharse únicamente con
una línea por encima, de forma que aún puedan leerse, y, por supuesto, nunca debe
arrancarse una página.
 Cada experimento debe comenzar al principio de la hoja y presentar los siguientes
apartados:
1.- Fecha y título del experimento. (Nombre de las personas que lo realizan)
2.- Introducción y Objetivo. Breve exposición del problema o tarea que se quiere abordar.
Introducción teórica al experimento, incluyendo descripción de las técnicas o métodos
nuevos, reacciones químicas o bioquímicas, estructuras de los reactivos, etc.
3.- Desarrollo experimental. En esta sección se indica lo que se va a hacer y cómo se hará.
Constituye la preparación del experimento. Puede que se disponga de instrucciones
detalladas escritas o bien que haya que diseñar el plan de trabajo. En este último caso,
hacer un esquema claro del experimento, detallando las diversas etapas que haya que
desarrollar y condiciones experimentales a tener en cuenta.
* Tabla de materiales y reactivos: indicar la procedencia y las características
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especiales de las muestras, reactivos, aparatos, … que se vayan a utilizar.
Calcular el volumen necesario de cada reactivo e indicar las concentraciones, cómo
se prepara o si es comercial. Anotar las diluciones que se realicen.
* Esquema o diagrama describiendo las etapas del procedimiento experimental.
Cuando sea posible, preparar las tablas de pipeteo, y las tablas para el registro y
procesado de resultados.
4.- Resultados. Es la parte central del experimento. Contendrá las observaciones, los datos
sin procesar, los cálculos realizados, los resultados finales, razones para las
modificaciones realizadas en el diseño del experimento,…
* Registro del experimento: se lleva a cabo en el laboratorio durante el desarrollo del
mismo. Se anota lo que realmente se hace, no lo que se debería haber hecho. Los
detalles deben ser suficientes para que otro alumno pudiera repetir el experimento usando
el cuaderno de laboratorio.
* Datos preliminares: hay que registrarlos en el cuaderno, de modo honesto, de
inmediato según se obtienen (no confiar en la memoria) y tan completamente como sea
posible.
* Métodos de cálculo: se debe anotar con claridad cómo se han realizado los cálculos,
indicando siempre las unidades. Destacar los resultados finales obtenidos.
* Presentación final de resultados en tablas o figuras. [Ver Sección 1.3.2.]
Las figuras, imágenes, hojas con resultados impresos, fotocopias de protocolos....
deben pegarse o graparse al cuaderno, adecuadamente identificadas, en el lugar del
mismo que corresponda.
5.- Discusión y conclusiones. Una vez obtenidos los resultados hay que interpretarlos. ¿Están
de acuerdo con la hipótesis planteada o la refutan? Comparar con los resultados previos,
propios o de otros (incluir referencias), y escribir con brevedad las ideas sobre qué
significa el resultado obtenido, modificaciones para mejorar el diseño experimental, y qué
habría que hacer a continuación. Las conclusiones deben ser claras y estar en relación
directa con los objetivos previamente planteados.
6.- Bibliografía. Si es necesario.

1.1.3. El laboratorio de Bioquímica

El laboratorio de Bioquímica presenta algunas particularidades con respecto a otros
laboratorios:
- Será necesario habituarse al manejo de cantidades muy pequeñas, tanto en masa (mg,
μg), como en volumen (ml, μl).
- Hay que mantener un control estricto de los parámetros ambientales. Se utilizan
temperaturas, pH, medios, … adecuados para el mantenimiento de la estabilidad de las
moléculas biológicas.
- Normalmente se emplean disoluciones acuosas. El agua, aunque no se especifique, es
siempre purificada (desionizada o destilada).
- Se requiere una limpieza extrema del material de laboratorio para evitar contaminaciones
que afecten tanto a la pureza como a la funcionalidad de las muestras.

 Calidad del agua

El agua del grifo contiene una gran variedad de impurezas, incluyendo materia particulada,
compuestos orgánicos, inorgánicos y gases, microorganismos, etc., por tanto, nunca se utiliza
para la preparación de reactivos en el laboratorio. Existen distintas técnicas para purificar el
agua (destilación, intercambio iónico, adsorción en carbón activo, ósmosis inversa, filtración por
membrana) que eliminan diferentes tipos de impurezas. En los laboratorios de Bioquímica se
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suele disponer de un equipo de purificación de agua que combina varias de estas técnicas.
Para la mayoría de los procedimientos que se llevan a cabo en el laboratorio, se emplea agua
purificada por desionización, ósmosis inversa o destilación. En algunos casos, es necesaria la
utilización de agua ultrapura. La calidad del agua se establece en función de su conductividad
eléctrica que debe estar por debajo de un límite prefijado (por ejemplo, EC< 1 µOhm/cm).

 Reactivos
En el laboratorio se dispone de distintos tipos de reactivos (sólidos, líquidos o disoluciones
preparadas) tal y como se comercializan. En general, las casas comerciales ofrecen un
mismo producto con varias calidades. Dentro de los reactivos analíticos pueden distinguirse
tres calidades distintas: i) Reactivos para análisis (PA): Son aquellos cuyo contenido en
impurezas no rebasa el número mínimo de sustancias determinables por el método que se
utilice. ii) Reactivos purísimos: Son reactivos con un mayor grado de pureza que los reactivos
“para análisis”. iii) Reactivos con purezas especiales: Son reactivos con calidades específicas
para algunas técnicas, como cromatografía líquida (HPLC), espectrofotometría (UV),
electroforesis, Biología Molecular, etc., o bien que cumplen los requisitos especificados por la
American Chemical Society (ACS), con trazas cuantificadas (99 % pura, 99,9 % pura,…), etc.

Etiquetado de los reactivos. Todo envase de reactivos debe llevar obligatoriamente, de

manera legible e indeleble, una etiqueta bien visible que contenga: Nombre, Calidad,
Riqueza, Impurezas, Fórmula y peso molecular. Además, aparecen los pictogramas, las
frases R o de RIESGO (riesgos específicos atribuidos a las sustancias peligrosas: R1.
Explosivo en estado seco; R10. Inflamable; R23. Tóxico por inhalación; R38. Irrita la piel;….) y
las frases S de SEGURIDAD (informan sobre la peligrosidad del producto y proporcionan
consejos de prudencia relativos a las sustancias peligrosas: S3. Consérvese en lugar fresco;
S22. No respirar el polvo; S29. No tirar los residuos por el desagüe; S50. No mezclar con
(especificar producto)…..

 Material de uso frecuente en el laboratorio

En el laboratorio se puede encontrar material muy diverso y es importante conocer su función
puesto que de su correcto uso depende la calidad de los resultados obtenidos.

Material no volumétrico. La medida de un volumen de forma aproximada se puede

realizar en vasos de precipitados (se emplean para contener líquidos, realizar tratamientos de
muestras y precipitaciones) y matraces Erlenmeyer (empleados principalmente en las
valoraciones). Pueden ser de vidrio o plástico y de diversos tamaños. Las marcas de volumen
que aparecen en su superficie son meramente orientativas.

Material volumétrico o material que permite la medida precisa de volúmenes: suele ser
de vidrio. Se clasifica en material graduado y material aforado, siendo éste último más
preciso. Incluye: Buretas, se emplean para la medida precisa de volúmenes variables y
principalmente en valoraciones; Matraces aforados, se utilizan para la preparación de
disoluciones de concentración conocida; la línea delgada (aforo) grabada alrededor del cuello
indica el volumen de líquido contenido a una temperatura definida; Probetas, permiten medir
volúmenes medios o grandes, o transvasar y recoger líquidos; Pipetas graduadas, se
emplean para la medida de volúmenes variables, pequeños o medios, de líquido;
Micropipetas o pipetas automáticas, transfieren volúmenes variables de unos pocos mililitros
o microlitros de líquido.

 Limpieza del material

Para que los resultados obtenidos en el laboratorio sean fiables se ha de mantener la mesa
de trabajo perfectamente limpia y se debe limpiar el material de laboratorio de forma
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adecuada. Una vez utilizado el material, es aconsejable quitarle los rótulos y proceder a su
limpieza lo antes posible. Todo el material de vidrio, se lava primero con agua y jabón y se
enjuaga con agua del grifo. A continuación, se lava (por arrastre) con agua
destilada/desionizada realizando un mínimo de tres enjuagues. El material limpio se deja boca
arriba sobre la mesa o boca abajo sobre el papel de filtro.

1.1.4. Operaciones básicas (I)

En el laboratorio hay una serie de operaciones que se realizan con mucha frecuencia y cuya
correcta ejecución asegura que los resultados obtenidos a partir de los experimentos sean
fiables. Es importante, por tanto, llevar a cabo estas operaciones básicas correctamente y
saber cuáles son los errores más comunes que se comenten al realizarlas para poder
evitarlos.

 PESADA [Consultar ficha]

En el laboratorio se efectúan medidas de masa de compuestos sólidos y, algunas veces,
también de líquidos. Para ello existen dos tipos fundamentales de balanzas:
- Balanzas analíticas o de precisión: precisión 0,1 a 0,05 mg, carga máxima 50 a 200g.
Se utilizan para pesar sólidos con gran exactitud. Dada la gran sensibilidad de las
balanzas analíticas, suelen estar encapsuladas, y hay que ser muy cuidadoso cuando
se realice una pesada.
- Granatario: balanza de precisión media (0,1 a 0,01 g), con un solo plato y no
encapsulada. Se suele emplear para pesar cantidades de compuestos mayores de 1 g.
La pesada en un granatario electrónico es muy sencilla:
1. Comprobar que el instrumento está nivelado (comprobar la posición de la burbuja
bidimensional) y encender el granatario.
2. Colocar sobre el plato un papel para pesar o un recipiente de tamaño y volumen
adecuados para lo que se quiere pesar.
3. Tarar el granatario (poner a cero).
4. Añadir poco a poco la cantidad de sustancia necesaria hasta la masa prevista.
5. Retirar la sustancia pesada. Apagar el granatario y limpiar si es necesario.

NOTA: La masa y el peso son propiedades diferentes. La masa es una medida de la cantidad de
materia que posee un cuerpo (unidad, gramo), mientras que el peso es una medida de la fuerza que
ejerce el campo gravitatorio sobre el cuerpo (unidad, newton o N).

 MEDIDA DE VOLUMEN DE LÍQUIDOS

Medir el volumen de un líquido consiste en
comparar el nivel del mismo con las marcas
de la pared del instrumento de medida,
situando los ojos a la altura de la superficie
libre del líquido. En las disoluciones acuosas
esta superficie no es plana, sino cóncava,
formando el llamado menisco, que no
coincide exactamente con ninguna marca
horizontal. Por ello, se toma como nivel la
tangente al fondo del menisco; el volumen del
líquido será el correspondiente a la marca del Menisco Menisco
instrumento que coincide con dicha tangente. cóncavo convexo
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El volumen puede medirse de forma aproximada usando vasos de precipitados o

Erlenmeyers. Para medir el volumen con precisión se emplea material volumétrico: buretas,
probetas, pipetas graduadas o micropipetas. El material empleado debe estar limpio y seco.
Se debe seleccionar el instrumento cuyo volumen máximo esté lo más próximo posible al
volumen que se quiere medir.

Medida de volúmenes con pipetas graduadas. [Consultar ficha]

1. Se introduce la pipeta en el recipiente del cual se desea extraer un volumen determinado
de muestra. Empleando un aspirapipetas, se hace ascender el líquido por encima de la
marca deseada.
2. Dejar salir lentamente el líquido y ajustar el menisco a la marca deseada, manteniendo la
pipeta vertical.
3. Desplazar la pipeta hasta el recipiente de destino, y dejar salir el líquido apoyando la
punta de la pipeta contra la pared interior del mismo.
4. Dependiendo del tipo de pipeta, hay que ajustar el menisco a una segunda marca o hay
que dejar que salga todo el líquido contenido en la pipeta. Si está especificado, hay que
mantener los tiempos de espera. La pipeta no se debe sacudir, ni soplar para que caiga la
última gota.

Medida de volúmenes con micropipetas. [Consultar ficha]

1. Seleccionar la micropipeta y fijar el volumen a pipetear. Colocar el “tip” (punta de plástico
desechable) en la punta de la pipeta; ajustarlo bien con un pequeño giro.
2. Presionar suavemente el émbolo con el pulgar hasta el primer tope. Sin soltarlo, introducir
la punta de la micropipeta en la muestra, a no más de 3- 5 mm de la superficie del líquido.
3. Succionar el líquido, liberando lentamente la presión sobre el pulsador. Después de 2-3
segundos, retirar la pipeta de la muestra.
4. Para dispensar la muestra, se apoya la punta de la pipeta contra la pared interior del
recipiente y se presiona lentamente el botón pulsador hasta el primer tope. Después de un
par de segundos, se termina de vaciar la pipeta, apretando el émbolo hasta el segundo
tope
5. Manteniendo el émbolo totalmente presionado, se retira cuidadosamente la pipeta del
recipiente, deslizando la punta a lo largo de la pared.
6. Relajar la presión del pulgar para que el émbolo vuelva lentamente a su posición original.
Eliminar la punta por presión en el expulsor de puntas o bien tirando de ella

Para que las medidas realizadas con micropipetas sean correctas, se deben tener en cuenta
las siguientes consideraciones:
 La pipeta debe mantenerse en posición vertical durante todo el proceso de pipeteo.
No dejarla nunca horizontalmente sobre la mesa con líquido succionado. Cuando no se
utilice, colocarla en posición vertical en el soporte para pipetas.
 Cada pipeta sirve para medir un volumen fijo o un determinado intervalo de volúmenes.
NO ajustar la pipeta a volúmenes fuera del intervalo indicado.
 Los modelos que pipetean volúmenes inferiores a 200 μl usan puntas amarillas;
aquellas micropipetas que miden volúmenes entre 200 y 1000 µl, utilizan puntas
azules.
 La pipeta se coge como un puñal. La empuñadura debe reposar sobre su dedo índice y
el pulsador se presiona con el pulgar.
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PARTE PRÁCTICA
Objetivos
- Identificar los materiales y equipos comúnmente utilizados en el laboratorio
- Aprender a manejar el granatario, las pipetas y las micropipetas.
- Introducir los conceptos de precisión y exactitud en las medidas experimentales.
Materiales y reactivos
Pipetas graduadas de 5 ml y aspirapipetas Termómetro
Micropipetas y puntas Vasos de precipitados, probetas
Granatario Agua destilada

EXPERIMENTO 1.1 Reconocimiento del material y equipo del laboratorio

 Revisión y reconocimiento del material de las taquillas de cada grupo.
 Revisión y reconocimiento del material común para cada laboratorio.
 Reconocimiento de los aparatos más frecuentemente utilizados en el laboratorio:
micropipetas, granatarios, agitatubos, agitadores magnéticos, etc.

EXPERIMENTO 1.2 Comprobación de la exactitud y la precisión de pipetas y

micropipetas
Los errores de medida que se pueden cometer utilizando pipetas son normalmente atribuibles
al operador y no al instrumento en sí mismo. Para evitar dichos errores, hay que entrenarse en
el uso correcto de las mismas. Es conveniente practicar repetidamente la medida con pipetas
graduadas y micropipetas empleando agua destilada.
Se quiere comprobar la exactitud y la precisión con la que se miden 5 ml con una pipeta
graduada, y distintos volúmenes (800 μl, 400 ó 100 μl) con micropipeta. El volumen medido por
una pipeta se cuantifica pesando la cantidad de agua destilada que vierte y usando un factor de
conversión Z derivado de la densidad y que integra el efecto de la temperatura y de la presión
atmosférica (ver Tabla 1).
Usar un granatario capaz de pesar como mínimo centésimas de gramo (0,01 g).

Procedimiento
1. Llenar una pipeta graduada con agua destilada hasta la marca de 5 ml. Secar con
cuidado el extremo de la pipeta y dispensar su contenido sobre la pared interior de un
vaso de precipitados previamente tarado. Anotar la masa del agua vertida en el vaso.
2. Repetir el proceso 10 veces. Tarar de nuevo el granatario cada vez que se use.
3. Anotar los resultados de cada pesada en una Tabla y calcular el volumen dispensado
por la pipeta a partir de la masa pesada (ver Análisis de los Resultados).

4. Ajustar la micropipeta al volumen con el que se quiera trabajar (800 μl, 400 μl ó 100 μl) y
colocar una punta en su extremo. Llenar la pipeta con agua destilada y descargarla en el
vaso de precipitado previamente tarado. Anotar la masa del agua vertida en el vaso.
5. Repetir el procedimiento con la misma punta de plástico 10 veces. Anotar los resultados
de cada pesada en una Tabla y calcular el volumen dispensado por la pipeta.

Análisis de los resultados

- Conversión de masa a volumen: V = (m + e) x Z
Donde V= volumen (µL), m= masa (mg), e= pérdida de masa por evaporación (mg) y Z=
factor de conversión de miligramos en microlitros (Tabla 1). Nota: La pérdida de masa por
evaporación solo es necesario considerarla para volúmenes muy pequeños (< 20 µl).
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- Exactitud (errores sistemáticos): A = Vm - Vs
La exactitud (A, “accurancy”) es la diferencia entre el volumen medio dispensado (Vm)
por la pipeta y el volumen seleccionado (Vs) en la misma; corresponde al error absoluto
de la medida. En un certificado de calibración la exactitud se expresa habitualmente
como valor relativo en porcentaje: (ACC % = (A / Vs) * 100.
- Precisión (error aleatorio)
La precisión refleja la repetitividad en el volumen pipeteado. Se expresa como
desviación estándar (σ, en valor absoluto) o coeficiente de variación (CV, porcentaje).
Además de la propia pipeta, la práctica y la experiencia del operador son factores
importantes que afectan a la precisión.
𝑁 𝑁
1 1
𝑥̅ 𝑥𝑖   𝜎 𝑥𝑖 𝑥̅ 2 
𝑁 𝑁 1
𝑖 1 𝑖 1
Media aritmética Desviación estándar Coeficiente de variación
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Resultados que deben figurar en el cuaderno de laboratorio
1. Características del granatario utilizado y precisión del mismo. Temperatura y presión
atmosférica a la que se han realizado las medidas.
2. Descripción y esquema de la pipeta graduada de 5 ml que se haya utilizado, incluyendo
la marca y los datos que estén grabados en la misma. Importancia de la temperatura en
las medidas de volumen.
3. Tabla con las masas registradas y los volúmenes dispensados por la pipeta graduada de
5 ml. Calcular el volumen medio pipeteado, la desviación estándar y el coeficiente de
variación. ¿Cómo estimaría la exactitud y la precisión de las medidas realizadas?
4. Descripción y esquema de la micropipeta que se haya utilizado para las medidas,
incluyendo la marca y los datos que estén indicados en la misma.
5. Tabla con las masas registradas y los volúmenes dispensados por la micropipeta.
Calcular el volumen medio, la desviación estándar y el coeficiente de variación para
cada uno de los volúmenes pipeteados. ¿Cómo estimaría la exactitud y la precisión de
las medidas realizadas?

Precisión y exactitud en medidas experimentales

CUESTIONES COMPLEMENTARIAS
1- Indique cómo procedería para pesar 2,54 g de NaCl.
2- En el laboratorio se dispone de tres micropipetas automáticas, cuyos intervalos de medida
son: de 1000 a 200 μl, de 200 a 20 μl y de 50 a 5 μl, respectivamente. Describa como
realizaría la medida de 750 μl, 200 μl y 20 μl.
3- Calcular media, desviación estándar y coeficiente de variación de las siguientes medidas
repetidas del valor de pH de una disolución.
7,21 7,35 7,24 7,48 7,64 7,38 7,42 7,81 7,54 7,33 7,41

4- 40 ng de una proteína de 50 kDa se disuelven en 100 ml. Calcular la concentración en

pmol/l de esta disolución.
5- Considerar una disolución 2,27 mmol/l de un compuesto (Mr 590). Expresar la
concentración de dicha disolución en: (a) μmol/ml; (b) g/l; (c) mg/ml. ¿Qué volumen de
disolución (en ml) contendrá 10 μmoles del compuesto?
6- Una enzima (Mr 30000) está disponible como una preparación comercial con 0,2 g/100 ml y
al 80 % de pureza. ¿Qué volumen (en ml totales) habría que coger para añadir
aproximadamente 0,1 μmol de enzima necesarios para un ensayo?
 10

1.2. PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES. IMPORTANCIA DEL pH

1.2.1. Disoluciones y medios fisiológicos.
Disolver es mezclar de forma homogénea las moléculas o iones de un sólido, un líquido o un
gas en el seno de otro líquido, llamado disolvente. La mayor parte de los experimentos que se
llevan a cabo en el laboratorio de Bioquímica tienen lugar en disolución acuosa. Para todos
los procedimientos de laboratorio se utiliza agua purificada [ver Sección 1.1.3.].
En Bioquímica la concentración se define habitualmente como la relación entre la
cantidad del compuesto y el volumen o masa final de la disolución (ver Tabla 1).

Tabla 1- Formas de expresar la concentración de una disolución

Concentración Soluto Disolución
Molaridad (M) mol litro
Masa / volumen g ó mg litro ó ml
% en masa (m/m o “w/w”) g 100 g
% en volumen (v/v) ml 100 ml
% masa/volumen (m/v o “w/v”) g 100 ml

Es importante conocer con precisión lo que significa cada unidad de concentración y saber
cómo convertir unas unidades en otras. Tener en cuenta que los volúmenes a considerar son
siempre volúmenes finales de disolución y no volúmenes de disolvente añadido. También hay
que ser capaz de distinguir los valores que son concentraciones (M o mg/ml) de los que son
cantidad de materia (moles o gramos).
Los medios fisiológicos son disoluciones utilizadas para mantener células o tejidos en
un estado viable. Pueden clasificarse de acuerdo con su uso: (i) para incubaciones cortas, (ii)
para mantenimiento a largo plazo del crecimiento de microorganismos o de cultivos celulares
o de tejidos, o bien (iii) para estudios nutricionales implicando animales o plantas completos.
Su composición con frecuencia está basada en la de los fluidos naturales y no siempre está
completamente definida. Dos factores relevantes a considerar son el mantenimiento del
medio isotónico con el del tejido y su capacidad de tamponamiento a un pH fisiológico. Entre
las disoluciones que se emplean habitualmente está la disolución salina fisiológica (0,9 %
NaCl) que contiene electrolitos en concentración similar al suero sanguíneo.

1.2.2. Importancia del pH. Disoluciones tampón.

La mayoría de las células solo funcionan dentro de unos márgenes de pH muy estrechos y,
normalmente, próximos a la neutralidad. Las moléculas biológicas, como proteínas o ácidos
nucleicos, poseen numerosos grupos funcionales que pueden sufrir reacciones ácido-base, y
por tanto, muchas de sus propiedades varían con la acidez del medio en el que están inmersas.
Los seres vivos necesitan sistemas tampón para controlar los cambios de pH que de otro modo
tendrían lugar como consecuencia del metabolismo; en un organismo procesos como la
respiración, la fotosíntesis, o el transporte de oxígeno producen protones (H+) de modo
continuo. Los fluidos intra- y extracelulares poseen una elevada capacidad de tamponamiento.

Una disolución tampón, también llamada amortiguadora (o con el término inglés buffer),
es una disolución cuyo pH permanece casi constante tras la adición de pequeñas cantidades
de ácido o de base. Un tampón es una mezcla de un ácido débil con su base conjugada en una
disolución que tiene un pH cercano al pKa del ácido. Considerando el equilibrio de ionización
de un ácido débil (AH), es decir, un ácido que en disolución no se disocia totalmente:
 11
AH  A– + H+
su "constante ácida de disociación", Ka, se expresa como: Ka = ([A–]ꞏ[H+]) / [AH]. De forma
análoga a como se define el pH, se define el pKa: pKa = – log Ka
Se puede relacionar el pH de la disolución tampón con el pKa mediante la ecuación de
Henderson-Hasselbalch:
pH = pKa + log [A–] / [AH]
El pH de un tampón depende de dos factores: del valor del pKa del ácido débil y de la
relación de concentraciones entre la base conjugada (o aceptor de protones, A–) y el ácido (o
dador de protones, AH). La capacidad de tamponamiento, capacidad de resistir los cambios de
pH, de una disolución tampón es máxima cuando las concentraciones de las especies ácidas
(HA) y básica (A–) son iguales, es decir, cuando el pH de la disolución es igual al pKa del ácido
débil. Se considera que un tampón puede actuar como tal en un intervalo de pH definido en
torno a su pKa, una unidad de pH por encima y por debajo del pKa:
pKa –1 < pH < pKa +1.
No obstante, cuanto mayor sea la concentración de un tampón, mayor será también su
capacidad de tamponamiento.
Selección del tampón. En la Tabla se muestran los valores de pKa de algunos de los
compuestos que se usan con mayor frecuencia para preparar disoluciones tampón en los
laboratorios de Bioquímica. Hay que tener en cuenta que el intervalo de pH útil de
funcionamiento de cualquier tampón es una unidad por encima y una unidad por debajo del
pKa. Para decidir el tampón que se va a utilizar en un experimento en concreto hay que
considerar además que en algunos casos los efectos observados no se deben al pH sino a la
presencia de iones específicos, tales como que el fosfato puede formar complejos con metales
pesados y puede funcionar como activador, inhibidor o metabolito en numerosas reacciones
bioquímicas. En la mayor parte de los experimentos se necesita mantener el pH constante en el
intervalo pH 6 a pH 8, pero existen pocos compuestos capaces de tamponar en esa zona.
Preparación del tampón. Las soluciones tampón se pueden preparar de más de una
manera. Los dos procedimientos más habituales son: i) se emplea la ecuación de Henderson-
Hasselbalch para calcular la concentración de forma ácida y forma base conjugada que se
necesitan; ambos componentes se pesan (o se determina su volumen) por separado y se
disuelven en agua; ii) los dos componentes del par ácido-base conjugada se obtienen a partir
de uno de ellos, todos los moles del tampón proceden de dicho componente; el segundo
componente se produce a partir del primero adicionado ácido o base fuerte hasta que la
relación de concentraciones (es decir, el pH) entre ellos sea la deseada.
Tabla 2 – Valores de pKa (25ºC) de los compuestos habitualmente empleados como
tampones en el laboratorio de Bioquímica
Ácido o base pKa1 pKa2 pKa3
Ácido fosfórico 2,1 6,8 12,3
Ácido cítrico 3,1 4,7 5,4
Ácido carbónico 6,1 10,2 -
Glicil-glicina 3,1 8,4 -
Ácido acético 4,8 - -
Ácido barbitúrico 4,1 - -
TRIS* 8,1 - -
HEPES** 7,6 - -
MES*** 6,1 - -
* TRIS = N-tris(hidroximetil)aminometano. ** HEPES = Ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N´-2-
etanosulfónico. *** MES = Ácido N-(2-morfolino)etanosulfónico
 12

1.2.3. Operaciones básicas (II)

* PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES [Consultar ficha y VÍDEO]
Para preparar una disolución hay que tener en cuenta varios aspectos prácticos:
1. Si no se indica otra cosa, el disolvente a emplear es agua desionizada.
2. Los cálculos se hacen con relación al volumen final de disolución, pero los reactivos
se disuelven siempre en un volumen inferior.
3. Una vez disueltos todos los componentes de la disolución, se ajusta el pH y se hace
todo lo que haya que hacer con la disolución, antes de llevarla a volumen final en
una probeta o matraz aforado.
4. Finalmente, la disolución se transvasa al recipiente donde se vaya a guardar. Las
disoluciones deben estar siempre rotuladas, indicando la composición, la fecha de
preparación y el nombre de la persona que lo preparó.

Las condiciones de almacenamiento de los reactivos y las disoluciones son críticas.

Los reactivos y los compuestos químicos deben almacenarse adecuadamente; los fabricantes
suelen incluir instrucciones al respecto. En cuanto a las disoluciones, algunas pueden
conservarse a temperatura ambiente, pero con frecuencia hace falta guardarlas en la nevera
(a 4ºC, para inhibir el crecimiento bacteriano o la descomposición) o en el congelador
(temperaturas inferiores a 0ºC). Las disoluciones, independientemente de la temperatura,
deben conservarse en recipientes adecuadamente cerrados, para evitar la evaporación y la
contaminación de las mismas. A veces es necesario protegerlas de la luz solar.

* MEDIDA DEL pH
El pH de las disoluciones acuosas se puede determinar bien por métodos colorimétricos,
usando un indicador de pH, o bien por métodos potenciométricos, mediante un pHmetro.
Se puede obtener una idea aproximada del pH de una disolución utilizando indicadores
ácido-base (compuestos orgánicos, naturales o sintéticos, cuyo color depende del pH de la
disolución en la que se encuentran). Los indicadores suelen ser ácidos débiles que se
disocian en disolución:
Indicador-H ↔ Indicador– + H+
Así, aplicando la ecuación de Henderson-Hasselbach: pH = pKind + log (Ind–] / [Ind-H]
Las dos formas del indicador tienen diferente color y, por consiguiente, el color de la
disolución dependerá del pKind y del pH. El cambio de color ocurre alrededor del pKind, que es
donde el indicador es más útil; pero el cambio ocurre en un intervalo relativamente amplio de
pH, por lo que el indicador solo proporciona una medida aproximada del mismo. Se suelen
emplear indicadores para determinar el punto final de las titulaciones de pH.

El método más conveniente y fiable para medir el pH es el pHmetro, instrumento que

mide la diferencia de potencial que se establece en una célula electroquímica formada por un
electrodo de referencia, la disolución a medir y un electrodo selectivo de medida (electrodo
sensible a los protones). El dispositivo consta esencialmente de dos partes, los electrodos y el
potenciómetro propiamente dicho. El electrodo de referencia más habitual es el de
calomelanos, que presenta un potencial estable y de valor determinado frente al electrodo de
hidrógeno (+0,25 V). Como electrodo de medida se ha generalizado el uso del electrodo de
vidrio, cuyo potencial depende de la concentración de protones de la disolución en la que se
sumerge; la selectividad del electrodo radica en la membrana de vidrio, que en forma de
bulbo contiene una disolución de HCl 0,1 M. En la actualidad, el electrodo más
frecuentemente utilizado en la medida de pH es el llamado combinado (ver Figura) que lleva
asociados el electrodo de referencia y el electrodo de vidrio.
 13

E = Eref – Evidrio

Evidrio = 0,342 – 0,058 pHs

E = 0,25 – (0,342 – 0,058 pHs)

E = –0,092 + 0,058 pHs

Uso y mantenimiento del pHmetro.

El método preciso de utilización de un pHmetro depende del modelo. Sin embargo, de forma
general se deben tener las siguientes precauciones:
1- Electrodos. El funcionamiento del pHmetro depende en buena medida del estado de
conservación y mantenimiento de los electrodos. La parte sensible (extremo inferior) del
electrodo combinado debe estar siempre sumergida o en la disolución a medir, o en una
disolución adecuada para su conservación (si es necesaria, pedirsela al profesor). Hay que
impedir que el electrodo se seque.
Para evitar contaminaciones, los electrodos deben enjuagarse siempre con agua
destilada, antes y después de cada uso. No tocar el bulbo del electrodo de vidrio con la mano;
el resto del electrodo se puede secar suavemente con papel. El lavado debe ser exhaustivo
tras la medida de pH de soluciones con elevada concentración de macromoléculas biológicas.
2.- Encendido del aparato. Una vez encendido el interruptor general, dejar que se
estabilice durante unos minutos. Para realizar una medida, hay que pulsar el botón de
medida.
3.- Calibrado. Antes de utilizar el aparato, es imprescindible calibrarlo con dos
soluciones de referencia de pH establecido (pH 4, pH 7 o pH 10) a la temperatura indicada. Si
el pHmetro no se apaga, el calibrado es válido durante 24 h.
4.- Medida de pH. Antes de medir el pH deberá mezclarse bien la disolución
empleando un agitador magnético. Para que la medida sea estable, el electrodo tiene que
introducirse en la disolución hasta que el puente salino, quede sumergido en la misma.
 14
PARTE PRÁCTICA
Objetivos
- Aprender a utilizar el pHmetro.
- Preparar una disolución tampón y comprobar su capacidad de tamponamiento.
- Identificar un aminoácido a partir de los valores de pKa de su curva de titulación.

Materiales y reactivos
KH2PO4 (fosfato monopotásico) Tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0 [Alumno]
K2HPO4 (fosfato dipotásico) HCl 0,2 M y HCl 0,6 M
Agua destilada NaOH 0,2 M y NaOH 0,6 M
Papel de pesar Bureta y soporte con pinzas
Vaso de precipitados Vaso de precipitados y pipetas
Probeta o matraz Indicador Naranja de metilo
Barra magnética Indicador Fenolftaleína
Ácido clorhídrico (HCl 6 M)
Hidróxido potásico (KOH 4 M) Disoluciones 0,1 M de diferentes aminoácidos

EXPERIMENTO 2.1 Preparación de una disolución tampón

Preparar 1000 ml de tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 7,0, a partir de fosfato monopotásico y
fosfato dipotásico sólidos. [pKa´s del ácido fosfórico: 2,1, 6,8 y 12,3]

Procedimiento
1. Hacer los cálculos necesarios.
2. Pesar las cantidades calculadas de cada una de las sales en un granatario.
3. Añadir las sales al mismo vaso de precipitados y disolverlas en un 80-90 % del
volumen final de agua destilada con ayuda de la barra magnética.
4. Calibrar el pH-metro a pH 4,0 y pH 7,0 con las soluciones de calibrado.
5. Introducir el electrodo del pH-metro en la disolución del tampón y medir su pH. Si es
necesario, añadir gota a gota y con agitación ácido fuerte (HCl 6 M) o base fuerte
(KOH 4 M), hasta ajustar el pH a 7,0.
6. Llevar la disolución al volumen final de 1 litro con agua destilada, utilizando una
probeta o un matraz aforado.
7. Trasvasar la disolución a una botella adecuadamente rotulada y guardarla, ya que
habrá que utilizarla en experimentos posteriores.

EXPERIMENTO 2.2 Comprobación de la capacidad de tamponamiento

Analizar la capacidad de tamponamiento de tres disoluciones: el tampón preparado en el
experimento anterior, el mismo tampón diluido 5 veces y agua destilada. Se emplearan dos
indicadores ácido-base: la fenolftaleína y el naranja de metilo. El pH característico al que se
produce el cambio de color lo determina su pKa.
Indicador pKa Forma ácida Forma básica
Naranja de metilo 3,7 Roja Amarilla
Fenolftaleína 8,9 Incolora Fúcsia

Procedimiento
1. Preparar 100 ml de una dilución 1/5 del tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 7,0. Para ello,
diluir el tampón con agua destilada. Calcular la concentración del nuevo tampón y
determinar su pH con el pH-metro.
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2. Montar la bureta en el soporte y comprobar que funciona correctamente.
3. Preparar tres vasos de precipitados o Erlenmeyers y rotularlos. Echar 20 ml de agua
destilada en el primer vaso, 20 ml de tampón diluido 5 veces en el segundo vaso y 20 ml
de tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 7,0, en el tercer vaso.
4. Añadir 5 gotas de naranja de metilo en cada uno de los vasos. Agitar las mezclas,
observar y anotar el color obtenido.
5. A continuación añadir el ácido fuerte (HCl 0,2 M), gota a gota con la bureta, a la vez que
se agita, hasta que la disolución vire de color. Anotar el volumen requerido para dicho
viraje en cada uno de los tres vasos de precipitado.
6. Preparar de nuevo tres vasos de precipitados como se indica en la etapa 3.
7. Añadir 5 gotas de fenolftaleína en cada vaso. Agitar las mezclas, observar y anotar el
color obtenido.
8. A continuación añadir la base fuerte (NaOH 0,2 M), gota a gota con la bureta, a la vez
que se agita, hasta que la disolución vire de color. Anotar el volumen requerido para
dicho viraje en cada uno de los casos.

EXPERIMENTO 2.3 Titulación de un aminoácido

Los aminoácidos son moléculas que poseen, al menos, dos grupos ionizables, un grupo
amino y un carboxilo. Presentan por lo tanto carácter anfótero (pueden comportarse como
ácido o como base).
(i) A un pH neutro toman la forma de ion dipolar. Para el aminoácido más sencillo, la
glicina (Gly), la estructura ion dipolar se denomina glicina isoeléctrica, por tener igual
número de cargas positivas y negativas.
(ii) En medio ácido, la forma dipolar puede aceptar un protón (H+) en el grupo carboxilato
(-COO–), dando lugar a la forma catiónica o clorhidrato del aminoácido.
(iii) En medio alcalino, la forma dipolar puede perder un protón (H+) del grupo (-NH3+),
originando la forma aniónica del aminoácido; en el caso de la glicina, el glicinato.
Al pasar de pH muy ácido a pH muy alcalino, la evolución de las cargas en la representación
de Brönsted del aminoácido glicina, sería:

Los aminoácidos pueden considerarse como ácidos polipróticos. El aminoácido glicina es

un ácido diprótico, que se caracteriza por tener dos constantes de ionización y, por
consiguiente, dos pKa´s. El primer pKa (pKa1) corresponde a la disociación del grupo
carboxilo y el segundo (pKa2) corresponde a la disociación del grupo amino. Entre estos dos
pKa´s se sitúa el punto isoeléctrico (pI), definido como el pH al cual el aminoácido presenta
carga neta cero (las cargas positivas y negativas se compensan).
La forma más sencilla de estudiar los equilibrios de ionización es realizar una
titulación del aminoácido. Para ello, a una disolución del aminoácido en su forma más
protonada se le añade poco a poco una base fuerte (agente titulante), a la vez que se va
midiendo el pH de la disolución. De este modo, se valorarán gradualmente cada uno de los
 16
grupos ionizables del aminoácido y se construye la curva de titulación. La valoración ocurre
de forma escalonada y la neutralización completa del aminoácido requiere tantos equivalentes
de base como grupos ácidos (grupos ionizables protonados) tenga el aminoácido. De este
modo la glicina requerirá dos equivalentes de base para su titulación total, mientras que la
lisina necesita tres equivalentes. Un equivalente de base corresponde al volumen de la
disolución del agente titulante que contiene exactamente el mismo número de moles de OH–
que el número de moles del grupo acido que está siendo titulado existentes en la disolución.

Por tanto, al valorar una disolución de glicina con otra de hidróxido sódico se distinguen cinco
puntos bien definidos en la curva de valoración:
 Punto inicio de la valoración: El aminoácido está en la forma catiónica (glicina+).
 Punto de adición de 0,5 equivalentes de NaOH: El grupo carboxilo del aminoácido se
encuentra ionizado al 50 %, de manera que el aminoácido está la mitad como glicina+ y la
otra mitad como glicina isoeléctrica. Por interpolación en la curva de valoración se conoce
el valor de pKa1 en el eje de ordenadas.
 Punto de adición de un equivalente de NaOH: El grupo carboxilo de la glicina está
completamente neutralizado; luego el grupo se encuentra como ion carboxilato y la glicina
está totalmente como especie isoeléctrica. En el punto de equivalencia, el pH de la
valoración de la glicina coincide con su punto isoeléctrico o pI.
 Punto de adición de 1,5 equivalentes de NaOH: El grupo amino del aminoácido se
encuentra ionizado al 50 %, de manera que el aminoácido está la mitad como glicina
isoeléctrica y la otra mitad como glicinato. Por interpolación en la curva de valoración se
conoce el valor de pKa2 en el eje de ordenadas.
 Punto de adición de 2 equivalentes de NaOH: el grupo amino de la glicina está totalmente
neutralizado y el aminoácido se encuentra en su totalidad como glicinato.
Si se emplea el clorhidrato del aminoácido (forma más protonada), el pH inicial de la
disolución es bajo, y se titulará añadiendo únicamente base fuerte. Si el aminoácido se
encuentra en su forma de ion dipolar, el pH inicial de la disolución es intermedio, y hay que
titular por un lado los grupos ácidos (que estarán desprotonados) con un ácido fuerte y, por
otro, los grupos básicos (que estarán protonados) con una base fuerte.
 17

Procedimiento
1. Añadir 30 ml de una disolución 0,1 M del aminoácido en un vaso de precipitados
pequeño (50 o 100 ml). Anotar qué aminoácido problema se está utilizando
2. Calibrar el pH-metro y determinar el pH inicial de la disolución del aminoácido.
3. Adicionar a la disolución alícuotas de 0,5 ml de NaOH 0,6 M. Después de cada adición,
agitar suavemente y registrar el valor de pH cuando se estabilice la lectura.
4. Continuar la titulación hasta que se hayan añadido al menos 15 ml de NaOH, o el valor
del pH se haya estabilizado (~pH de 11,5 -12,0).
5. Si el pH inicial de la disolución no está por debajo de 1,5 -2,0. hay que titular también la
rama ácida de la curva. Para ello, en otro vaso de precipitados de 50-100 ml añadir 30 ml
de la disolución 0,1 M del aminoácido.
6. Adicionar a la disolución alícuotas de 0,5 ml de HCl 0,6 M. Después de cada adición,
agitar suavemente y registrar el valor de pH cuando se estabilice la lectura. Continuar la
titulación hasta alcanzar valores de pH de 1,0-1,5.

Resultados que deben figurar en el cuaderno de laboratorio

1. Cálculos para la preparación del tampón.
2. Valor de pH de la disolución tampón preparada y registro de si es necesario añadir ácido
o base para ajustar el pH a 7,0.

3. Tabla indicando los volúmenes de HCl 0,2 M y NaOH 0,2 M, que hay que añadir al
tampón original, al tampón diluido 5 veces y al agua destilada, para que los indicadores
viren de color. Justificar los resultados obtenidos.

4. Tabla con los volúmenes de la disolución de NaOH 0,6 M añadidos a la disolución del
aminoácido y los valores pH medidos tras cada adición. Si fue necesario emplear HCl
0,6 M para titular el aminoácido, tabla con los volúmenes de la disolución de ácido
añadidos a la disolución del aminoácido y los valores pH medidos tras cada adición.
5. Gráfica correspondiente a la curva de titulación del aminoácido. Representar los valores
de pH en ordenadas y los mililitros de NaOH añadidos en abscisas. Si ha sido necesario
añadir HCl, hacer una única gráfica representando en abscisas desde el centro, los ml
de NaOH añadidos hacia la derecha y los ml de HCl añadidos hacia la izquierda
6. Determinar los equivalentes de base o de ácido añadidos para titular el aminoácido e
indicarlos en el eje de abscisas, bajo el eje anterior. Un equivalente de ácido o de
base corresponde al volumen de la disolución 0,6 M que contiene igual número de
moles de H+ o de OH– que el número de moles de aminoácido que se están titulando.
7. Determinar cuántos pKa´s presenta la curva de titulación y estimar los valores de dichos
pKa´s. Los pKa´s se encuentran en los puntos de inflexión de la curva en el centro de
las regiones de tamponamiento (corresponden a 0,5, 1,5 y 2,5 equivalentes).
8. Tratar de identificar cuál es el aminoácido problema, basándose en los resultados
experimentales obtenidos y de los valores de pKas tabulados para los aminoácidos.
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CUESTIONES COMPLEMENTARIAS
1- Necesita determinar el pH de una disolución y el pHmetro del laboratorio está apagado.
Indique cómo procedería para poder medir el pH.
2- Calcular la cantidad de carbonato sódico y de bicarbonato sódico que se necesita para
preparar 250 ml de una disolución tampón 0,2 M a pH 10,7. Se dispone de Na2CO3 (PM:
106) y NaHCO3 (PM: 84). (pKa: 6,1 y 10,3)
3- Describir la preparación de 100 ml de tampón citrato 0,5 M, pH 3,5, a partir de ácido
cítrico (PM: 192) y KOH 2 M (pKa: 3,09, 4,75 y 5,41)
4- Se ha llevado a cabo la hidrólisis de una proteína con pepsina en tampón fosfato 0,1 M.
Transcurridos unos minutos el pH de la disolución descendió a 2,0. ¿Cuantos ml de
NaOH 1 M habrá que añadir para recuperar el pH óptimo de la hidrólisis, si el volumen de
la disolución es 100 ml? ¿Tendría más capacidad de tamponamiento en tampón fosfato
0,01 M? (pKa: 2,1, 6,8 y 12,3; pH óptimo pepsina 2,3)
5- Describir con detalle como prepararía 1 litro de un reactivo con la siguiente composición:
* Tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0 * Glucosa al 10 % (m/v)
* CaCl2 2 mM * Proteína 0,1 mg/ml
Se indican concentraciones finales.
Información adicional: Fosfato: KH2PO4, Mr 136; K2HPO4ꞏ 3H2O, Mr 228,23, pKas: 2,12,
6,8, 12,32; Glucosa, Mr 180; CaCl2ꞏ 2H2O, Mr 174. Preparación comercial de la proteína
(Mr 68 000) disponible como disolución al 1,76 % (m/v).
 19

1.3. DILUCIONES Y CURVAS DE CALIBRADO.

1.3.1. Realización de medidas en el laboratorio. Expresión numérica del resultado.

Una magnitud es una propiedad física que puede ser medida, por ejemplo, la temperatura, la
masa, la concentración, etc. Todos los experimentos llevados a cabo en el laboratorio
requieren realizar una o más mediciones o medidas. La medición es el proceso de determinar
la relación existente entre el tamaño (la dimensión) de una magnitud y un valor estándar (la
unidad de medida). El término “medida” también se emplea para referirse al resultado
numérico específico que se obtiene en el proceso de medición. Por tanto, una medida de
cualquier clase requiere una cantidad y una unidad. La cantidad se determina usando un
instrumento de medida para comparar la cantidad desconocida con el estándar; el resultado
de la comparación se expresa como un número. El número que representa la cantidad no es
suficiente para expresar la medida, es siempre necesario asignar la unidad al número.
La exactitud se puede definir como el grado de conformidad con la verdad. Los
científicos buscan obtener medidas exactas en el laboratorio, así como elaborar registros
exactos de los experimentos realizados. Pero, por su propia naturaleza, las medidas no son
totalmente exactas, siempre se pueden determinar más decimales. El término error se usa
como un cajón de sastre para indicar que los números (las medidas) no son perfectos. El
error experimental es el que aparece durante la realización de un experimento y puede
deberse a muchos factores. Hay varios tipos de errores:
a) errores de escala, se deben a la precisión finita de los instrumentos de medida. La
precisión de un instrumento o aparato está determinada por el valor de la división más
pequeña en su escala de medida.
b) errores aleatorios o fortuitos, son aquéllos que aparecen al azar, y son inherentes al
proceso de medida o a las diferencias existentes entre los miembros de una población.
Por ello, las medidas repetidas e independientes difieren al azar en pequeñas
cantidades; estas cantidades presentan una distribución normal. El error aleatorio se
puede reducir, pero no anular, llevando a cabo un número elevado de medidas repetidas
y aplicando estadística.
c) errores sistemáticos, tienen un valor definido y afectan a todas las medidas por igual.
Son errores que derivan de las características técnicas del instrumento, de los reactivos,
de un método experimental incorrecto, por ejemplo problemas de funcionamiento del
instrumento, un calibrado incorrecto, incumplimiento de las condiciones requeridas para
la medida, etc. Estos errores deben ser detectados y corregidos.
d) errores ilegítimos, es decir, errores de lectura de los instrumentos, equivocaciones en los
cálculos, falta de atención, disparates,…. Este tipo de error es inadmisible.
Además, para muchas magnitudes en Biología hay que tener en cuenta la denominada
variabilidad biológica. Con frecuencia no existe un valor verdadero único, sino un intervalo de
así llamados “valores normales”; por ejemplo, el nivel normal de glucosa en sangre en
humanos se describe como 72-145 mg/dl o 4-8 mmol/l. En medidas que presentan una
distribución simétrica normal (campana de Gauss), el intervalo de valores normales que
incluye el 95 % de la población se establece como media ± 2 SD (desviación estándar).

La información que obtenemos de los instrumentos debe ser anotada y evaluada de

modo crítico. Es fundamental que la expresión numérica de los resultados
experimentales sea correcta. En este contexto, hay que considerar varios aspectos:
- Cifras significativas: son los dígitos de un número que consideramos no nulos. Por
tanto, son las cifras que se han medido con certeza y se obtienen directamente del
 20
instrumento. Indican la precisión de la medida. Es importante recordar que la precisión
del resultado no aumenta cuando se hacen operaciones aritméticas.
Puesto que el número de cifras significativas en un resultado final no puede ser
mayor que él número de cifras significativas de las medidas experimentales realizadas,
a veces es necesario redondear el resultado numérico obtenido. Se redondea al
número de cifras significativas; si el número posterior al último dígito significativo es:
- 5 o mayor, se incrementa el último digito significativo en uno;
- 4 o menor, se deja el último digito significativo como estuviera.
Los dígitos posteriores al último dígito significativo se eliminan, si están detrás de la
coma decimal, o se sustituyen por ceros, si están antes de la coma decimal.
- Signo decimal: aunque en español el signo que indica los decimales es la coma, en el
ámbito científico (y en inglés) se emplea el punto. En este laboratorio utilizaremos el
punto como signo decimal.
- Unidades: un resultado numérico sin unidades es erróneo (excepto en el caso de las
pocas magnitudes que carecen de unidades, como el pH o la absorbancia). Cuando las
unidades son demasiado grandes o demasiado pequeñas, para evitar escribir muchos
ceros, se incluye un prefijo delante del símbolo de la unidad. Los prefijos comúnmente
utilizados en Bioquímica son:

Múltiplos Submúltiplos
Factor Prefijo Símbolo Factor Prefijo Símbolo
106 mega M 10 –3 mili m
103 kilo k 10 –6 micro μ
10 –9 nano n
10 –12 pico p
10 –15 femto f

- Expresión del error. El error, considerado como incertidumbre estimada de un

resultado experimental, se expresa en términos absolutos, como desviación media o
desviación estándar, o bien en términos relativos al valor medio, en la forma de:
- coeficiente de variación = 100 * (Desviación estándar/ Valor medio)
- diferencia en porcentaje = 100 * (Valor máximo- Valor mínimo)/ Valor medio

1.3.2. Presentación de datos: Tablas y Figuras

Tanto en el proceso de medida, como en él de cálculo de magnitudes derivadas, y, por
supuesto, en la presentación final de los resultados (cuaderno e informe), es imprescindible,
mantener los datos ordenados de manera que se puedan revisar con facilidad y sin errores,
así como organizarlos de forma que pueda observarse su tendencia o funcionalidad. Para ello
es necesario hacer uso extensivo de Tablas y Figuras. Para elaborarlas ténganse en cuenta
las siguientes consideraciones:
Tablas
1. Deben llevar una numeración que las identifique e ir precedidas por un encabezamiento
breve que indique cuál es su contenido
2. Los datos se ordenan por filas y columnas. Cada columna debe llevar un encabezamiento
que incluya nombre o símbolo de la magnitud y sus unidades entre paréntesis.
3. Si hay que incluir información adicional, se colocará debajo de la tabla
Figuras
Una Figura es un gráfico donde se relacionan dos magnitudes. Una de ellas es algo que el
 21
operador controla y se denomina variable independiente; normalmente se representa en el eje
X (abscisas). La segunda es la magnitud que cambia cuando el operador varía la variable
independiente; se denomina variable dependiente y se representa en el eje Y (ordenadas).
Las Figuras proporcionan una idea de la interdependencia de las magnitudes que se
representan y de su variación reciproca; además permiten suavizar el efecto del ruido
experimental. Es una buena práctica hacer una figura de trabajo, a mano, mientras se lleva a
cabo el experimento, a la vez que se almacenan los datos numéricos en forma de tabla;
permite decidir si hacen falta medidas adicionales, que puntos se desvían del comportamiento
general, en que intervalo de la variable independiente hay que concentrar las medidas, etc.

1. Las Figuras para el cuaderno de laboratorio tienen que hacerse a mano, en papel
milimetrado, y deben pegarse en el cuaderno en la posición adecuada. Pueden
dibujarse a lápiz o a bolígrafo, pero deben apreciarse con claridad y presentar un
aspecto limpio y cuidado.
2. Idealmente, serán un cuadrado de no menos de 10 cm de lado. Tienen que estar
numeradas, para poder identificarlas. Irán seguidas de una leyenda que describa su
contenido brevemente y con claridad.
3. Usualmente se toma como eje de abscisas la variable independiente y como eje de
ordenadas la variable dependiente. Ambos ejes deben llevar rótulos claros que
indiquen la magnitud que se representa y sus unidades. Seleccionar las unidades
adecuadas para que no aparezcan muchos ceros en las escalas. Los ejes llevarán
marcas con un espaciado regular y razonable para facilitar su lectura.
4. Escalas de los ejes. Hay que dedicar cierto tiempo a elegir la escala más adecuada. La
escala de cada eje debe ser constante y no estar demasiado comprimida, ni
expandida. Se procurará utilizar todo el espacio definido por los ejes; cuanto más
próxima quede la línea del gráfico a un ángulo de 45º, mayor será la precisión de los
datos obtenidos por interpolación en la misma. Considerar si es necesario que el
origen de coordenadas (0,0) aparezca en la figura, o si es conveniente usar una
escala logarítmica.
5. Los puntos experimentales deben representarse de forma que se distingan claramente
de las curvas (tamaño medio), así como unos conjuntos de datos de otros. Para ello,
conviene usar formas geométricas tales como: О, ■, Δ,▼, etc. , y asignar claramente
una forma dada a un conjunto de datos. Si se conoce el error asociado a una variable,
se emplearán barras de error (segmentos de recta centrados en el punto y con la
longitud del intervalo de confianza)
6. Es importante trazar la curva suave que “mejor” represente los puntos. Cuando se
conozca una ecuación teórica que pueda predecir el comportamiento del sistema,
conviene dibujarla como una curva continua, de forma que pueda observarse cuán
bien se ajustan los datos experimentales al comportamiento teórico; en lo posible, se
usará el criterio de mínimos cuadrados para obtener una ecuación que describa la
curva. Cuando no se conozca la ecuación que relaciona ambas variables, conviene
tener muy en cuenta los errores de los puntos experimentales, y no forzar a la curva a
que pase por todos los puntos medidos; a veces resulta incluso más conveniente no
trazar ninguna línea de tendencia.

1.3.3. Operaciones básicas (III)

 DILUCIONES [Consultar ficha y VIDEO]

La concentración de una disolución es la relación entre la cantidad de soluto disuelto y el
volumen o masa final de la disolución. Diluir es disminuir la concentración de la sustancia en
 22
disolución. Cuando se quiere hacer una dilución, se empieza con una determinada
concentración del soluto (C1) y se añade más disolvente. Puesto que al añadir disolvente el
volumen final de la disolución aumenta pero la cantidad de soluto no se modifica,
necesariamente la concentración de la disolución final (C2) es menor que la concentración
inicial.

Inicial Final

C1 = masa soluto / V1 C2 = masa soluto / V2

Hay dos modos sencillos de resolver todos los problemas de diluciones. Ambos métodos son
esencialmente iguales, aunque hay diferencias sutiles entre ellos.
 Método I – Al considerar que la cantidad de soluto es la misma antes y después de
diluir, llegamos a la ecuación:
C1 x V1 = C2 x V2
Este procedimiento funciona muy bien si uno define adecuadamente las variables y NO
OLVIDA: que V1 y V2 son volúmenes finales (antes y después de diluir, y nunca volumen
añadido) y que las unidades deben ser las mismas a un lado y otro del signo igual.
 Método II - El factor de dilución es un número, mayor que la unidad, que se calcula
dividiendo el volumen de la disolución final por el volumen de la disolución inicial.
volumen total final (V2) C1
Factor de dilución = ------------------------------------------ = ------
volumen inicial de muestra (V1) C2

Por consiguiente, la concentración de la disolución final es igual a la concentración inicial

dividida por el factor de dilución: C2 = C1 x (V1/V2) = C1 / factor de dilución
La dilución realizada se suele expresar de modo cuantitativo indicando la inversa del
factor de dilución (1/ factor de dilución). Así, cuando se dice que se ha hecho una “dilución de
10 veces”, o lo que es lo mismo una “dilución 1/10”, significa que a un volumen de la
disolución inicial se le han añadido 9 volúmenes más de disolvente, de este modo que el
volumen final será 10 veces mayor y la concentración final será 10 veces más baja que la
inicial.

Se denominan diluciones seriadas a una serie de diluciones en la que cada una de

ellas se prepara a partir de la dilución anterior. Cuando se hacen diluciones seriadas el factor
de dilución resulta especialmente útil, ya que la dilución total se obtiene multiplicando las
diluciones de las diversas etapas y la concentración de la disolución final se calcula dividiendo
la concentración inicial por los factores de dilución de las etapas sucesivas. En general,
cuando se requieren diluciones mayores de 1/10, se hacen diluciones seriadas en lugar de
 23
una única dilución. Hay situaciones en las que la concentración de una sustancia necesaria
para observar un efecto es extremadamente pequeña (por ejemplo, un fármaco, una
hormona, etc.) y difícilmente se pueden pesar o medir en esas cantidades tan pequeñas. En
tales casos, se recurre a la preparación de una disolución de alta concentración (disolución
madre) y a hacer diluciones seriadas a partir de la misma hasta obtener la concentración final
requerida.

 CURVAS DE CALIBRADO.
Calibrar es establecer con exactitud la correspondencia entre las indicaciones de un
instrumento de medida y los valores de la magnitud que se mide con él. La calibración es un
conjunto de operaciones que permiten establecer la relación entre la señal de salida del
sistema de medida (respuesta del instrumento) y los valores aceptados para los estándares o
patrones de calibración. Por ejemplo, ya sabemos que antes de usar el pHmetro, hay que
calibrarlo utilizando disoluciones de pH conocido.

Un gran número de métodos analíticos requieren la calibración de un instrumento, lo

que típicamente implica: la preparación de una serie de patrones conteniendo una cantidad
conocida del analito de interés, la medida de la respuesta del instrumento para cada patrón y
el establecimiento de la relación entre la respuesta del instrumento y la concentración de
analito presente. Esta correlación, denominada curva de calibrado, se utiliza para transformar
las medidas hechas sobre muestras problema en estimaciones de la cantidad de analito que
contienen. Las curvas de calibrado suelen poseer al menos un intervalo de respuesta lineal,
que se puede ajustar a la ecuación de una recta: Y = a + b CA
donde CA es la concentración del compuesto, Y es la señal medida o respuesta del
instrumento, “a” es la ordenada en el origen y “b” es la pendiente de la recta.

Curva de calibrado, mostrando el límite de

detección (LDD) y el límite de linealidad
(LDL).
LDL
Límite de detección (LDD), cantidad o
concentración mínima de una sustancia
Señal

que puede ser detectada con fiabilidad por

un método analítico, es decir, que su señal
LDD puede ser distinguida de la del ruido.
Pendiente (sensibilidad)
Sensibilidad de un método analítico,
capacidad para discernir pequeñas
ruido variaciones en la concentración del
compuesto a cuantificar. Así, la pendiente
Concentración de la recta de calibración es una medida
de la sensibilidad.

De modo general, la calibración y la obtención de la concentración del compuesto a

cuantificar presente en una muestra problema, constan de las siguientes etapas:
1. Preparación de los patrones. Hay que preparar una serie de disoluciones del compuesto
que cubran un intervalo de concentraciones adecuado y que estén en exactamente las
mismas condiciones experimentales que las muestras
2. Obtención de la relación señal-concentración. Se mide la señal analítica de los patrones,
habitualmente la absorbancia. La curva de calibrado se representa con la respuesta del
 24
instrumento en el eje vertical (Y) y las concentraciones sobre el eje horizontal (X). En el
intervalo lineal, se determina la recta que "mejor" se ajusta a los datos experimentales
mediante regresión por mínimos cuadrados. De esta forma se obtiene la pendiente (b) y la
ordenada (a) en el origen que definen la recta.
3. Uso de la curva de calibrado. Empleando exactamente las mismas condiciones
experimentales utilizadas para los patrones, se mide la señal analítica para las muestras.
La señal se interpola en la recta de calibrado para obtener el valor de la concentración del
compuesto en la muestra. Finalmente, si ha sido necesario diluir la muestra para que la
respuesta del instrumento se encuentre en el intervalo de linealidad de la curva, habrá que
considerar las diluciones realizadas para obtener la concentración de compuesto en la
muestra original.

PARTE PRÁCTICA

Objetivos
- Practicar la medida de volúmenes con micropipetas y el uso del agitatubos y colorímetro.
- Aprender a realizar los cálculos para la preparación de diluciones sencillas y seriadas.
- Preparar una curva de calibrado y utilizarla para determinar la concentración del
compuesto existente en distintas muestras problema.

Materiales y reactivos
Disoluciones de hemoglobina 0,2 y 1 mg/ml Tubos de ensayo
Tampón fosfato potásico 10 mM, pH 7,0 [Alumno] Colorímetro
Muestras problema de hemoglobina (A y B) Tubos/cubetas de colorímetro
Pipetas graduadas y aspirapipetas Micropipetas y puntas

EXPERIMENTO 3.1 Preparación de diluciones a partir de una disolución concentrada

A partir de una disolución de hemoglobina (Hb) de concentración 0,2 mg/ml, preparar por
duplicado 2 ml de las diluciones 1/2, 1/5, 1/10.
1. El diluyente será siempre tampón fosfato potásico 10 mM, pH 7,0 y cada muestra tendrá
un volumen final de 2 ml.
2. Para cada dilución calcular: el volumen en mililitros de hemoglobina 0,2 mg/ml y de
tampón necesarios, así como la concentración final de hemoglobina (mg/ml) en la
dilución preparada.

EXPERIMENTO 3.2 Preparación de diluciones seriadas

A partir de una disolución de hemoglobina de concentración 1 mg/ml, preparar por duplicado y
de manera seriada, es decir, partiendo para cada dilución de la disolución inmediatamente
anterior, 4 ml las diluciones que se muestran en la tabla siguiente.
1. Emplear como agente diluyente tampón fosfato potásico 10 mM, pH 7,0. Cada una de
las diluciones se preparará por duplicado, y cada tubo preparado presentará un volumen
final de 4 ml en el momento de preparar la dilución. Siempre que se mezclen dos
disoluciones de diferente concentración ha de agitarse bien para obtener una mezcla
homogénea.
2. Medir la absorbancia a 413 nm (máximo característico de las hemoproteínas) de cada
una de las diluciones preparadas. Usar el tampón fosfato 10 mM, pH 7,0 como blanco.
 25

Dilución Dilución Preparación muestras Concentr..

nº
global de cada Tampón Hb c Vol. total Hemoglob. A413
tubo
realizadaa etapa b (ml) (ml) (ml) (mg/ml)
1 – – 0 4 4 1,0 /
2 1/2 1/2 2 2 4 /
3 1/5 4 /
4 1/10 4 /
5 1/20 4 /
6 1/50 4 /
7 1/100 4 /
8 Blanco – 4 0 4 0 0
a Dilución respecto a la disolución inicial de hemoglobina (1,0 mg/ml)
b Dilución respecto a la disolución de hemoglobina preparada en la etapa previa
c Volumen requerido de la disolución de hemoglobina preparada en la etapa previa

EXPERIMENTO 3.3 Cuantificación de la concentración de hemoglobina en muestras

problema empleando una curva de calibrado
1- A partir de las diluciones seriadas preparadas, construir una curva patrón para la
hemoglobina, representando para cada dilución la absorbancia, en ordenadas, y la
concentración de hemoglobina (mg/ml), en abscisas.
2- Determinar la concentración de hemoglobina de dos muestras problema (muestras A y
B), midiendo su absorbancia a 413 nm e interpolando los valores en el tramo lineal de
la curva de calibrado previamente elaborada. Si la absorbancia medida no se
encuentra en el intervalo lineal de la curva, habrá que diluir convenientemente la
muestra problema antes de volver a medir la absorbancia..
3- Medir la absorbancia a 413 nm de las tres muestras preparadas en el experimento 3.1.
Determinar su concentración de hemoglobina empleando la recta patrón.

Resultados que deben figurar en el cuaderno de laboratorio

1. Cálculos para la preparación de las tres diluciones, indicando el volumen (ml) necesario de
la disolución madre de hemoglobina (0,2 mg/ml) y de tampón. Determinar la concentración
final en mg/ml de hemoglobina presente de las diluciones.
2. Completar la tabla correspondiente a las diluciones seriadas, indicando: la dilución parcial
que hay que hacer en cada etapa, el volumen necesario de tampón y de la dilución anterior
que hay que utilizar, y la concentración de hemoglobina (mg/ml) que presentará la dilución
preparada. Incluir los valores de absorbancia a 413 nm medidos para cada uno de los
duplicados de las diluciones seriadas preparadas.
 26
3. Dibujar la gráfica correspondiente a la curva de calibrado para la hemoglobina
(absorbancia a 413 nm frente a concentración en mg/ml). La representación se realizará
en papel milimetrado; incluir los puntos experimentales a un tamaño que permita
distinguirlos bien. En el tramo lineal de la curva, hacer un ajuste por mínimos cuadrados;
anotar la ecuación obtenida para la recta.
4. Muestras problema, A y B: registrar los valores de absorbancia a 413 nm y las
concentraciones de hemoglobina calculadas. Si es necesario preparar alguna dilución de
las muestras problema para poder medir, indicar cómo se hace.
5. Con las tres diluciones preparadas en experimento 3.1: registrar los valores de
absorbancia a 413 nm y las concentraciones de hemoglobina (mg/ml), determinadas
experimentalmente a partir de la recta de calibrado. ¿Corresponden los resultados a lo
esperado?

CUESTIONES COMPLEMENTARIAS
1- En el laboratorio se dispone de una disolución de NaOH 2 M y se necesitan 5 ml de
NaOH 10 mM. Describa como prepararía la segunda disolución y cuál es el factor de
dilución empleado.
2- Tras un proceso de purificación, dispone de 5 ml de una muestra con una concentración
de proteína 25 mg/ml. El protocolo experimental que se quiere aplicar indica que se
necesitan 0,5 ml de muestra con una concentración de proteína de 1 mg/ml, ¿qué haría?
3- ¿Qué volumen en mililitros tomaría de una disolución de proteínas cuya concentración es
de 3,2 mg/ml para tener 0,7 mg de proteína? ¿Qué volumen en microlitros tomaría de una
disolución de sacarosa al 4 % (m/v) para obtener 2 mg?
4- Partiendo de una disolución de proteína con una concentración de 1,5 mg/ml proponer
dos o más diluciones seriadas para obtener una disolución con una concentración de
0,0015 mg/ml.
5- Complete la tabla siguiente para preparar las diluciones seriadas indicadas en la misma.
La disolución inicial será albúmina de suero bovino (BSA) a una concentración de 10
mg/ml, y cada tubo debe contener un volumen final de 5 ml.
Volumen
Factor de Dilución Concentración
BSA (ml) H2O (ml) preparado
Global de Etapa (mg/ml)
(ml)
1
2,5
5
8
10
15
20

6- Considerar que una disolución al 40 % (m/m) de una proteína (Mr 9 000) en agua
presenta una densidad de 1,20 g/ml. ¿Qué volumen de esta disolución se necesitaría
para preparar 100 ml de una disolución de 400 μg/mL?
 27

1.4. DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA CONCENTRACIÓN DE

PROTEÍNAS

1.4.1. Espectrofotometría
Una parte importante del trabajo en el laboratorio de Bioquímica es la determinación
cuantitativa de compuestos biológicos. En Química, las técnicas analíticas suponen
mayoritariamente titulaciones y análisis gravimétricos (por pesada). Sin embargo, la técnica
de ensayo más relevante y ampliamente utilizada en Bioquímica es la espectrofotometría.
Las técnicas espectrofotométricas miden cuanta luz (radiación electromagnética en la
región ultravioleta-visible (UV-VIS) del espectro) absorbe una sustancia en disolución. Se
mide la cantidad de luz absorbida como función de la longitud de onda utilizada. La muestra
absorbe parte de la radiación incidente en este espectro y promueve la transición del
compuesto hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de luz de menor energía. La
absorción de la radiación UV-VIS depende de la estructura de las moléculas, afecta a los
electrones de valencia, y es característica de cada sustancia química. Así cuando un rayo de
luz monocromática de intensidad I0 pasa a través de una disolución contenida en un
recipiente trasparente, parte de la luz es absorbida de modo que la intensidad de la luz
emergente I es menor que I0. Esta pérdida de intensidad es atribuible en su mayor parte a la
absorción por la disolución, aunque también participan fenómenos tales como la dispersión de
luz debida a la presencia de partículas en la disolución o la reflexión de luz en las interfases.

Tanto la transmitancia (porcentaje de luz que emerge tras atravesar la disolución),

como la absorbancia (la luz absorbida por la disolución o la intensidad de color) pueden
utilizarse como indicadores de la concentración del compuesto existente en la cubeta. La
absorbancia se utiliza con mayor frecuencia porque presenta una relación lineal con la
concentración del compuesto. La ley de Lambert-Beer afirma que la absorbancia de una
disolución es proporcional a la concentración del compuesto que absorbe y a la longitud de
disolución que atraviesa la luz (ancho de la cubeta o paso óptico):

donde: I0, intensidad de luz incidente; I, intensidad de luz emergente; k, constante de

proporcionalidad; c, concentración de la disolución y l, paso óptico. El término Log I0/I es
conocido como absorbancia (A) o extinción (E). Su valor se obtiene directamente del
instrumento (colorímetro o espectrofotómetro); al ser un logaritmo, carece de unidades.
 28
Limitaciones. La ley de Lambert-Beer se cumple solo bajo ciertas condiciones:
- El haz de luz debe ser monocromático o al menos con un estrecho intervalo de λ.
- La longitud de onda de medida debe corresponder al máximo de absorción del
compuesto, lo que hace que la sensibilidad del método sea mayor.
- No deben producirse procesos de ionización, asociación, disociación o solvatación del
soluto cuando se varía la concentración o el tiempo.
- La proporcionalidad entre absorbancia y concentración solo se cumple para
disoluciones diluidas, cuyo valor de absorbancia es inferior a 1,0. Para cada
compuesto existe un umbral de concentración máxima aceptable.
Instrumentación. Las medidas espectrofotométricas se llevan a cabo habitualmente en la
región espectral entre 220 y 800 nm, la cual a su vez se subdivide en la región visible, por
encima de 380 nm, y la ultravioleta, por debajo de 380 nm. La región infrarroja, longitudes de
onda superiores a 800 nm, es de poca utilidad en los análisis bioquímicos. Los instrumentos
utilizados para medir absorbancias son:
 el colorímetro, relativamente sencillo y diseñado para medir en la región visible,
 el espectrofotómetro, más sofisticado, capaz de medir en la región visible y en la
ultravioleta; permite registrar espectros de absorbancia. [Consultar ficha]

Aspectos prácticos. El procedimiento para utilizar cada instrumento viene detallado en su

manual, pero hay algunos aspectos generales que hay que tener presentes:
1- Cubetas. Es el recipiente trasparente donde se introduce la muestra. Tiene dos caras
transparentes, las que atraviesa la luz, y dos caras no transparentes, por donde se maneja.
Para poder hacer las medidas, es necesario que estén perfectamente limpias.
Todas las cubetas absorben radiación electromagnética. Las cubetas de cuarzo, son las
más transparentes en la región ultravioleta, pero son caras y solo se utilizan en la UV lejano.
Las cubetas de cristal, mucho más baratas, se usan para la región visible. En la actualidad
existen cubetas desechables de plástico para medir en estas regiones del espectro.
2- Fuentes de luz. Una lámpara de tungsteno (halógena) produce energía radiante visible
hasta unos 360 nm (visible). Para obtener radiación de menor longitud de onda (región UV)
hace falta una lámpara de deuterio.
3- Blanco. Para realizar medidas de absorción es imprescindible utilizar siempre un
blanco o referencia que contenga todos los componentes de la disolución excepto el
compuesto a medir. El blanco permite descontar, a cada longitud de onda, la pérdida de
intensidad de luz debida a fenómenos distintos de la absorción, tales como la dispersión o la
reflexión de la luz.

1.4.2. Aplicaciones de la espectrofotometría UV-VIS

Los fenómenos descritos tienen varias aplicaciones:
 Espectros de absorción
Muchos compuestos biológicos absorben luz en el rango ultravioleta-visible (UV-VIS). Se
denomina espectro de absorción a una representación gráfica de la luz absorbida por un
compuesto en un intervalo de longitudes de onda y es característico de cada compuesto en
unas condiciones dadas. Experimentalmente, consiste en irradiar una disolución del
compuesto con un haz de luz a distintas longitudes de onda y medir el número de fotones de
cada λ que se pierden al atravesar la disolución.
Los espectros permiten obtener información sobre la naturaleza o estructura de la
molécula que absorbe. Muchos compuestos presentan espectros de absorción característicos
en la zona UV-VIS, lo que hace posible su identificación en una mezcla. Así, las proteínas
absorben a 280 nm de acuerdo con su contenido en triptófano y tirosina; también absorben en
 29
el ultravioleta lejano (190-220 nm) por el enlace peptídico. Los ácidos nucleicos presentan un
máximo de absorción a 260 nm debido a sus bases nitrogenadas. Algunas proteínas
conjugadas (con grupos prostéticos) absorben también en la zona visible del espectro, es
decir, sus disoluciones presentan color con máximos característicos.
 Determinación de la concentración de un compuesto en disolución
Dado que la absorbancia depende linealmente de la concentración, se puede determinar la
concentración de un compuesto en disolución acuosa midiendo su absorbancia. Para poder
aplicar este procedimiento y obtener concentraciones fiables, el compuesto tiene que estar
puro o, por lo menos, es necesario comprobar que los otros compuestos presentes en la
disolución no absorben a la longitud de onda de medida. Para establecer la concentración de
un compuesto en disolución empleando medidas de absorbancia se pueden emplear tres
aproximaciones:
a) Curva patrón. Si la relación entre absorbancia y concentración no es lineal, o no se
ha establecido que sea lineal, hay que utilizar una curva patrón. Para ello, preparar varias
disoluciones del compuesto de concentración conocida, medir sus absorbancias, hacer una
representación y estimar la concentración de la muestra problema por interpolación en la
gráfica. La curva patrón no se puede extrapolar más allá de la región para la que se ha
calibrado el instrumento.
b) Empleo de un estándar. Cuando se sabe con seguridad que existe una relación
lineal entre concentración y absorbancia, puede ser suficiente emplear un solo punto,
denominado patrón o estándar, para calcular la concentración de la muestra problema. Dicho
punto (concentración y correspondiente absorbancia) deben ser mayores que los de la
muestra problema. No hace falta dibujar una gráfica, es una pérdida de tiempo y de precisión.
Para el cálculo se emplea una relación (regla de tres), obtenida del modo siguiente:
Absm = k ꞏ cm ꞏ l Absm / Absst = cm / cst
Absst = k ꞏ cst ꞏ l cm = cst * (Absm / Absst)
c) Coeficiente de extinción. Cuando se trata de un compuesto que absorbe a una
longitud de onda característica y se conoce el valor de la constante k correspondiente, se
puede calcular directamente la concentración empleando la ecuación de Lambert-Beer. Para
ello, hay que medir la absorbancia a dicha longitud de onda. Se utiliza EL COEFICIENTE DE
EXTINCIÓN MOLAR o ε, definido como la absorbancia que, teóricamente, presentaría una
disolución 1 M del compuesto, con 1 cm de paso óptico; sus unidades son: M–1 cm–1. Es una
constante característica del compuesto, cuyo valor está tabulado; por ejemplo, el coeficiente ε
para el NADH a 340 nm es 6,22 x 103 M–1 cm–1.
Concentración (mol/litro) = Abs / [ε ꞏ paso óptico (cm)]
Cuando se emplean concentraciones expresadas en mg/ml, se utiliza un COEFICIENTE DE
EXTINCIÓN ESPECÍFICO o E0,1 %, definido como el valor de absorbancia de una disolución
del compuesto al 0,1 % (m/v), es decir, a una concentración de 1 mg/ml, con un paso óptico 1
cm. Conviene recordar que el coeficiente de extinción de cualquier cromóforo depende, entre
otros factores, del entorno en que se encuentre dicho cromóforo, por ejemplo, de su
exposición al disolvente.
 Colorimetría
Muchos experimentos en Bioquímica suponen la cuantificación de un compuesto o grupo de
compuestos presentes en una mezcla compleja. Con frecuencia los métodos utilizados para
determinar la concentración de tales compuestos no se basan en una medida directa de
absorción, sino en el cambio colorimétrico producido al reaccionar el compuesto de interés
con otro(s) reactivo(s). Posteriormente se mide la absorción del producto coloreado de la
reacción y, con la ayuda de una curva patrón, se puede determinar la concentración de la
 30
sustancia en la disolución original. De este modo, se consigue que compuestos que no
presentan color por sí mismos, absorban luz en la zona visible del espectro tras reaccionar
con los reactivos adecuados.
En los procedimientos colorimétricos la intensidad del color producido depende de las
condiciones experimentales empleadas para originar el compuesto coloreado. Por tanto, no
existe un coeficiente de extinción y hay que calcular la concentración a partir de una curva
patrón. Es importante no olvidar que en este contexto la palabra estándar o patrón debe
entenderse como “hay que hacer exactamente lo mismo con todos los tubos”. La única
variable debe ser la concentración del compuesto que se quiere cuantificar y da lugar al color.
Puesto que el volumen final es el mismo en todos los tubos, no solo la concentración (mmol/l,
mg/ml, etc.), sino la cantidad del compuesto (mmol, mg, etc.) será proporcional a la
absorbancia. Por eso, en las curvas patrón de los ensayos colorimétricos se representa la
absorbancia frente a la concentración del compuesto en el volumen inicial de muestra o,
incluso, frente a la cantidad absoluta del compuesto (mmol, mg, etc.) presente en la muestra.
Los métodos colorimétricos presentan ciertas ventajas:
- No requiere que la sustancia que se quiere medir esté pura, ya que la reacción de
formación del producto coloreado suele ser muy específica.
- En general, son métodos muy sensibles, que permiten detectar concentraciones menores
de la sustancia que las que se requieren para la medida directa.
- El cambio de color producido se puede medir en un colorímetro, no es necesario disponer
de un espectrofotómetro.
También presentan inconvenientes:
- La muestra se destruye en el proceso de medida.
- Es imprescindible disponer de una curva patrón obtenida en exactamente las mismas
condiciones experimentales que las muestras.
- Los valores de absorbancia tienen que poderse interpolar en la curva patrón. La pérdida
de linealidad con la concentración de la curva patrón puede deberse tanto a que se supere
la capacidad óptica del instrumento, como a que no hay reactivo colorimétrico suficiente
para originar más producto coloreado (efecto Job).

1.4.3. Determinación cuantitativa de la concentración de proteínas

La cuantificación de la concentración de proteína total de una muestra biológica es uno de los
procedimientos que se lleva a cabo con mayor frecuencia en un laboratorio de Bioquímica.
Existen varios métodos con diferentes ventajas e inconvenientes.
 Valoración espectrofotométrica
Este método solo se utiliza cuando se dispone de la proteína pura. Consiste en medir la
absorbancia que presenta la disolución de la proteína a una longitud de onda específica. Los
aminoácidos aromáticos, especialmente triptófano y tirosina, presentan una banda de absorción
alrededor de 280 nm. Por ello, todas las proteínas que contienen residuos aromáticos (o
cofactores que absorban en la zona ultravioleta) presentan un coeficiente de extinción propio y
característico a 280 nm, que se puede emplear para calcular su concentración cuando se mide
la absorbancia de una disolución de la proteína pura. Se conoce el valor del coeficiente de
extinción molar a 280 nm de muchas proteínas. El coeficiente de extinción E280 0,1 % (o A2801 mg/ml)
para la mayor parte de las proteínas se encuentra entre 0,4 y 1,5. Este método de valoración es
sencillo, relativamente sensible (límite de detección 10 μg/ml), y no destructivo aunque presenta
interferencias por la presencia de otros compuestos que absorban a 280 nm.
Por otra parte, la medida de absorbancia a 280 nm se utiliza también para estimar de
modo relativo el contenido en proteína de las fracciones en las cromatografías. Una buena
 31
aproximación en este caso (mezcla compleja de proteínas) es considerar que una disolución con
una absorbancia a 280 nm de 1,0 presenta una concentración de aproximadamente 1 mg/ml.
1. Valoraciones colorimétricas
Estos procedimientos se emplean para mezclas complejas de proteínas o muestras con
proteínas y otros compuestos. Se basan en hacer reaccionar la disolución conteniendo una
mezcla heterogénea proteínas con un reactivo específico que reacciona con las proteínas
originando un producto coloreado. La concentración del producto coloreado se mide
espectrofotométricamente y la intensidad del color se relaciona con la cantidad de proteína
existente mediante una curva de calibrado. En general, estos métodos no proporcionan valores
absolutos de concentración, ya que el desarrollo del color es al menos parcialmente dependiente
de la composición de aminoácidos de las proteínas presentes en la muestra y se ve afectado por
la presencia de grupos prostéticos. La curva patrón también difiere según la proteína que se use
para construirla (normalmente albúmina de suero bovino (BSA) o inmunoglobulina). Son
procedimientos en los que se destruye la muestra analizada.
Método de Biuret. En condiciones alcalinas, el ión Cu2+ (como sulfato cúprico) forma un
complejo violeta-púrpura con el nitrógeno del enlace peptídico de las proteínas y péptidos. La
reacción es poco sensible (1 a 6 mg/ml), pero es rápida. Es el único de procedimiento
colorimétrico cuya respuesta es independiente de la composición de aminoácidos de la muestra.
Método de Lowry (Folin-Ciocalteau). El fundamento del método no se conoce con detalle;
combina la reacción en medio alcalino de los iones cúpricos (Cu2+) con los grupos NH de los
enlaces peptídicos (reacción de Biuret), con la oxidación de las cadenas laterales de los
residuos de tirosina y triptófano que reducen al reactivo de Folin-Ciocalteau dando lugar a un
complejo de intenso color azul. La producción de color es máxima a pH 10. Es un procedimiento
sensible (límite 10 μg/mL) y muy específico. Las desventajas son: tiempos largos de incubación,
bastantes interferencias y variación de la intensidad de color en función de la proteína de que se
trate. Se sigue utilizando debido a la fiabilidad de sus resultados especialmente cuando se
necesita determinar la concentración de proteínas de mezclas de proteínas o extractos crudos.
Método de Bradford. Se basa en la unión del colorante azul de Coomassie Brillante a las
proteínas en medio ácido, lo que produce un desplazamiento en el máximo de absorción del
colorante hasta 595 nm. La unión del colorante a las proteínas depende fundamentalmente de
los aminoácidos básicos arginina y lisina. El método es sensible (hasta 20 μg/mL), simple, rápido
y barato, pero muestra algunas interferencias y la producción de color varía mucho según de
que proteína se trate.
Método de BCA, Depende de la conversión de Cu2+ en Cu1+ en medio alcalino (reacción
de Biuret); los iones Cu1+ se detectan por reacción con el ácido bicinconínico (BCA) para dar un
complejo de intenso color púrpura. Es un método sencillo, rápido, muy sensible (0,5 μg/mL) y
que muestra gran tolerancia con los compuestos que afectan a los otros métodos. El color no es
totalmente estable con el tiempo.

PARTE PRÁCTICA

Objetivos
- Aprender el fundamento y manejo de colorímetros y espectrofotómetros.
- Conocer los principales métodos espectrofotométricos y colorimétricos de determinación
de la concentración de proteínas.
- Determinar la concentración de proteínas de una muestra por un método colorimétrico.
 32
- Establecer espectrofotométricamente la concentración de proteínas de una disolución
patrón de albúmina de suero bovino.

EXPERIMENTO 4.1 Determinación de la concentración de proteínas de una muestra

mediante el método de Lowry
Materiales y reactivos
Tubos, pipetas, micropipetas, Vortex
Reactivo A de Lowry: Na2CO3 al 2 % (m/v) en NaOH 0,1 M
Reactivo B de Lowry: CuSO4 5H2O al 0,5 % (m/v), en tartrato sódico-potásico al 1 % (m/v)
Reactivo C de Lowry: 50 partes de reactivo A y 1 parte de reactivo B
[se prepara en el momento de usarla]
Reactivo de Folin-Ciocalteau: disolución comercial de tungstato sódico y molibdato sódico en
ácido fosfórico y clorhídrico (dilución 1/2 con agua) [ya preparado]
Patrón: Disolución de albúmina de suero bovino (BSA) de concentración 0,5 mg/ml

Para construir la curva patrón del método se utilizarán disoluciones estándar de albúmina
de suero bovino (BSA, bovine serum albumin) de concentración conocida y se aplicará el
protocolo del método. Para conocer la concentración de proteína de una muestra problema se
seguirá exactamente el mismo protocolo, usando 0,5 ml de la muestra problema. A veces será
necesario diluir adecuadamente una alícuota de la muestra problema, de modo que la
concentración de proteína de la dilución quede dentro del intervalo lineal de la curva de
calibrado. La dilución de la muestra tiene que ser previa al ensayo colorimétrico, y una vez
preparada, se aplicará el protocolo a un volumen de 0,5 ml de la dilución.

Protocolo
0,5 ml MUESTRA
+ 2,5 ml Reactivo C
Agitar e incubar 15 min

+ 0,25 ml Reactivo de Folin (dilución 1/2)

Agitar e incubar 30 min

Leer absorbancias a 750 nm frente a blanco colorimétrico

Procedimiento
1. Rotular 15 tubos de ensayo según las Tablas siguientes
2. Curva patrón. En los 11 primeros pipetear los volúmenes de agua destilada y de la
disolución de BSA 0,5 mg/ml indicados en la primera Tabla.
3. Muestra problema. Preparar dos diluciones de la muestra problema con agua destilada,
denominadas W y Z en la tabla. Anotar con detalle cómo se han preparado estas
diluciones, y tener en cuenta que el volumen final que se prepara de cada dilución debe
ser superior a 1 ml. Pipetear 0,5 ml de la dilución W en los tubos 12 y 13 y 0,5 ml de la
dilución Z en los tubos 14 y 15.
4. Preparar reactivo C de Lowry para 20 ensayos, mezclando 50 partes del reactivo A y una
del reactivo B; anotar cómo se hace. Tras mezclarlo bien, añadir 2,5 ml de reactivo C a
cada uno de los tubos previamente preparados y agitar en el Vortex.
5. Incubar 15 min a temperatura ambiente.
 33
6. Añadir a cada tubo 0,25 ml del reactivo de Folin-Ciocalteau diluido ½. Agitar en Vortex e
incubar 30 min a temperatura ambiente.
7. Determinar la absorbancia a 750 nm de todas las muestras, de menor a mayor
concentración. Previamente, ajustar el cero de absorbancia con el blanco colorimétrico.

Tablas de pipeteos para la curva de calibrado y muestra problema:

Tubo Conc. BSA Agua Volumen Reactivo Folin

nº Proteína 0,5 mg/ml destil. muestra C [*] (ml) [**] A750
(mg/ml) (ml) (ml) (ml) (ml)
1 --- 0,5 0,5 2,5 0,25
2 0,025 0,475 0,5 2,5 0,25
3 0,05 0,45 0,5 2,5 0,25
4 0,075 0,425 0,5 2,5 0,25
5 0,1 0,4 0,5 2,5 0,25
6 0,15 0,35 0,5 2,5 0,25
7 0,2 0,3 0,5 2,5 0,25
8 0,25 0,25 0,5 2,5 0,25
9 0,3 0,2 0,5 2,5 0,25
10 0,4 0,1 0,5 2,5 0,25
11 0,5 -- 0,5 2,5 0,25
Volumen total 2,05 3,45 27,5 2,75
necesario (ml)

[*] Agitar y dejar reposar 15 min. [**] Agitar y dejar reposar 30 min.

Tubo Dilución de la Volumen Reactivo Folin

nº muestra problema muestra C [*] (ml) [**] A750
(ml) (ml)
12 0,5 2,5 0,25
Dilución W
13 0,5 2,5 0,25
14 0,5 2,5 0,25
Dilución Z
15 0,5 2,5 0,25
Volumen total 10 1
necesario (ml)

ELIMINACIÓN DE RESIDUOS: una vez medida la absorbancia el contenido de los tubos

de ensayo se desechará en el bidón de “RESIDUOS DE FOLIN”.

Tabla de resultados
Concentración de proteínas (mg/ml)
Dilución
A750 de la Dilución de la Muestra original Conc. final
preparada
W

Z
 34

Resultados
1. Calcular la concentración de BSA en mg/ml existente en los 0,5 mililitros de muestra de
las disoluciones preparadas para la curva patrón (tubos 2 al 11).
2. Representar gráficamente en papel milimetrado la absorbancia a 750 nm frente a la
concentración de proteína en mg/ml de cada una de las disoluciones patrón de BSA.
3. A partir de la curva patrón obtenida, determinar la concentración proteica de la muestra
problema. Para ello, interpolar los valores de absorbancia de las diluciones W y X y
teniendo en cuenta la dilución realizada en cada caso, expresar en mg/ml la
concentración de proteína de la muestra problema original. El resultado final debe ser una
única concentración para la muestra problema original.

EXPERIMENTO 4.2 Determinación de la concentración de la disolución patrón de BSA

La concentración de la disolución original de BSA, utilizada para preparar la curva patrón, se
puede determinar midiendo su absorbancia a 280 nm. Para ello, se requiere un
espectrofotómetro, cubetas para medir en la región del UV y saber que una disolución 1 mg/ml
de BSA pura presenta una absorbancia a 280 nm de 0,66, es decir que para esta proteína el
coeficiente E0,1 % 280 nm = 0,66 (mg/ ml)–1 ꞏ cm –1.
Procedimiento
1. Medir la absorbancia a 280 nm de la disolución de BSA 0,5 mg/ml. Emplear agua
destilada como blanco o referencia.
2. Diluir 1/2 con agua destilada la disolución de BSA 0,5 mg/ml y medir su absorbancia a
280 nm.

Resultados que deben figurar en el cuaderno de laboratorio

1. Indicar cómo se prepara la dilución 1/2 y anotar los valores de absorbancia obtenidos.
2. Calcular de la concentración de proteína existente en la disolución de BSA empleada para
construir la recta patrón.
3. Determinar el coeficiente de extinción molar para la BSA a 280 nm a partir del coeficiente
de extinción E0,1 % 280 nm previamente indicado.
 35

CUESTIONES COMPLEMENTARIAS

1- Necesita medir la absorbancia a 413 nm de unas muestras de hemoglobina y el

espectrofotómetro está apagado. Indique cómo procedería.
2- Una disolución tiene una transmitancia (I/Io) de 0,10 a cierta longitud de onda. (a)
Determinar su absorbancia. (b) Si su concentración es de 0,020 g / l, su masa molecular
de 100 y su transmitancia fue medida en celdas de 1,0 cm, determinar su coeficiente de
extinción molar. (c) Calcular la transmitancia para una disolución que tenga la decima
parte de concentración pero se mida en cubetas de 5,0 cm.
3- Una disolución al 0,1 % (m/v) de una proteína de Mr = 8000 presenta una absorbancia a
280 nm de 0,680, en una cubeta de 1 cm de paso óptico. Calcular el coeficiente de
extinción molar (M–1 cm–1) a dicha longitud de onda.
4- ¿Qué factor habría que emplear para diluir una disolución de NADH 4 mM para poder
medir con precisión su absorbancia a 340 nm (Abs ≈ 0,5) en una cubeta de 1 cm de paso
óptico, si el coeficiente de extinción molar del NADH es 6,22 x 103 M–1 cm–1?
5- Se quiere determinar la concentración de proteína de una muestra problema. Para ello se
ha empleado el método colorimétrico de Lowry. Tras seguir estrictamente el protocolo, se
ha medido la absorbancia a 750 nm de una serie de disoluciones con concentración
conocida de BSA, así como de tres diluciones de la muestra problema. Las medidas de
absorbancia se recogen en la Tabla.

Las diluciones seriadas de la muestra problema

se prepararon del modo siguiente: BSA Abs 750 nm
- dilución X: (mg/mL)
0,2 mL muestra + 1,8 mL de agua destilada 0,01 0,057 0,062
- dilución W: 0,02 0,138 0,142
0,5 mL dilución X + 0,5 ml de agua destilada 0,03 0,194 0,193
- dilución Z: 0,05 0,331 0,335
0,2 mL dilución W + 0,8 ml de agua destilada 0,075 0,485 0,493
0,10 0,644 0,649
Dilución Z 0,021 0,043
Dibujar la recta patrón en el papel milimetrado y calcular
Dilución W 0,263 0,258
la concentración de proteína de la muestra problema.
Dilución X 0,518 0,512

6- Una muestra de proteína (0,3 ml) se diluye con 0,9 ml de agua. A 0,5 ml de esta
disolución diluida, se le añaden 4,5 ml de reactivo de Biuret y se incuba a temperatura
ambiente para que se desarrolle el color. La absorbancia de la mezcla a 540 nm era 0,18.
Una disolución estándar (0,5 ml, concentración 4 mg/ml) a la que se añadieron 4,5 ml de
reactivo de Biuret daba una absorbancia de 0,12. Calcular la concentración de proteína
en la muestra inicial.
 36

1.5. MUESTRAS BIOLÓGICAS

1.5.1. Obtención, manejo y conservación de muestras biológicas
La Bioquímica es una ciencia experimental. Gran parte de sus estudios de laboratorio se
realizan in vitro, es decir que no se trabaja con un animal o planta completo, sino que se
llevan a cabo experimentos con material procedente de un ser vivo en un entorno físico y
químico artificial. Una muestra biológica es una preparación que contiene material procedente
de un ser vivo; puede ser una preparación enzimática, un homogeneizado total de un órgano,
una fracción subcelular, microorganismos intactos, etc. Es importante elegir las condiciones
experimentales más adecuadas para mantener la estructura, las funciones y las interacciones
propias del sistema que se quiere estudiar. La obtención de resultados fiables en el
laboratorio requiere no sólo aplicar técnicas analíticas reproducibles y precisas, sino el más
extremado cuidado en las etapas iniciales de la obtención de muestras.
La vida se desarrolla en medio acuoso. En el laboratorio se suelen emplear
disoluciones acuosas de composición conocida que cubren los requerimientos básicos y que
varían según la muestra y el estudio a realizar. Cuando se trabaja con células o orgánulos
subcelulares es fundamental mantener condiciones iso-osmóticas, un pH apropiado, niveles
de ciertos iones inorgánicos como el Mg2+, etc. Por el contrario, si se ha homogeneizado un
tejido (roto su estructura para liberar el contenido intracelular) puede ser conveniente inactivar
las proteasas o las nucleasas usado agentes quelantes (EDTA o EGTA para eliminar Ca2+ o
Mg2+) o bien inhibidores específicos (PMSF, TPCK). A veces se añaden al medio
antioxidantes (beta-mercaptoetanol o ditiotreitol), ya que muchas proteínas necesitan
mantener sus grupos sulfhídrilo reducidos. En ciertos casos, se emplean medios orgánicos
para la extracción de componente apolares, como proteínas hidrofóbicas o lípidos.
Aspectos prácticos:
- Es necesaria una identificación clara y precisa de las muestras, de modo que se sepa en
todo momento con qué se está trabajando y permita localizarlas en su sitio de
almacenamiento.
- Protección personal: evitar el contacto directo con las muestras (gafas, guantes,
mascarillas, batas, etc.) ya que algunas pueden causar enfermedades o alergias.
- Protección de las muestras: hay que conservar la integridad de la muestra evitando su
degradación (temperatura, luz, enzimas presentes en la muestra, etc.) y la contaminación
microbiológica o por otros materiales.
- Conservación y almacenamiento de muestras para su posterior análisis. El proceso de
almacenamiento debe preservar la integridad de la muestra a corto y/o largo plazo. A
veces es necesario adicionar al medio agentes conservantes, tales como azida, glicerol, o
dimetilsulfóxido (DMSO). Las muestras se conservan en nevera (4ºC), congeladas a baja
(-20 a -40ºC), muy baja temperatura (-80ºC) o en nitrógeno líquido (-196ºC). En general, la
temperatura es más baja cuanto más delicada es la muestra o más tiempo se quiere
conservar.

Precauciones en el manejo de muestras proteicas:

- Las disoluciones de proteína diluidas generalmente son más inestables que las
concentradas. Por tanto, conviene mantener disoluciones concentradas y diluir solamente
la cantidad de muestra que se vaya a utilizar de modo inmediato.
- Como regla general, las preparaciones de proteína deben manipularse en frío (0-4ºC). Por
ello, conviene mantenerlas en baño de hielo-agua y diluirlas con tampones previamente
enfriados.
- La agitación enérgica de una disolución de proteína puede dar lugar a su
desnaturalización. Evitar la formación de espuma.
 37
- Los procesos de congelación y descongelación repetidos producen desnaturalización.
Conviene conservar las muestras en pequeñas alícuotas y descongelar únicamente lo que
se vaya a usar.
- Los viales que contienen proteínas liofilizadas (o cofactores como NADH, ATP, etc.) deben
atemperarse a temperatura ambiente antes de abrirse. Esto evita la condensación de la
humedad en el polvo liofilizado.

1.5.2. Técnicas para la preparación de muestras biológicas

Las muestras biológicas, al igual que los seres vivos, están compuestas por macromoléculas
y moléculas pequeñas, tales como metabolitos, iones y agua. Entre 60 y 80 % de la masa
total de las células es agua; de la masa seca el 50 % corresponde a proteínas. Un
prerrequisito para llevar a cabo estudios estructurales y algunos análisis funcionales es
disponer de la proteína altamente purificada. Puesto que ésta no se encuentra normalmente
así en la Naturaleza, se han desarrollado una serie de procedimientos de laboratorio que
permiten la extracción, concentración y purificación de las proteínas celulares. A continuación
se exponen algunas técnicas básicas que se emplean para la concentración, cambio de
disolvente y fraccionamiento de disoluciones proteicas.

1.5.2.1. Precipitación de proteínas

Los métodos para separar proteínas se clasifican en dos grandes grupos: i) precipitación,
procedimientos que dividen las proteínas en dos fases, normalmente sólida (precipitado o
sedimento) y líquida (sobrenadante), y ii) fraccionamiento, métodos que fraccionan las
proteínas por sus diferencias en la velocidad de movimiento a través de un material
(cromatografía y electroforesis). La capacidad de resolución de los métodos que dividen las
proteínas en dos fases es mucho menor, pero son más fáciles de usar con grandes
cantidades de material, por lo que habitualmente estos procedimientos se utilizan en las
primeras etapas del aislamiento de proteínas.
Algunas técnicas de precipitación de proteínas explotan las diferencias en la
estabilidad frente al calor, pH extremos o composición del medio, y dan lugar a la pérdida de
la conformación nativa de las mismas. Las proteínas desnaturalizadas agregan y precipitan.
Estos procedimientos se utilizan para concentrar las proteínas y/o eliminar iones o agentes
que interfieren en la cuantificación de proteínas o en la electroforesis en geles. También se
emplean cuando se quiere eliminar las proteínas de muestras biológicas con objeto de poder
determinar metabolitos o otros compuestos.
Otros métodos, basados en diferencias de solubilidad, precipitan la forma nativa de la
proteína que se vuelve insoluble por agregación, pero sin desnaturalizarse; para preservar la
actividad de la proteína, la precipitación se lleva a cabo a baja temperatura. En cuanto a su
solubilidad, las proteínas difieren en el número de aminoácidos cargados, polares e
hidrofóbicos que presentan en su superficie. Un polielectrolito, por ejemplo una proteína, es
soluble gracias a que en su superficie los grupos polares y cargados están solvatados por
moléculas de agua, mientras que los residuos hidrofóbicos permanecen enmascarados por
moléculas de agua que se disponen como una red ordenada, estabilizada por puentes de
hidrógeno. Puesto que la solubilidad depende de la solvatación de sus grupos polares y
cargados, las distintas proteínas precipitan de modo diferente cuando se añaden a la
disolución sales neutras o disolventes orgánicos.
Si a una disolución acuosa de proteínas se le añaden grandes cantidades de una sal,
las moléculas del disolvente quedan tan fuertemente ligadas por estos nuevos iones que no
podrán solvatar a las moléculas de proteína. En éstas, las regiones hidrofóbicas quedarán al
descubierto y tenderán a interaccionar con las regiones hidrofóbicas de otras moléculas de
 38
proteína, por lo que agregarán y precipitarán. Este fenómeno se denomina precipitación por
salado ("salting out") y constituye una técnica muy útil para fraccionar proteínas, pues cada
proteína precipitará, en función de su composición y su estructura, a una determinada
concentración salina. Las primeras proteínas en precipitar son aquellas que tienen más
residuos hidrofóbicos expuestos en su superficie.
El fraccionamiento con disolventes orgánicos se basa en las diferencias de solubilidad
de las proteínas en disoluciones acuosas que contienen disolventes orgánicos miscibles con
el agua, tales como etanol, acetona o metanol. El disolvente orgánico disminuye la constante
dieléctrica del medio y elimina el agua de solvatación de los grupos cargados y polares, de
modo que la agregación de las proteínas ocurre por interacciones iónicas. Las proteínas
precipitan en orden decreciente de número de residuos cargados en su superficie.
El fraccionamiento por precipitación isoeléctrica se basa en la observación de que las
proteínas presentan un mínimo de solubilidad en su punto isoeléctrico. A dicho pH el número
de cargas positivas y negativas de la proteína es el mismo y las repulsiones intermoleculares
por carga se minimizan, favoreciéndose la interacción entre cargas opuestas de diferentes
proteínas.

1.5.2.2. Diálisis y filtración molecular

La filtración convencional separa el material particulado del líquido, haciendo pasar las
suspensiones a través de un material poroso. La filtración molecular hace referencia a la
filtración (separación) de compuestos a escala molecular. Las membranas semipermeables
permiten que ciertas moléculas o iones pasen a través de ellas por difusión y mientras que
otras no son capaces de atravesarlas. Son membranas con un tamaño de poro específico que
separan las moléculas disueltas en función de su tamaño molecular. Dependiendo del tamaño
de las moléculas que se desee separar se pueden utilizar membranas comerciales con
distinto tamaño de poro (“cut-off”).
El método mejor conocido de filtración molecular es la diálisis, en la que una disolución
acuosa que contiene moléculas de distintos tamaños, se coloca en el interior de una bolsa de
diálisis (material poroso como colodión, celofán, celulosa, etc.); a su vez la bolsa se sumerge
en un gran volumen de un tampón de fuerza iónica baja. Las moléculas menores que el
tamaño de poro de la membrana pasan libremente a través de la misma hasta alcanzar el
equilibrio de concentración dentro y fuera de la bolsa. El líquido externo debe mantenerse en
agitación y cambiarse varias veces para conseguir dentro de la bolsa la composición final
requerida. El agua pasa libremente a través de la bolsa dando lugar a concentración o
dilución, en función de si la disolución interna se encuentra más o menos concentrada que la
externa (efecto osmótico). Esta técnica se utiliza habitualmente para eliminar de una
disolución de macromoléculas sales, moléculas pequeñas, cofactores, etc., lo que permite
modificar la composición del medio en el que se encuentran disueltas. Es una técnica barata,
sencilla y efectiva, pero requiere tiempos relativamente largos.
Una variación es la diálisis inversa, que se emplea para concentrar el material dentro
de la bolsa. La bolsa de diálisis conteniendo la muestra se entierra en un polímero seco y
soluble en agua, que no pueda atravesar la membrana, por ejemplo, polietilenglicol; como
consecuencia el agua sale de la bolsa para equilibrarse con la fase externa seca y las
macromoléculas permanecen en el interior de la bolsa. La ultrafiltración es una variedad de
filtración en la cual la fuerza centrífuga o la presión fuerzan el paso del líquido a través de una
membrana semipermeable. Los sólidos en suspensión y los solutos de mayor peso molecular
quedan retenidos en la membrana, mientras que el agua y los solutos de bajo peso molecular
pasan a través de la membrana. Se utiliza para concentrar macromoléculas, clarificar
disoluciones o incluso esterilizarlas.
 39
1.5.2.3. Liofilización
La liofilización es la eliminación mediante sublimación del disolvente de una muestra
previamente congelada. Este proceso consistente en el paso directo del agua del estado
sólido (hielo) al estado gaseoso (vapor de agua), se consigue trabajando en condiciones de
baja presión y temperatura. La liofilización concentra tanto macromoléculas como moléculas
pequeñas siempre que no sean volátiles. Esta técnica se emplea para la concentración de
material termolábil. Es de gran utilidad en la conservación de productos biológicos, químicos,
alimenticios, etc., evitando que sus cualidades originales se alteren. Las principales ventajas
pueden resumirse en que la muestra liofilizada presenta: una estabilidad óptima, una
solubilidad fácil, rápida y completa, una conservación ilimitada, una buena protección contra
las influencias externas nocivas, y una rápida disponibilidad de uso.
La liofilización se lleva a cabo en un aparato denominado liofilizador [Consultar ficha].
El procedimiento para liofilizar una muestra biológica es el siguiente:
- La disolución se congela en nitrógeno líquido, lo que permite una congelación rápida y a
muy baja temperatura (–196oC). Una vez congelada la muestra, se introduce en el
interior de la cámara de desecación (vaso de liofilizado).
- La cámara de desecación se conecta al liofilizador, de este modo el vacío producirá la
sublimación del hielo de la muestra desprendiéndose como vapor de agua que queda
retenido en las paredes del condensador.
- Se deja que el proceso de liofilización continúe hasta que el producto esté totalmente
deshidratado. Una vez completado el proceso, se desconecta la cámara de desecación
del sistema de vacío, dejando entrar aire de forma muy lenta, a fin de evitar pérdidas
originadas por la posible volatilización de las muestras.

PARTE PRÁCTICA

Objetivos
- Aprender a utilizar la centrifuga de mesa y el liofilizador.
- Conocer los principios básicos del manejo de muestras biológicas
- Utilizar técnicas de precipitación, fraccionamiento y concentración de proteínas.

EXPERIMENTO 5.1 Precipitación fraccionada de proteínas con sulfato amónico

La forma de hacer este fraccionamiento es ir añadiendo, de forma controlada, sulfato
amónico a una disolución de proteínas, de manera que vaya aumentando gradualmente la
concentración de sal y precipiten selectivamente las proteínas cada una a la concentración de
sales (o porcentaje de saturación) que le corresponde. El sulfato amónico se puede añadir
sólido o ya disuelto (a partir de una disolución madre de máxima concentración) hasta
conseguir el porcentaje de saturación deseado; se mantendrá la mezcla en agitación dentro
de un baño de hielo, hasta que se disuelva toda la sal y se homogeneice la mezcla.
Posteriormente, se centrifuga la mezcla para separar las proteínas precipitadas de las que se
mantienen en disolución.
Una vez separados sedimento y sobrenadante, y, teniendo en cuenta el volumen de
este último, se añade de nuevo cierta cantidad de sales para alcanzar un porcentaje de
saturación mayor. Se agita a homogeneidad, se centrifuga para separar el material soluble del
precipitado y así, sucesivamente, se van separando las proteínas en función de la
concentración salina a la que precipitan. Las proteínas sedimentadas en cada una de las
etapas de este proceso, pueden ser recuperadas nuevamente en estado soluble, mediante la
 40
resuspensión del sedimento correspondiente en un líquido. Posteriormente, se puede
introducir una etapa de diálisis para eliminar el exceso de sales.
La utilización de sulfato amónico presenta una serie de ventajas:
- Es un compuesto barato, y que se obtiene con un elevado grado de pureza.
- Es soluble a concentraciones muy elevadas (100 % de saturación = 4,05 M = 533 g/l)).
- Las proteínas no suelen desnaturalizarse y se mantienen bastante estables. Es un
método frecuentemente empleado para la conservación de enzimas comerciales.
- Una alta fuerza iónica también previene la proteolisis y protege frente a la acción
bacteriana.
El porcentaje de saturación es la concentración de sulfato amónico en disolución
expresada como porcentaje de la máxima concentración alcanzable a una temperatura dada.
Para calcular el porcentaje de saturación de sulfato amónico se usa la siguiente expresión:
533 g/l (S2 – S1)
X g/ l =
(100 – 0,3 x S2)
Donde X g/ l son los gramos que hay que añadir a 1 litro de disolución con un porcentaje de
saturación S1, para obtener otra disolución con un porcentaje de saturación final S2.

Materiales y reactivos
Sulfato amónico (NH4)2SO4 Barreño con hielo
Hemoglobina comercial disuelta en agua 2 mg/ml Granatario
Vasos de precipitados pequeños Tubos de centrífuga
Espátula y varilla de vidrio Centrífugas

En este experimento se someterá una disolución proteica a dos etapas sucesivas de

precipitación con sulfato amónico. Es IMPORTANTE mantener fría la disolución proteica
durante todo el procedimiento, para lo que se utilizará un baño de hielo-agua.
Procedimiento
1. Depositar en un vaso de precipitados 5 ml de una disolución de hemoglobina (2
mg/ml). Observar su apariencia y mantenerlo en un baño de hielo-agua.
2. Pesar 0,57 g de sulfato amónico. Con la ayuda de una espátula, añadir la sal poco a
poco a la disolución proteica. Agitar de forma suave y continua durante este proceso
(mediante agitador magnético o por agitación manual con una varilla). Mantener la
agitación en baño de hielo hasta que se disuelva totalmente la sal. Mientras tanto se
calculará el porcentaje de saturación obtenido en esta etapa.
3. Posteriormente, trasvasar la disolución a un tubo de centrífuga rotulado que se
equilibrará utilizando un granatario con otro con agua destilada.
4. Centrifugar 10 minutos a 5000 rpm. Para que la sedimentación sea eficaz, es
recomendable utilizar una centrífuga refrigerada y llevar el proceso a cabo a 4oC.
5. Registrar el resultado obtenido. Separar el sedimento del sobrenadante, trasvasando
este último a un vaso de precipitados.
6. Medir el volumen de sobrenadante obtenido, y añadirle la cantidad de sulfato amónico
necesario para alcanzar un porcentaje de saturación del 85 %. Repetir los pasos 3 a 5
descritos con anterioridad.
7. Disolver el sedimento final obtenido en 2 ml de agua destilada; agitar hasta que se
disuelva por completo. Para poder cuantificar la hemoglobina presente, diluir con agua
una alícuota de dicha disolución hasta que su Absorbancia a 413 nm esté dentro los
valores de la curva patrón de hemoglobina obtenida en el experimento 3.3. Calcular el
porcentaje de hemoglobina recuperado tras el proceso de precipitación.
 41

EXPERIMENTO 5.2 Diálisis de una mezcla de colorantes

Materiales y reactivos
Disolución acuosa de azul de dextrano Vaso de precipitados de 5 litros
y ferricianuro potásico (3 mg/ml) Barra magnética
Bolsas de diálisis (MWCO 12-14 kDa) Placa de agitación

Se dializará una disolución que contiene ferricianuro potásico y azul de dextrano con el fin de
separar ambos componentes de la mezcla. El ferricianuro potásico tiene una masa molecular
de 329 Da. El azul de dextrano es un polímero con una masa molecular elevada (2x106 Da).
Procedimiento
1. Sumergir la bolsa de diálisis en agua destilada.
2. Hacer un nudo en uno de los extremos de la bolsa. Introducir 2 ml de la mezcla de
colorantes en su interior, utilizando una pipeta Pasteur y con cuidado de no rasgarla.
3. Anudar el otro extremo de la bolsa dejando una pequeña cámara de aire.
4. Introducir la bolsa, previamente marcada con una etiqueta con los datos del grupo, en
un vaso de precipitados con 5 litros de agua destilada. Se mantendrá en agitación con
una barra magnética y se darán varios cambios del medio exterior para permitir una
separación completa de las dos sustancias.
5. Al día siguiente, analizar el resultado obtenido.

EXPERIMENTO 5.3 Liofilización de una muestra proteica

Materiales y reactivos
Disolución proteica (30 mg/ml) Nitrógeno líquido
Tubo de ensayo pequeño y Parafilm© Liofilizador y vaso de liofilización
Se van a liofilizar las proteínas y demás producto no volátiles presentes en una muestra.
Procedimiento
1. Pipetear 1 ml de la disolución proteica en un tubo Corning© limpio y rotulado. Tapar el
tubo con Parafilm y perforarlo con una aguja 2 ó 3 veces.
2. Proceder a congelar la muestra en nitrógeno líquido. El proceso se lleva a cabo con el
tubo inclinado en un ángulo de 45o, girándolo de modo continúo y lento, para que la
disolución se congele en capas sobre las paredes del tubo, lo que proporciona una
mayor superficie para la posterior evaporación del disolvente.
3. Los tubos con las muestras congeladas se introducen en un vaso de liofilizado, que se
conecta al liofilizador.
4. Al día siguiente, observar los resultados obtenidos.

Resultados que deben figurar en el cuaderno de laboratorio

1. Cálculo del porcentaje de saturación por sulfato amónico en la primera etapa. Aspecto
de la muestra cuando se añade la sal y del sobrenadante y sedimento tras la primera
centrifugación.
2. Volumen del sobrenadante de la primera etapa y cálculos para determinar cuánto
sulfato amónico hay que añadir para que el porcentaje de saturación sea del 85 %.
 42
3. Aspecto de sedimento y el sobrenadante tras la segunda centrifugación.
4. Porcentaje de la hemoglobina inicial recuperado tras disolver el sedimento de la última
etapa de precipitación con sulfato amónico.
5. Registro del proceso y resultado final tras la diálisis.
6. Características del liofilizador y aspecto de la disolución de proteína liofilizada.

CUESTIONES COMPLEMENTARIAS

1. Calcular el grado de saturación de sulfato amónico de una disolución proteica de 25 ml

que contiene 2,093 gramos disueltos de sulfato amónico.
2. Describir cómo procedería experimentalmente para que 10 ml de una muestra proteica al
25 % de saturación por sulfato amónico alcance una saturación del 65 %.
3. A una disolución proteica de 15 ml se le añadieron 1,7 gramos de sulfato amónico en frío
hasta su completa disolución. Tras centrifugación de la muestra a 5000 rpm durante 10
minutos, se obtuvo 14,8 ml de sobrenadante junto con un sedimento que se descartó. A
este último volumen de sobrenadante se le añadieron 3,31 gramos de sulfato amónico
para continuar con la precipitación fraccionada de proteínas. ¿Cuál es porcentaje de
saturación final de esta solución?
 43

BLOQUE 2: TÉCNICAS BÁSICAS EN EL ESTUDIO DE

MACROMOLÉCULAS

2.1. DETERMINACIÓN DE LA MASA MOLECULAR DE PROTEÍNAS

MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

2.1.1. Métodos de determinación de la masa molecular de una proteína

Uno de los aspectos claves cuando se trata de caracterizar una proteína es la
obtención de información acerca de su estructura nativa. Es decir si la proteína en
condiciones fisiológicas está constituida por una o varias subunidades, y si éstas son
idénticas o distintas. La determinación de la masa molecular de la proteína nativa o en
condiciones de disociación permite obtener información acerca de la estructura de la proteína.
Para ello se dispone de distintas técnicas que permiten determinar la masa molecular de las
proteínas. Por ejemplo mediante técnicas de equilibrio de sedimentación, cromatografía de
exclusión molecular, electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato
sódico (SDS) y espectrometría de masas es posible determinar con mayor o menor exactitud
la masa molecular de una proteína. De hecho en los últimos años se ha aplicado la
espectrometría de masas al estudio de proteínas con resultados notables, principalmente
porque los resultados pueden ser muy exactos, del orden de una parte por 10 000 para
moléculas del tamaño de la hemoglobina.
En ese bloque de la asignatura se van a utilizar dos de las técnicas que permiten
obtener información acerca de la masa molecular de una proteína. Así, la cromatografía de
exclusión molecular es una de las técnicas que se utilizan frecuentemente en el aislamiento y
purificación de proteínas; además, si la proteína está pura nos permite determinar su masa
molecular. Por su parte la electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS en
condiciones reductoras nos ayuda a obtener información acerca de la estructura cuaternaria
de la proteína.

2.1.2. Fundamento de la cromatografía de exclusión molecular

La cromatografía de exclusión molecular (a menudo también llamada de penetrabilidad
o de filtración en gel) permite la separación de proteínas de distinto tamaño mediante su paso
a través de una columna cilíndrica que contiene como fase estacionaria el líquido retenido en
el interior de una matriz formada por partículas hidratadas de un gel que presentan poros de
diámetro controlado. Los geles que se utilizan son polímeros reticulados inertes que no
presentan carga eléctrica.
Esta técnica se puede aplicar, además de al proceso de aislamiento y purificación de
proteínas o al cambio de tampón o al desalado de las mismas, a la determinación de la masa
molecular de proteínas en su estado nativo. Las proteínas con un tamaño mayor que los
poros más grandes no pueden penetrar en el interior de las partículas del gel y se moverán en
el espacio que queda entre dichas partículas. Por el contrario, las proteínas cuyo tamaño sea
inferior al de los poros pueden penetrar dentro de las partículas de gel y sufrirán en su
recorrido a través de la columna un retraso con respecto a las proteínas de mayor tamaño.
Cuanto mayor es una molécula, menos capacidad tiene para acceder al interior de las
partículas del gel y, por tanto, menor es el volumen que se requiere para extraerla (eluirla) de
la columna. En este tipo de cromatografía las proteínas eluyen en orden decreciente de
tamaño molecular.
 44

Reservorio con
tampón de elución

Las moléculas de proteína se

separan en función de su
tamaño: las moléculas
Esferas de
polímero poroso.
mayores atraviesan libremente
Ej.: Sephadex, el gel y eluyen antes de la
Sepharosa,.. columna.

La mezcla de proteínas
se carga en la columna
rellena del polímero
reticulado. Medida de la Absorbancia a
280 nm de las fracciones
eluídas

Se definen los siguientes parámetros:

El intervalo de fraccionamiento de un tipo de gel corresponde a los valores extremos
(máximo y mínimo) de masas moleculares entre los cuales el gel tiene capacidad de separar.
El volumen de elución (Ve) de una proteína es el volumen de líquido requerido para que
dicha proteína eluya (es decir, sea extraída) de la columna. Se determina experimentalmente
y depende del volumen total de la columna. El volumen de elución está relacionado con otros
parámetros según la ecuación:

𝑉𝑒 𝑉𝑜 𝐾𝑎𝑣 𝑉𝑖   𝑉𝑒 𝑉𝑜
𝐾𝑎𝑣  
𝑉𝑡 𝑉𝑜
Vo volumen de exclusión de la columna es el volumen al que eluyen las
moléculas de tamaño superior al intervalo de fraccionamiento del gel.
Corresponde a la suma del volumen de los huecos entre las partículas de gel.
Vi volumen interno, es el volumen de líquido existente dentro de las partículas.
Vt volumen total, es el volumen al que eluyen las moléculas de tamaño inferior
al intervalo de fraccionamiento del gel. Corresponde al volumen total de
líquido contenido en el lecho cromatográfico, fuera y dentro de las partículas
del gel, por tanto, es la suma del volumen de exclusión y el interno.
Kav coeficiente de reparto de la proteína, es la fracción de volumen interno
accesible a una proteína determinada.
 45

Las proteínas cuyo tamaño sea mayor que los poros de mayor tamaño de las
partículas del gel presentarán un valor de Kav = 0 y su volumen de elución será igual al
volumen de exclusión, por lo que saldrán eluídas todas juntas independientemente de la
diferencia de tamaño. Aquellas otras proteínas cuyo tamaño sea inferior a los poros de menor
tamaño presentarán un valor de Kav = 1 y su volumen de elución será igual al volumen total
(Vt = V0 + Vi), excepto que exista algún tipo de interacción con la matriz de la columna.
Finalmente, las proteínas cuyo tamaño se encuentre comprendido dentro del intervalo de
fraccionamiento del gel presentarán valores de Kav entre 0 y 1, y sus volúmenes de elución
serán función de la masa molecular.

Moléculas de baja
Moléculas de alta 
masa molecular
masa molecular

V0
Ve
Vt

Tiempo de retención o Volumen eluído

Aplicaciones. Además de utilizarse para

la separación de sustancias de distintas masas
moleculares o para la purificación de proteínas,
se emplea para la determinación de masas
moleculares de proteínas. Se ha comprobado
que para una gran variedad de tipos de geles
existe una relación lineal entre el volumen de
elución de la proteína (o su Kav) y el logaritmo
de su masa molecular. Por tanto, para estimar
la masa molecular de una proteína problema
es suficiente determinar su volumen de elución
e interpolarlo en una recta de calibrado
construida utilizando proteínas puras de masa
molecular conocida que se han eluído en las
idénticas condiciones en la misma columna.
 46

2.1.3. Objetivo de la práctica

Determinar la masa molecular aparente de una proteína mediante cromatografía de
exclusión molecular. Para ello se requiere aprender a preparar, montar, equilibrar y calibrar
una columna con un gel de cromatografía de exclusión molecular.
Se va a utilizar como gel el Sephadex G-75, un polímero de dextrano, el cual es un
polisacárido compuesto por restos de glucosa.

PARTE PRÁCTICA

Materiales y reactivos
Columna de cromatografía Azul de dextrano
Lana de vidrio Ferricinauro potásico
Pinza Hoffman Ovoalbúmina (8 mg/ml)
Tapón de goma perforado Citrocromo c (8 mg/ml)
Conducción de goma Albúmina de suero bovino (6 mg/ml)
Sephadex G-75 Hemoglobina (5 mg/ml)
Tampón fosfato potásico 0,1M, pH 7,0 Proteína problema
Tubos para recoger fracciones
Espectrofotómetro y cubetas de UV
Colorímetro y cubetas

2.1.A Preparación de la columna de Sephadex y aplicación de muestras

a) Preparación del soporte cromatográfico [Lo hacen los técnicos de laboratorio]

Previamente al montaje de la columna de cromatografía se requiere preparar el soporte
cromatográfico. En este caso, se va a utilizar Sephadex G-75 (intervalo de fraccionamiento de
3000 a 80000 Da para proteínas globulares). Para ello se procede a la hidratación y posterior
desgasificación del gel.
Método
1. La hidratación del gel se consigue manteniendo el sólido comercial durante 24 horas a
temperatura ambiente en un exceso de medio de elución. El proceso puede acelerarse
manteniendo durante varias horas el gel en baño de agua hirviendo.
2. Para su desgasificación, el gel se somete a vacío agitando ocasional y
cuidadosamente.

b) Montaje y equilibrado de la columna

Una vez hidratado y desgasificado el Sephadex G-75, se va a preparar (montar) una columna
cromatográfica del gel de aproximadamente 45 cm x 1,5 cm (Ø). Para ello, se emplea un tubo
de vidrio con el extremo inferior redondeado, que se estrecha hasta alcanzar un diámetro
pequeño donde se acopla una conducción flexible de goma. La utilización de una pinza
Hoffman para estrangular la conducción de salida permite cerrar (cortar el flujo del eluyente)
cuando se desee. El equilibrado de una columna cromatográfica consiste en dejar pasar a
través de la columna el eluyente que se va a usar en la cromatografía, para asegurarse de
que la fase estacionaria está en perfecto equilibrio con la fase móvil.
 47

Método
1. Fijar en posición vertical la columna de vidrio al soporte. Cerrar la pinza Hoffman y
añadir agua destilada hasta una altura de 3-4 cm.
2. Colocar un poco de lana de vidrio en el extremo inferior de la columna. Mojar con agua
destilada la pequeña madeja de lana de vidrio y, ayudándose con una varilla de vidrio
larga, fijarla en la zona donde el tubo de vidrio comienza a estrecharse.
3. Con cuidado, añadir la suspensión de gel dentro del tubo de vidrio y permitir que se
vaya depositando por gravedad en la parte inferior durante 1-2 minutos. Para que no
queden atrapadas burbujas de aire en la columna del gel, asegurarse de que la
suspensión está formada por aproximadamente el mismo volumen de líquido que de
gel y que ambos estén a temperatura ambiente.
4. Abrir la pinza Hoffman y dejar que eluya el líquido. Las partículas del gel se irán
depositando sobre la lana de vidrio formando el lecho cromatográfico. Añadir
suspensión de gel por la parte de arriba del tubo de vidrio de modo que el nivel de
líquido permanezca constante. Hay que continuar añadiendo la suspensión del gel,
hasta que el lecho de la columna cromatográfica haya alcanzado la altura deseada. En
ese momento se cierra la pinza Hoffman y se rellena la parte superior de la columna
con la disolución en la que se vaya a hacer la cromatografía.
5. Para equilibrar la columna, colocar un reservorio con tampón fosfato potásico 0,1 M,
pH 7,0 a la altura adecuada (Δh), de modo que el flujo sea inferior a 60 ml/h. Dejar
pasar a través de la columna un volumen de tampón equivalente a 2,5 veces el
volumen de lecho de la columna cromatográfica. Para asegurarse de que la columna
está equilibrada, comprobar que el pH del líquido eluído es 7,0.

Reservorio de
tampón

Δh

c) Aplicación de muestras en la columna

La aplicación cuidadosa de las muestras en la columna es crucial para realizar correctamente
una separación cromatográfica. En todos los casos, se debe seguir el mismo procedimiento:
 48
1. Desconectar la columna del reservorio de tampón. Abrir la pinza Hoffman y dejar eluir
el líquido existente sobre el gel, hasta que su nivel sea justo el de la superficie del
soporte cromatográfico. Rápidamente cerrar la pinza Hoffman para evitar que el
tampón siga eluyendo y se seque la columna cromatográfica.
2. Añadir la muestra con mucho cuidado sobre la superficie libre de líquido del gel,
dejándola resbalar lentamente por las paredes interiores de la columna de vidrio, sin
alterar la superficie del gel. La cromatografía comienza en este momento en el que se
ha aplicado la muestra; por tanto, a partir de este punto hay que empezar a recoger
fracciones.
3. Abrir la pinza Hoffman, dejar penetrar la muestra dentro del soporte hasta que
justamente el líquido desaparezca de la superficie; cerrar la pinza Hoffman. Para que la
muestra acabe de entrar en el gel, se añade, de nuevo con mucho cuidado, ≈ 1 ml de
tampón en la columna; se abre la pinza, se deja que penetre el tampón hasta la
superficie del gel y se vuelve a cerrar la pinza Hoffman.
4. Finalmente, se deposita una vez más tampón hasta 3-4 cm por encima de la superficie
del soporte cromatográfico, y se conecta el reservorio con la finalidad de que
suministre un flujo continuo de tampón a la columna. Se comprueba que todas las
conducciones del dispositivo están correctamente colocadas y sin fugas, y que el flujo
de entrada es el mismo que el de salida. Una vez recogidas las fracciones necesarias,
se registra su absorbancia a la longitud de onda indicada.

2.1.B Determinación del volumen de exclusión y volumen total de la columna

Para establecer los límites de separación en la columna cromatográfica, se utilizarán azul de
dextrano y ferricianuro potásico. El azul de dextrano (Mr = 2 x 106, λmáx = 625 nm) es un
polímero con una masa molecular muy elevada, por lo cual será excluido del gel (Kav =0). El
ferricianuro potásico (Mr = 329,3, λmáx = 420 nm), por su parte, tiene una masa molecular baja
por lo que será retenido por las partículas del gel (Kav =1). Ambos compuestos tienen color
con lo que el proceso cromatográfico puede ser seguido observando la separación de las
bandas coloreadas. El perfil de elución se determina registrando absorción a 625 nm y a 420
nm de las fracciones obtenidas.
 Muestra: 0,5 ml de una mezcla de azul de dextrano (3 mg/ml) y ferricianuro
potásico (5 mg/ml) en tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 7,0.
 Medio cromatográfico: tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 7,0

Método
1. Aplicar 0,5 ml de muestra sobre la superficie del gel libre de líquido, según se describe
en la sección anterior.
La aplicación de la muestra sobre el Sephadex se hace siempre con sumo cuidado, sin
distorsionar la superficie del gel. A partir de este punto comienza la cromatografía, y
por tanto, hay que empezar a recoger fracciones para posteriormente poder determinar
los volúmenes de elución de los componentes de la muestra.
2. Una vez aplicada la muestra se conecta el reservorio y se deja eluir la columna de
modo continuo, recogiéndose fracciones de 1,5 ml, hasta que el ferricianuro potásico
haya eluido. (NO se debe cerrar la columna cromatográfica antes de la total elución del
ferricianuro potásico ya que se alteraría el gel)
3. Registrar la absorbancia a 625 nm y a 420 nm de las fracciones obtenidas que
presenten color a simple vista
 49

Resultados
 Calcular geométricamente el volumen de lecho cromatográfico, midiendo la altura y el
diámetro del gel en la columna empaquetada.

 Determinar el flujo cromatográfico de la columna en ml/h. Para ello, medir el volumen de

tampón eluido durante un intervalo de tiempo de al menos 10-15 minutos.

 Dibujar el perfil de elución del azul de dextrano y del ferricianuro potásico, representando
absorbancias a 625 y 420 nm frente a número de fracción y volumen eluído.

 Determinar el volumen de exclusión y el volumen total para la columna de Sephadex G-75.

Comparar el volumen total con el volumen de lecho de la columna.

2.1.C Calibrado de la columna y determinación de la masa molecular de las proteínas

problema
La masa molecular de una proteína puede determinarse a partir de su volumen de elución,
después de haber calibrado la columna con proteínas de masa molecular conocida. La
representación de Kav (o del volumen de elución) para una serie de proteínas frente al
logaritmo de su masa molecular permite obtener la recta de calibrado. Conociendo el volumen
de elución de la proteína problema e interpolando en la curva de calibrado se puede calcular
su masa molecular.
 Proteínas patrón: albúmina de suero bovino (BSA, 66,4 kDa ), ovoalbúmina (45
kDa) y citocromo c (12,3 kDa)
 Cromatografías: Para calibrar la columna de Sephadex y determinar la masa
molecular de la proteína problema y de la hemoglobina, se llevarán a cabo tres
cromatografías sucesivas en tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 7,0, con las
siguientes muestras:
i) CROMATOGRAFÍA 1: mezcla de ovoalbúmina (45 kDa) y citocromo c (12,3 kDa)
ii) CROMATOGRAFÍA 2: mezcla de albúmina de suero bovino (66,4 kDa) y
de la proteína problema
iii) CROMATOGRAFÍA 3: hemoglobina
Nota: antes de aplicar la hemoglobina asegurarse de que no hay precipitado; si
lo hay, agitar la muestra y dar un pulso de centrifugación.
El procedimiento cromatográfico es el mismo en todos los casos.

Método
1. Aplicar 0,5 ml de muestra sobre la superficie del gel libre de líquido, según se describe
en la sección 2.1.A
A partir de este punto comienza la cromatografía, y por tanto, hay que empezar a
recoger fracciones para posteriormente poder determinar los volúmenes de elución de
los componentes de la muestra.
2. Una vez aplicada la muestra se conecta el reservorio y se deja eluir la columna de
modo continuo, recogiéndose fracciones de 1,5 ml, hasta que volumen de líquido
 50
eluido alcance el volumen total (Vt) de la columna.
NO se debe cerrar la columna cromatográfica durante la cromatografía.
3. Para determinar el perfil de elución de la cromatografía se mide la absorbancia de las
fracciones obtenidas a 280 nm y a 413 nm.
Las fracciones que no presentan color a simple vista, no absorben a 413 nm.

IMPORTANTE: De cada una de las cinco proteínas que se aplican en la columna, hay que
guardar 20 μl de la fracción correspondiente al máximo de absorbancia a 280 nm. Estas
muestras se conservarán en la nevera, en tubos Eppendorfs adecuadamente rotulados, para
utilizarlas en el siguiente experimento.

Resultados

 Dibujar el perfil de elución de las tres cromatografías realizadas, representando

absorbancia a 280 y 413 nm frente a número de fracción y volumen eluído. Identificar
en el perfil los máximos correspondientes a cada proteína.

 Determinar el volumen de elución en ml y calcular el coeficiente de reparto Kav para

cada una de las proteínas utilizadas.

 Dibujar la recta de calibrado de la columna, teniendo en cuenta la masa molecular de

las tres proteínas patrón empleadas. Representar Kav (o volumen de elución) frente a
logaritmo de la masa molecular.

 Determinar la masa molecular de la proteína problema.

 Determinar la masa molecular de la hemoglobina

Tabla resumen de resultados

Cromato- Masa mol. Volumen de

Muestra Log Mr Kav
grafía (kDa) elución (ml)
0 Azul dextrano > 2000
Ferricianuro 0,33
1 Ovoalbúmina 45
Citocromo c 12,3
2 BSA 66,4
Prot. Problema

3 Hemoglobina
 51
SUPPLEMENTARY QUESTIONS

1- [Protein desalting]. A protein (molecular mass 240 000 Da) dissolved in 1 M potassium
phosphate buffer, pH 7,5, was loaded on a Sephadex G-25 column (fractionation range
for peptides and globular proteins 1000 - 5000 Da), previously equilibrated with 10 mM
potassium phosphate buffer, pH 7,5. This equilibration buffer was also used for the
elution step. In which volume will you expect to elute the protein? What will be the
molarity of the phosphate buffer in which the protein elutes?
2- A mixture containing three proteins was loaded on a Sephadex G-150 column
(fractionation range for globular proteins 5 000 - 300 000 Da). The Figure shows the
chromatographic elution profile. Why are there only two peaks in the elution profile?
What techniques could you use to determine the protein composition of each peak?
How could you try to separate the three proteins?

3- The molecular mass of an enzyme isolated from Acinetobacter sp. was determined by
size exclusion chromatography. The following Kav values were obtained for standard
proteins of known molecular mass (see the Table). Estimate the molecular mass of the
bacterial enzyme, knowing that its Kav value is 0,67

Molecular Mass
Protein Kav
(kDa)
Cytochrome c 12 0,840
Lysozyme 14 0,790
Ovalbumin 45 0,550
Bovine serum albumin 66 0,440
Alcohol dehydrogenase 160 0,260
Pyruvate kinase 235 0,156

4- [Determination of the number of subunits]. A protein was purified to homogeneity. By size

exclusion chromatography its molecular mass was estimated to be 60 kDa in the absence
of urea, and 30 kDa when the chromatography was performed in the same buffer
containing 6 M urea. When the chromatography was repeated in the presence of 6 M urea
and 10 mM β-mercaptoethanol, a single peak corresponding to 15 kDa was detected.
Describe the molecular structure of the protein.
 52

2.2. DETERMINACIÓN DE LA MASA MOLECULAR DE PROTEÍNAS

MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN
PRESENCIA DE SDS

2.2.1. Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS (PAGE-SDS)

La electroforesis es una técnica que permite la separación de proteínas mediante la
aplicación de un campo eléctrico, en función de su carga eléctrica a un pH determinado. La
utilización como soporte de la electroforesis de un gel de poliacrilamida presenta, entre otras
ventajas, una adsorción prácticamente despreciable para las proteínas. El gel de
poliacrilamida se obtiene mediante la polimerización del monómero de acrilamida, utilizando
la N,N'-metil-bisacrilamida como agente de entrecruzamiento. El grado de entrecruzamiento y,
por tanto el tamaño del reticulado del gel se puede variar modificando el porcentaje de
acrilamida. Con este tipo de electroforesis se consigue la resolución de mezclas de proteínas
en función de su carga y su tamaño molecular. Un caso particular es la electroforesis en geles
de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato sódico (SDS).

El SDS [CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+] es un detergente aniónico que se une a las

proteínas causando su desnaturalización. Los complejos proteína-SDS adoptan forma de
varilla con carga neta negativa y una relación carga/masa constante. Así, la movilidad del
complejo proteína-detergente dependerá solamente de la masa de la proteína. Cuanto más
grande sea la molécula mayor cantidad de SDS unirá, manteniéndose constante la relación
carga/masa, y por tanto aumentará el tamaño del complejo, lo que se traducirá en una
migración más lenta por el gel. La masa molecular de una proteína puede determinarse
comparando su movilidad electroforética con la de una serie de proteínas patrón de masa
molecular conocida. La representación del logaritmo de la masa molecular de las proteínas
frente a su movilidad relativa (μr) da lugar a una recta. El intervalo de masas moleculares que
pueden separarse en un gel determinado depende del reticulado. Hay que resaltar que,
mientras que la cromatografía de exclusión molecular se puede utilizar para determinar la
masa molecular de proteínas en su estado nativo, la electroforesis en geles de poliacrilamida
en presencia de SDS tiene lugar en condiciones desnaturalizantes.

Dodecilsulfato sódico (SDS) Electroforesis en geles

SO3¯ Na+
de poliacrilamida

Proteínas en tampón
POLIMERIZACIÓN GEL DE POLIACRILAMIDA de aplicación con SDS

Aplicar la mezcla de proteínas

en el gel y someter a un campo
Acrilamida Metilen-bisacrilamida eléctrico
Persulfato
Gel de poliacrilamida
(PAGE-SDS)
Las proteínas
(El radical sulfato inicia
la polimerización)
parcialmente
Dirección de migración
separadas

Teñir para visualizar

las bandas

• Azul de Coomassie
• Nitrato de plata
• Negro amido
• Otros
 53

La electroforesis discontinua en geles de poliacrilamida permite conseguir la máxima

resolución de las proteínas mediante la concentración de la muestra en una banda muy fina
antes de proceder a su separación. El sistema de geles se prepara en vertical y consta de dos
regiones distintas: el gel concentrante y el gel separador. En el gel concentrante, el gran
tamaño del reticulado y un pH moderadamente ácido que rebaja la carga negativa de las
proteínas, hacen que la muestra atraviese rápidamente este gel y se concentre en el límite
con el gel separador. Posteriormente, mientras la muestra avanza a través del gel separador,
las diversas proteínas se separan de acuerdo con su masa molecular.

2.2.2. Objetivo de la práctica

Determinar la masa molecular aparente de una proteína mediante electroforesis en
geles de poliacrilamida en presencia de SDS.
Se requiere conocer cómo se polimeriza el gel en un sistema de placas, como se
monta en la cubeta de electroforesis, como se preparan las muestras y como se aplican en
dicho sistema.

PARTE PRÁCTICA

Materiales y reactivos
Placas de vidrio Pipetas Pasteur
Peine delimitador de los pocillos Microjeringa o puntas para electroforesis
Sistema de electroforesis en placa Cubeta de teñir/desteñir el gel
Fuente de alimentación Papel celofán
Puntas amarillas y azules Pinzas y sistema de secado geles
Pipetas automáticas

Solución A: Acrilamida al 30 % (m/v) y Bisacrilamida al 0,8 % (m/v) en agua destilada

Solución B: SDS al 0,4 % (m/v) en tampón Tris- HCl 1,5 M, pH 8,8
Solución C: SDS al 0,4 % (m/v) en tampón Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8
Persulfato amónico al 10 % (m/v) en agua destilada (preparar en el momento)
TEMED al 10 % (v/v) tetrametiletilendiamina) en agua destilada
Tampón de muestras (2X): Tampón Tris-HCl 125 mM, pH 6,8, conteniendo glicerol al 20 %
(v/v), SDS al 4 % (m/v), 2-mercaptoetanol al 2 % (v/v) y azul de bromofenol al 0,02 %
(m/v).
Tampón de electroforesis: Tris-HCl 25 mM, pH 8,3 con glicocola 0,2 M y SDS al 0,1 %
(m/v)]
Solución de teñido: Azul de Coomassie R-250 al 0,5 % (m/v) en un sistema metanol-acético-
agua en proporción 40:10:40 (v/v/v)
Solución de desteñido: Metanol-acético-agua en proporción 20:10:70 (v/v/v)
Acético al 7,5 % (v/v)
Proteínas patrones de masa molecular conocida
Proteínas problema: muestras cromatográficas obtenidas en la práctica anterior

2.2.A Polimerización del gel [Lo hacen los técnicos de laboratorio]

En esta práctica se llevará a cabo una electroforesis discontinua en geles de
poliacrilamida al 15 % en presencia de SDS. La polimerización de los geles se realizará en un
soporte formado por dos placas de vidrio. Para la preparación de los geles superior e inferior
se seguirá el esquema reflejado en la tabla:
 54
Tabla 1- Preparación de los geles separador y concentrante
Gel Separador (15 %) Gel Concentrante
Solución A 3,0 ml 0,35 ml
Solución B 1,5 ml ----
Solución C ---- 0,625 ml
H2O 1,5 ml 1,5 ml

Persulfato 10 % (m/v) 30 μl 30 μl
TEMED 10 % (v/v) 75 μl 50 μl

Método
1. Para la formación del gel separador, o gel inferior, se mezclan las soluciones A y B con
agua destilada en las cantidades que se detallan en la tabla.
2. Posteriormente se añaden:
30 μl de persulfato amónico (agente generador de radicales libres)
75 μl de TEMED (tetrametiletilendiamina, catalizador de reacción de polimerización)
3. Tras agitar con suavidad, se introduce inmediatamente la mezcla con una pipeta
Pasteur en el molde creado entre las dos placas de vidrio, previamente sellado por la
parte inferior. La mezcla debe llegar hasta una altura de unos 2,5 cm del borde
superior.
4. Con cuidado de no distorsionar el frente se añade agua destilada sobre la mezcla y se
deja polimerizar en condiciones anaeróbicas
5. Cuando el gel separador ha polimerizado, se elimina el agua de la parte superior.
6. Para la formación del gel concentrante se mezclan las soluciones A y C con agua
destilada en las cantidades que se detallan en la tabla.
7. Posteriormente se añaden 30 μl de persulfato y 50 μl de TEMED y se agita
suavemente. La mezcla se deposita con rapidez sobre el gel separador, se coloca el
molde ("peine") para crear los pocillos de aplicación y se espera su polimerización

2.2.B Preparación de las muestras

Método
1. Para la preparación de muestras se toman 20 μl de la muestra que se desea someter a
electroforesis y se le añaden 20 μl de tampón de muestras (2X), que lleva azul de
bromofenol como referencia de la migración
2. La mezcla se mantiene a 95 ºC durante 5 minutos para permitir la desnaturalización de
las proteínas.
3. Se aplican en los correspondientes pocillos, 15 μl de cada muestra y 10 μl de una
mezcla de proteínas patrón de masa molecular conocida.

2.2.C Desarrollo de la electroforesis

Método
1. Se retira el peine del gel, se coloca éste en los soportes de la cubeta de electroforesis
cubriéndolo con tampón de electroforesis.
2. Con una microjeringa o puntas de pipeta especiales se aplican las muestras en los
pocillos.
3. Se introduce el soporte con las muestras aplicadas en la cubeta de electroforesis y se
llena el reservorio inferior de la cubeta con tampón de electroforesis conectándolo a la
fuente de tensión. El polo positivo (rojo) o ánodo se conecta a la parte inferior de la
cubeta y el negativo (negro) o cátodo a la parte superior.
 55
4. La electroforesis se lleva a cabo a una intensidad de 25 mA/gel, hasta que el azul de
bromofenol, marcador del frente, esté a 3-5 mm del final del gel (la duración del
proceso es variable aunque en las condiciones descritas es de aprox. 1 hora).
5. Finalizada la electroforesis, se desconecta la fuente de tensión, se extrae el gel con
cuidado (si hiciera falta, para identificar el orden de los pocillos, se hace una pequeña
marca en alguno de los extremos del gel) se coloca en la cubeta de teñido donde se
lava con agua destilada y se procede a la tinción de las proteínas.

2.2.D Localización de las proteínas por tinción con azul de Coomassie

Método
1. Se lleva a cabo por tinción con azul de Coomassie R-250, mediante la inmersión del gel
en disolución de teñido
2. Después de mantener el gel en dicha disolución durante 15 minutos se elimina el
exceso de colorante mediante sucesivos lavados con disolución de desteñido
3. Una vez desteñido el fondo del gel e identificadas las bandas, el gel se fotografía.
También puede conservase en una disolución en agua de acético al 7,5 % (v/v) o
envolverse en papel de celofán y proceder a su secado.

Proteínas patrón para PAGE-SDS. Los patrones de kDa kDa

masa molecular empleados son 10 proteínas
recombinantes de masas moleculares entre 10 y 250 250
kDa (Precision Plus Protein Unstained Standards, 150
BioRad©). Tres de las proteínas, de s25, 50 y 75 kDa, 75 100
producen bandas más intensas. La imagen muestra la
separación de las proteínas patrón en un gel al 15 %
de acrilamida 50
37
Proteína
kDa
patrón
1 250
2 150 25
3 100 20
4 75*
5 50*
6 37
7 25* 15
8 20
9 15
10 10 10

ELIMINACIÓN DE RESIDUOS:
La disolución de tinción Azul de Coomassie, se recupera en su botella de origen.
La disolución de desteñido, se elimina en el bidón “RESIDUOS de ELECTROFORESIS”:

Resultados: Determinación de la masa molecular de una proteína problema

 Calcular las concentraciones finales de los distintos compuestos en las soluciones de
polimerización del gel separador y del gel concentrante.
 56
 Dibujar la curva de calibrado utilizando las movilidades electroforéticas relativas (Rf) o
las distancias migradas (cm) por las proteínas patrón aplicadas y el logaritmo de su masa
molecular.
 Determinar la masa molecular de las proteínas problema.
 Comparar los valores de masa molecular obtenidos mediante cromatografía de
exclusión molecular y mediante electroforesis en presencia de SDS.
 Calcular la cantidad (g proteína) de hemoglobina aplicada en cada uno de los pocillos.
 Discutir cuál de las técnicas empleadas para determinar la masa molecular de una
proteína resulta más fiable y por qué. ¿Se obtiene información diferente acerca de la
estructura de la proteína con cada una de ellas?

SUPPLEMENTARY QUESTIONS
1- Calculate the volume of each stock solution needed to prepare a 10 % polyacrylamide-
resolving gel (see the Preparation Table for SDS-PAGE gels). How could you prepare a 5-
15 % polyacrylamide gradient-slab gel?

2- Consider that there were a 15 %- and a 7 %-polyacrylamide SDS-PAGE gel in the

laboratory, which one would you employ to identify a protein of 15 kDa? And if the
molecular mass of the protein were 150 kDa?

3- You want to analyze by SDS-PAGE electrophoresis a sample with a protein concentration

of 35 mg/ml. For this purpose, an aliquot of the sample is diluted 20-fold with distilled water
to a final volume of 500 μl. Then, 30 μl of the 1/20 dilution are mixed with 30 μl of sample
buffer (2X), and the mixture is heated for 5 min at 90 °C. Finally, 10 μl and 20 μl of the last
preparation are loaded into the gel wells. (a) Describe how you would prepare the required
1/20 dilution, if you had in the laboratory micropipettes for pipetting volumes of 2-20 μl, 20-
200 μl and 200-1000 μl. (b) Calculate how many micrograms of protein are loaded into
each gel well.

4- After an ion-exchange chromatography, a preparation containing 25 mg of protein per

milliliter was obtained. To establish the purity of this preparation by SDS-PAGE, you are
required to prepare two samples containing 5 μg and 10 μg of protein, respectively.
Remember that the maximum loading volume per gel well is 20 microliters and that the
sample loading buffer is prepared at double concentration (2X). (a) How much will you
dilute the initial preparation with distilled water? (b) Describe the preparation of the two
samples that must be loaded in the wells (including sample buffer).

5- You are required to load into an SDS-PAGE gel 4 μg of a sample with a protein
concentration of 0,8 mg/ml. If the sample loading buffer is three times more concentrated
(3X) than the final desired concentration, what volume of protein sample, distilled water
and sample loading buffer (3X) should be mixed in order to load a total volume of 15 μl in
the well?
6‐ (a) Sketch the expected elution profile (absorbance at 280 nm vs elution volume) for a size
exclusion chromatography of a protein mixture containing cytochrome c (12 kDa) and
nucleoside diphosphokinase (100 kDa, 6 subunits); identify the peaks in the profile. (b)
Sketch the results that would be obtained with the same mixture of proteins if analyzed by
SDS-PAGE electrophoresis; indicate the migration direction and identify each band. 
 57

2.3. EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DNA GENÓMICO

2.3.1. Purificación de ácidos nucleicos
Muchas de las técnicas de Biología Molecular incluyen algún tipo de manipulación del
material genético. Existen diversos protocolos de purificación de ácidos nucleicos, que varían
según se desee aislar DNA (cromosómico, plasmídico, etc.) o RNA (total, mRNA, etc), así
como del grado de pureza requerido. Los procedimientos pueden tener una finalidad analítica
o preparativa. Debido a su gran tamaño y a su fragilidad es muy difícil aislar DNA
cromosómico intacto, aunque se puede obtener una forma biológicamente activa que
conserve su integridad estructural. Para seleccionar un tejido como fuente de DNA debe
reunir dos requisitos: contener una gran cantidad de material genético y poseer una baja
actividad DNasa (enzimas capaces de degradar el DNA). El DNA no existe como molécula
libre en las células eucariotas, sino que se encuentra asociado a proteínas y RNA, formando
la cromatina o los cromosomas. Por esta razón, todos los métodos de aislamiento del DNA
genómico implican una serie de etapas generales consistentes en: i) disgregación del tejido y
lisis de las células, ii) eliminación de las proteínas y otros contaminantes, y iii) recuperación
del DNA. Durante estos procedimientos hay que proceder cuidadosamente. Se debe evitar el
estrés mecánico, las condiciones físicas o químicas extremas, la degradación enzimática, así
como su contaminación bacteriana. Una buena preparación de DNA cromosómico es estable,
de masa molecular elevada y relativamente libre de RNA y proteína. El DNA sufre hidrólisis
ácida cuando se disuelve en agua, por lo que se conserva en medios ligeramente básicos y
se almacena a -20ºC.

En general, los métodos de purificación de ácidos nucleicos se basan en las

diferencias de solubilidad que presentan las macromoléculas en función de la polaridad del
disolvente empleado. Para ayudar a la separación y evitar la degradación del DNA, en la
extracción de DNA genómico de eucariotas el tejido se disgrega en un medio tamponado que
contiene habitualmente una elevada concentración de sal (los iones Na+ bloquean la carga
negativa de los fosfatos del ácido nucleico) y de EDTA (ácido etilendiaminotetraacético,
agente quelante de iones metálicos, lo que inhibe las DNasas). El homogeneizado obtenido
se trata con un detergente, dodecil sulfato sódico (SDS), lo que provoca la ruptura de las
membranas plasmática y nuclear, la desnaturalización de las proteínas y la liberación de los
complejos de nucleoproteicos. El lisado desnaturalizado se puede tratar con una proteasa
inespecífica y/o con RNasa. Cuando se necesita disponer de una preparación de DNA con
elevado grado de pureza, se requieren etapas adicionales, tales como una purificación en
columna o una extracción con medio orgánico (por ejemplo, fenol-cloroformo-alcohol
isoamílico) que permite la separación de los componentes de la mezcla según su polaridad.
En este último caso, los ácidos nucleicos (polares hidrofílicos), se extraen en la fase acuosa,
los lípidos (apolares hidrofóbicos) se localizan en la fase orgánica y las proteínas
desnaturalizadas (anfipáticas) en la interfase. Finalmente, los ácidos nucleicos presentes en
la fase acuosa se precipitan mediante la adición de un alcohol, habitualmente etanol.

2.3.2. Objetivo de la práctica

Introducir al alumno en las técnicas de extracción y caracterización de ácidos
nucleicos, llevando a cabo una purificación parcial de DNA genómico de un tejido vegetal. Se
utilizará la capacidad de absorción de luz UV de los ácidos nucleicos para determinar su
concentración en disolución y estimar su pureza. Para comprobar la calidad del DNA extraído,
una muestra se someterá a separación electroforética en gel de agarosa, se teñirá y se
visualizarán los ácidos nucleicos purificados bajo luz UV.
 58

PARTE PRÁCTICA

Materiales y reactivos
Tampón de lisis 1 tubo Falcon de 50 ml
SDS al 10 % (m/v) 1 tubo de centrífuga
Etanol al 96 % (v/v), frío Embudo y gasa
Etanol al 70 % (v/v), frío Homogeneizador de tejido
Proteasa, Sigma P-5895 Probeta de 10 ml
Tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 Pipetas Pasteur
EDTA 1 mM) Pipetas automáticas
Cebolla (Allium cepa) Centrífuga
Cuchillo Espectrofotómetro y cubetas UV

2.3. A Extracción de DNA genómico de cebolla

Para evitar la desnaturalización del DNA es necesario agitar con suavidad. Una vez obtenido
el DNA es recomendable usar guantes y material estéril para no contaminarlo con DNasas.

2. Parte 1- Preparación del homogeneizado de cebolla (Preparación para 5-8 grupos)

1. Preparar 100 ml de Tampón de lisis. [Lo hacen los técnicos de laboratorio]
Para ello, mezclar
5 ml de Tris 1 M, pH 8,0
5 ml de EDTA 0,5 M
6 ml de NaCl 5 M
y llevar a 100 ml con agua destilada. Determinar la composición del tampón preparado.
2. Tomar 60-80 g de una cebolla pequeña pelada. Pesarla en papel de aluminio y apuntar el
peso (peso húmedo).
3. Trocearla con un cuchillo (fragmentos de aproximadamente 1 cm3) y colocarla en un vaso
de plástico con un volumen de tampón de lisis (es decir, el mismo número de mililitros de
tampón que gramos de peso húmedo del tejido se hayan utilizado).
4. Homogeneizar la muestra con un homogeneizador de aspas durante 1-1,5 minutos a baja
velocidad hasta que se forme una papilla homogénea.
5. Filtrar el homogeneizado a través de gasa doble utilizando un embudo. Recoger el filtrado
en un Erlenmeyer de 250 ml y medir el volumen obtenido.

3. Parte 2- Precipitación del DNA (Lo hace cada grupo de modo independiente)
1. Pipetear 10 ml del filtrado de cebolla en un tubo de plástico estéril (Falcon) de 50 ml.
2. Añadir al tubo 1 ml de SDS al 10 % y agitar suavemente durante 4 minutos.
3. Añadir al tubo 0,1 ml de la disolución de proteasa. Dicha disolución contiene glicerol como
conservante, por lo que se debe disolver completamente en la mezcla por agitación suave.
Dejar actuar la proteasa 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Añadir 10 ml de etanol al 96 % frío (a -20ºC), usando una pipeta Pasteur y dejándolo
resbalar por las paredes del recipiente para que se formen claramente dos fases. La
adición del etanol se debe realizar muy lentamente, sin agitar el tubo y evitando que se
mezclen las dos fases.
5. Dejar el tubo en reposo durante 5-10 minutos en un baño de hielo. Se forman burbujas y el
DNA precipita en la fase de etanol, formando “hilos-madejas” de color blanco.
 59
6. Recoger el DNA utilizando una pipeta Pasteur con un pequeño gancho en su extremo.
Introducir el ganchito en el tubo por encima de la interfase, girarlo repetidamente para que
las fibras de DNA se enrollen en el mismo. Extraer el DNA y dejar invertida la pipeta
Pasteur sobre una gradilla de modo que el gancho quede en la parte de arriba.
7. Lavar la madeja de DNA obtenida con 1 ml de etanol al 70 % frío. Dejar secar el
precipitado al aire durante 5-10 minutos hasta que deje de oler a etanol.
8. Disolver el DNA en 2 ml de tampón TE a 55ºC; si hay poco DNA, disolverlo en 0,5-1 ml.
Añadir el tampón TE en un tubo de centrífuga, introducir el ganchito con la madeja de DNA,
y mover con suavidad para que se libere. Agitar repetidamente y mantener a 55ºC hasta
que se disuelva. Si quedara material insoluble, centrifugar 5 minutos a 3000 rpm.
9. Conservar la muestra, marcada como DNA y el número de grupo, en frío (0-4ºC, si es un
día, o congelada a -20ºC, si es más tiempo) hasta su utilización.

2.3. B Caracterización espectroscópica de DNA

Los ácidos nucleicos absorben la luz UV debido a la presencia de bases aromáticas
nitrogenadas en la molécula; la banda principal de absorción se localiza a 260 nm. Aunque
cada una de las bases presenta un espectro de absorción característico, para muchas
aplicaciones la contribución de cada una de las bases al espectro de absorción UV de una
molécula de DNA bicatenario (dsDNA) de alta masa molecular puede considerarse
equivalente. Para determinar la concentración de dsDNA de alta masa molecular,
plásmidos o productos de PCR, se mide en un espectrofotómetro la absorbancia a 260 nm
que presenta la disolución. Se considera que una disolución de DNA bicatenario puro con
una concentración de 50 µg/ml presenta una absorbancia a 260 nm de una unidad. La
misma absorbancia presenta una disolución de DNA monocatenario a 33 µg/ml o una de
RNA a 40 µg/ml.

Disolución de dsDNA a 50 µg/ml Abs 260 nm = 1,0

En plantas, el rendimiento de los procesos de extracción de DNA genómico es en

general bajo, suele encontrarse entre 10 y 300 μg de DNA por gramo de tejido. El
rendimiento depende del protocolo utilizado, del tejido, del tamaño del genoma y de la
ploidía (número de juegos completos de cromosomas de la célula).

Figura 1. Espectros característicos

de proteína y DNA en la
región UV
 60
A pesar de la purificación, la muestra de DNA está siempre parcialmente contaminada
con proteínas. El DNA presenta un máximo de absorción a 260 nm, mientras que a 280 nm
absorbe aproximadamente la mitad. Por otro lado, las proteínas presentan un máximo de
absorción a 280 nm. El cálculo de la relación entre los valores de absorbancia a 260 y 280 nm
(Abs260/Abs280) es una manera común de expresar la pureza de la preparación y mostrar si
existe algún contaminante proteico. La relación Abs260/Abs280 en una buena preparación de
DNA bicatenario se encuentra próxima a 1,7-1,8. Un valor superior indica contaminación por
RNA o por oligonucleótidos monocatenarios. Un valor inferior indica contaminación por
proteínas (el triptófano presenta una gran absorbancia a 280 nm) o por fenol (máximo de
absorción a 270 nm).

Disolución dsDNA puro Abs 260 nm / Abs 280 nm ≈ 1,8

Método
1. Preparar tres tubos Eppendorf con: i) 1 ml de tampón TE (blanco); ii) 1 ml de la muestra de
DNA genómico; iii) 0,2 ml de la muestra de DNA más 0,8 ml de tampón TE.
2. Medir en el espectrofotómetro con cubetas para UV. Registrar la línea base utilizando como
blanco tampón TE.
3. Registrar el espectro de absorción de la muestra de DNA entre 220 y 340 nm. Anotar los
valores de absorbancia de la muestra a 260 y 280 nm. Si es necesario, proceder de igual
forma con la muestra diluida (iii).
4. Calcular la concentración de DNA de la muestra original, teniendo en cuenta las diluciones
realizadas.
5. Estimar la pureza de la muestra obtenida con la relación Abs260/Abs280
6. Calcular el rendimiento en DNA obtenido (µg DNA por g de cebolla).

2.3. C Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

La agarosa es un polímero lineal de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa que se disuelve
en agua por calentamiento y al enfriarse forma una estructura tridimensional de tipo gel. Las
aplicaciones más importantes de este tipo de geles son las relacionadas con la separación de
moléculas de tamaño molecular elevado, como son los ácidos nucleicos: DNA y RNA. El
tamaño del poro formado dependerá de la concentración de agarosa, de forma que a mayor
concentración, mejor separación de fragmentos pequeños, y a menor concentración, mejor
separación de fragmentos grandes. Los ácidos nucleicos poseen carga neta negativa debido
a la ionización de los numerosos grupos fosfato presentes en el esqueleto de enlaces
fosfodiéster. Por lo tanto, en disolución a pH neutro o básico, al someterlos a un campo
eléctrico en un gel de agarosa, todas las moléculas de ácido nucleico migran hacia polo
positivo. Al entrar en los poros del gel las moléculas grandes sufren un retraso al pasar con
mayor dificultad entre la trama del gel, lo que produce una disminución en la velocidad de
migración de las moléculas que será dependiente del tamaño molecular e independiente de la
carga. Por tanto, la velocidad de migración es inversamente proporcional a la longitud de las
cadenas polinucleotídicas (↔masa molecular), existiendo una relación lineal entre el
logaritmo de la masa molecular y la distancia de migración desde el punto de aplicación.
Además, hay que tener en cuenta que la conformación espacial de las moléculas de ácido
 61
nucleico también afecta a la migración en el gel (DNA circular, lineal, grado de
“enrollamiento”, multímeros, etc). Si se utilizan patrones de ácidos nucleicos de tamaño
molecular conocido, se puede, una vez transcurrida la electroforesis, visualizarlos y medir su
distancia de migración. Con estos datos, bien comparando la posición relativa de las bandas
o bien construyendo una curva patrón que relacione la distancia de migración con la masa
molecular se puede estimar el tamaño molecular en Kb de los fragmentos existentes en las
muestras analizadas. El patrón de tamaños moleculares que se suele emplear consiste en
una mezcla de fragmentos lineales de DNA, normalmente obtenidos por digestión de un DNA
conocido (fago lambda, fago φ29, etc.) con algún enzima de restricción (Hind III, BstE II, …).

La electroforesis en geles de agarosa puede utilizarse también para determinar la

calidad del DNA genómico obtenido. Esta calidad estará en función de dos factores: la
ausencia de fragmentación inespecífica cuando el DNA no ha sido tratado con una
endonucleasa, y su facilidad para ser cortado de forma específica cuando se digiere con una
endonucleasa. En muchas técnicas de diagnóstico molecular en pacientes es fundamental la
obtención de DNA de alta calidad, para así garantizar la reproducibilidad del diagnóstico
obtenido. Un DNA genémico no digerido debe presentar en electroforesis un aspecto de
banda definida de elevada masa molecular, mientras que ese mismo DNA digerido debe
presentar un aspecto de mancha alargada y uniforme o “smear” (borrón), resultado de la gran
diversidad de tamaño de los fragmentos generados por la digestión específica con la
endonucleasa. Por ejemplo, la secuencia de corte de la endonucleasa EcoRI es una
secuencia frecuente en el DNA: 5’-GAATTC-3’. Un DNA de baja calidad presenta aspecto de
“smear” en ausencia de digestión con endonucleasa.
 62
PARTE PRÁCTICA

Materiales y reactivos
Agarosa Balanza
GelRed 500X (Biotium) Bandeja de gel, peine
Tampón TAE (Tris-Acetato 40 mM, Cinta de autoclave
pH 7,6, EDTA 2 mM) Horno microondas
Tampón TC 6X de carga de DNA: Cubeta de electroforesis horizontal
(glicerol 50 %, azul bromofenol 1 mg/ml) Fuente de alimentación
Patrón de tamaños de DNA Pipetas automáticas
Puntas y tubos estériles

Para el análisis del DNA obtenido se utilizará un gel de agarosa al 1,0 % (m/v) (separa
adecuadamente fragmentos de entre 0,8 y 10 Kb). Para la visualización de las bandas, el gel
se tiñe con “GelRed”. Es un compuesto empleado en la tinción de dsDNA, ssDNA y RNA para
el análisis por electroforesis tanto de agarosa como de acrilamida; está diseñado para utilizar
transiluminación con luz UV (máximo de absorción λ = 310/312 nm y máximo de emisión λ =
600 nm). Aunque el GelRed se considera menos peligroso que el bromuro de etidio, ya que
es más soluble en agua, hay que evitar el contacto directo con él. UTILIZAR GUANTES.

Preparación del gel de agarosa [Lo hacen los técnicos de laboratorio]

1. Estimar la superficie de la bandeja en la que se va a preparar el gel y calcular el volumen
de disolución de agarosa necesaria para que éste alcance una altura de 0,4 – 0,6 cm.
(Para un gel, unos 60 ml)
2. Cerrar los extremos de la bandeja con cinta adhesiva. Colocar el peine a menos de 1 cm
del extremo superior de la bandeja y de modo que la altura de los dientes sobre la
superficie de la bandeja sea de aprox. 1-2 mm. Colocar la bandeja sobre un papel de filtro.
3. Pesar la agarosa para preparar una disolución al 1 % (m/v) en TAE 1X. Añadirla a un
erlenmeyer de capacidad superior al volumen final de gel que se vaya a preparar (ej: 250
ml). Añadir el volumen de TAE 1X correspondiente y agitar con cuidado de que no quede
agarosa por la pared del erlenmeyer.
4. Calentar en el microondas justo hasta que la disolución comience a hervir. (Observar
continuamente e interrumpir rápidamente el calentamiento cuando la disolución empiece a
hervir para evitar que la agarosa se derrame fuera del erlenmeyer). Retirar el erlenmeyer
del microondas (¡¡Quema!!). Agitarlo suavemente sin formar burbujas hasta disolución
completa de la agarosa.
5. Dejar que se enfríe ligeramente (hasta unos 50-60ºC, caliente pero sin que queme), añadir
10 μl de GelRed 500X y mezclar bien.
6. Verter la disolución de agarosa en la bandeja con el peine y dejar enfriar hasta que se
produzca la gelificación (30 min aprox.).
7. Una vez solidificado el gel, retirar el peine con cuidado para evitar que se rompan los
pocillos. Guardar en la nevera si no se va a usar en el momento. Para su uso, retirar la
cinta adhesiva de los extremos de la bandeja e introducir ésta con el gel en el interior de
una cubeta de electroforesis llena de tampón TAE 1X de manera que el gel quede
completamente sumergido. El nivel del TAE debe quedar 2-3 mm por encima de la
superficie del gel. Colocar una cartulina negra o similar debajo de la cubeta de
electroforesis para facilitar la localización de los pocillos en la carga de muestras.
 63
Preparación de las muestras y desarrollo de la electroforesis
1. Muestra de DNA de cebolla. Para preparar la muestra hay que tener en cuenta que: (i) se
necesita aplicar aproximadamente 1,0 µg DNA por pocillo para ver bien la banda; (ii) los
pocillos del gel admiten un volumen máximo de 25 µl; iii) se utilizará un tampón de carga
de DNA concentrado 6 veces (TC 6X)
En un Eppendorf se añade: (1) el volumen de la muestra de DNA de cebolla que contenga
aprox. 1,0 µg DNA; (2) el volumen de tampón TC 6X que corresponda a un volumen final
de preparación (3 µl de TC 6X para 18 µl de volumen final ó 4 µl de TC 6X para 24 µl de
volumen final); (3) si es necesario, agua o tampón TE para completar el volumen total.
2. Preparar en paralelo una muestra patrón con fragmentos de DNA de tamaño conocido
(marcador de masas moleculares).
3. Agitar y dar un pulso de centrifugación a los tubos Eppendorf con las muestras preparadas.
3. Colocar el gel de agarosa en la cubeta de electroforesis y añadir tampón TAE 1X hasta que
el líquido cubra por completo la superficie del gel. Empleando una pipeta automática,
cargar las muestras, con cuidado de no dañar los pocillos y de que no difundan. Anotar en
el cuaderno el orden de aplicación de las muestras en el gel.
4. Conectar la cubeta a la fuente de tensión y mantener el voltaje a 90 V.
5. Detener la electroforesis cuando se estime que la separación de las bandas de DNA sea la
apropiada. Tomar como referencia los colorantes incluidos en el tampón de carga de DNA.

Visualización del DNA en el gel

1. Desconectar la fuente de tensión. Retirar el gel con guantes y con cuidado de no dañarlo.
Transportarlo sobre una bandeja o tartera.
2. Colocar el gel sobre el transiluminador de luz ultravioleta. Capturar la imagen con ayuda de
un analizador de imágenes. Usar guantes.

ELIMINACIÓN DE RESIDUOS: El gel se maneja siempre con guantes y se desechará en un

recipiente específico.

Resultados
 Anotar el peso de cebolla utilizado, volumen de tampón de lisis añadido, el volumen del
filtrado y el color y aspecto de la muestra en cada etapa.
 Indicar los volúmenes de muestra y de etanol utilizados en la precipitación. Anotar el
aspecto del DNA precipitado, las condiciones de secado y de disolución, el aspecto de
la disolución final de DNA.
 Registrar cualquier incidencia que se haya podido producir durante el proceso de
extracción y que se aparte de lo esperado
 Imprimir y pegar en el cuaderno el espectro de absorción de la muestra
 Anotar los valores de Abs260 y Abs280 de cada dilución de la muestra.
 Calcular la relación Abs260/Abs280 y discutir el significado del valor obtenido.
 Calcular la masa total de DNA existente en la preparación final de DNA.
 Calcular el rendimiento o cantidad de DNA obtenida por unidad de masa de tejido (μg de
DNA por g de cebolla).
 Imprimir y pegar en el cuaderno la imagen de la electroforesis.
 Estimar la calidad del DNA obtenido en función del aspecto del mismo en la
electroforesis.
 64
SUPPLEMENTARY QUESTIONS
1.- Considering the genomic DNA extraction protocol, answer the following questions: (a)
What are the roles of SDS and ethanol in a DNA extraction protocol? (b) How would you
check if the extracted DNA is degraded? (c) How can you quantify the amount of DNA
obtained? (d) If you ran an agarose gel electrophoresis and the loaded DNA remained in
the well (it did not move), what would you change in the gel composition?
2.- Complete the following Table, knowing that the digestion of onion DNA with BamHI (an
restriction enzyme) was carried out in a total volume of 30 µl and using the relationship that
an A260 of 1,0 corresponds to 50 µg/ml pure dsDNA.
Required Final Required stock
Component Stock solution
Concentration Volume (μl)
BamHI 1000 U/ml 0,1 U/μl
BSA 1 mg/ml 0,1 mg/ml
Buffer 10X 1X
Abs260=1
DNA 1 μg
(dilution 1/10)
Sterile water = μl
Final volume = μl
3.- Genomic DNA was extracted from an orange and it was resuspended in 30 μl of sterile
water in a 1,5 ml-Eppendorf tube. Then, 2 μl of this solution were diluted with 598 µl of
water. The absorbance at 260 nm of the diluted sample was 0,2. (a) Calculate the
concentration of the original extracted DNA (b) What volume would you take to digest 30
μg of genomic DNA with EcoRI (a restriction enzyme)? (c) Which amount of genomic
DNA would remain in the Eppendorf tube after performing the spectrophotometric
measurement and the enzymatic digestion? (d) In order to check if the genomic DNA was
properly digested by the restriction enzyme, an agarose gel electrophoresis was carried
out. How much agarose is needed to prepare a 0,8 % (w/v) agarose gel in a final volume
of 50 ml of TAE buffer? (e) What volume do you need of 50X TAE to prepare the gel?
4.- Kiwi DNA was obtained by three different protocols. See in the following Figure the results
of the agarose gel electrophoresis analysis of the extracted DNA preparations and
discuss about the three DNA extraction protocols. Why is it convenient to run a number of
standard DNA markers of known molecular mass on the same agarose gel in which the
samples are run? How are these DNA size markers (or DNA ladder) generated?

Protocol A Protocol B Protocol C

1 2 3 4 5 6 7

Figure – Photograph showing seven

tracks from a 0,8 % agarose gel, stained
with ethidium bromide and viewed under
ultraviolet light. Sample loadings were
about 1 μg DNA per track. Track 1,
Lambda (λ) DNA cleaved with the enzyme
BstEII to generate fragments in the size
range from 14,1 kb to 702 pb. Tracks 2
and 3, DNA extracted following protocol
A. Tracks 4 and 5, DNA extracted
following protocol B. Tracks 6 and 7, DNA
extracted following protocol C.
 65

2.4. CARACTERIZACIÓN ESPECTROSCÓPICA DE PROTEÍNAS

2.4.1. Introducción
Las proteínas están constituidas por aminoácidos que se unen entre sí mediante
enlaces peptídicos. Algunas proteínas para ser funcionales necesitan, además del esqueleto
polipeptídico, la participación de compuestos de naturaleza no proteica. Cuando se trata de
moléculas orgánicas pequeñas fuertemente asociadas con la cadena polipeptídica, estos
compuestos se denominan grupos prostéticos. Por tanto, en una proteína puede haber hasta
tres componentes susceptibles de absorber en la zona ultravioleta-visible (UV-VIS): los enlaces
peptídicos, las cadenas laterales de algunos aminoácidos y los grupos prostéticos.
- El enlace peptídico absorbe en la zona del UV lejano. La longitud de onda donde tiene
su máximo de absorción se encuentra en torno a los 200 nm. En el espectro de absorción
de una proteína es la banda más intensa.
- Las cadenas laterales de los aminoácidos aromáticos tienen bandas de absorción en el
intervalo entre los 230 y 300 nm, es decir, en la zona del UV próximo. En concreto, las
cadenas laterales de los aminoácidos aromáticos (triptófano y tirosina) absorben entre los
260-290 nm. Los puentes disulfuro también absorben en ese intervalo de λ, pero su
escasez relativa y su bajo ε suelen hacer irrelevante su contribución al espectro.

Figura 1. Características espectroscópicas de los aminoácidos aromáticos.

- Los grupos prostéticos de las cromoproteínas presentan bandas de absorción en la

zona del visible, por lo que estas proteínas suelen ser coloreadas. Ejemplos de estas
proteínas son la hemoglobina, los citocromos y las flavoproteínas.

La hemoglobina (Hb), proteína contenida en los eritrocitos cuya función es el transporte de

oxígeno a través de la sangre, es un tetrámero compuesto de dos subunidades α y dos
 66
subunidades β. Cada subunidad contiene un grupo prostético denominado hemo. Tanto
el estado de oxidación del átomo de hierro presente en el grupo hemo, como la presencia
o no del oxígeno molecular, se traducen en importantes cambios en su espectro en la
zona del visible, como se muestra en la Figura 2.
──────────────────-------───────────────────------────────────────────
Derivado de la hemoglobina λ máximos absorción (nm)
───────────────────────────--------─────────────────────────────────
Hemoglobina (Hb, DesoxiHb o FerroHb)...... 555 430 ---
Oxihemoglobina............................................. 577 541 413
CO-Hemoglobina........................................... 570 535 418
Metahemoglobina (Hemiglobina. ó ferriHb).. 630 500 406
───────────────────────────────────-──-------───────────────────────

Figura 2. Características espectroscópicas de las diferentes formas de hemoglobina.

La espectroscopía de absorción UV-VIS es una herramienta muy versátil que permite realizar
gran variedad de determinaciones a la hora de estudiar las proteínas. Así, el registro de la
absorbancia a alguna de las longitudes de onda de sus bandas características, sirve para
detectarlas, por ejemplo mediante medidas a 214 nm, 280 nm o a la longitud de onda de su
máximo de absorción en la región del visible, si presenta un grupo prostético. Cuando se trata
de preparaciones de proteínas aisladas, se puede emplear su coeficiente de extinción para
calcular su concentración.

Conviene recordar algunas ideas en relación con el coeficiente de extinción de los cromóforos
en general, y de las proteínas en particular:
a) El coeficiente de extinción de cualquier cromóforo depende, entre otros factores, del entorno
en que se encuentre dicho cromóforo (ej.: disolvente).
b) Hay que distinguir entre el coeficiente de extinción molar, ε, al que acudiremos cuando las
concentraciones del cromóforo se expresen en unidades molares, y el E0,1 %, que
emplearemos cuando las concentraciones del cromóforo se expresen en mg/mL
 67

c) El coeficiente de extinción molar teórico de una proteína a 280 nm se puede calcular si

se conoce el número de aminoácidos aromáticos (i.e., nº Trp, nº Tyr) y puentes disulfuro
(i.e., nº puentes S-S) presentes en la proteína. Para este cálculo se aplicará la siguiente
fórmula1:

ε proteína 280 nm = (nº Trp ꞏ εw 280 nm) + (nº Tyr ꞏ εY 280 nm) + (nº puentes S-S ꞏ εS-S 280 nm)
en la que εw 280 nm = 5500 M–1 cm –1, εY 280 nm = 1490 M–1 cm –1 y εS-S 280 nm = 125 M–1 cm –1.
Estos son los coeficientes de extinción molares correspondientes a los aminoácidos libres,
por lo que el coeficiente de extinción teórico que se calcula con esta fórmula sólo es
aplicable cuando se pueda asumir que la conformación proteica es tal que las cadenas
laterales de sus aminoácidos aromáticos absorben igual que si fuesen aminoácidos libres.
En proteínas globulares esto sólo se cumple en condiciones desnaturalizantes que permitan
asegurar que la proteína se encuentra desplegada, y, por tanto, que las cadenas laterales de
sus residuos están en contacto directo con el disolvente, como ocurre con los aminoácidos
libres. En otros términos, el coeficiente de extinción teórico de una proteína calculado con la
fórmula anterior puede tomarse como una buena aproximación del coeficiente de extinción
molar de la proteína en estado desnaturalizado. En el caso de proteínas plegadas, este
coeficiente de extinción molar teórico diferirá, más o menos, del que se determine
experimentalmente; pudiendo tomar esta diferencia como manifestación indirecta de la
existencia de plegamiento proteico.

d) La determinación experimental del coeficiente de extinción de una proteína plegada se

realiza, por aplicación directa de la expresión de Lambert-Beer, a partir de medidas de
absorbancia de disoluciones de concentración perfectamente conocida de la proteína nativa
(i.e., ε280 = A280/Cprotꞏl). En la expresión anterior, Cprot se refiere a la concentración molar
perfectamente conocida de la proteína en estudio, y ε280, el coeficiente de extinción molar
que se calcula a partir de la medida experimental de A280. Es fácil deducir que el valor que
tome este coeficiente de extinción molar será la absorbancia a 280 nm, medida en cubeta de
1 cm de paso óptico, que presentaría una disolución 1 M de la proteína nativa. Si, en lugar
de unidades molares, la concentración de proteína se expresara en unidades de mg/mL
(cprot), entonces la expresión de Lambert Beer equivalente a la anterior sería, E0,1 %280 = A280/
cprotꞏl. De forma análoga a lo mencionado para el coeficiente de extinción molar, ahora E0,1
%
280 es sencillamente la absorbancia a 280 nm, medida en cubeta de 1 cm de paso óptico,
que presentaría una disolución de 1 mg/mL de la proteína nativa. Es fácil demostrar que ε280
= E0,1 %280 × MW, siendo MW la masa molecular de la proteína en cuestión.

2.4.2. Objetivo de la práctica

Introducir al alumno en la utilización de técnicas espectroscópicas para el estudio de
proteínas. Mediante la realización de espectros se calculará la concentración de una
disolución de proteína y se seguirán los cambios estructurales de la hemoglobina.

11Pace, C.N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., and Gray, T. (1995) How to measure and predict the
molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 11, 2411-2423.
 68

PARTE PRÁCTICA

Materiales y reactivos
Cubetas de UV y VIS Disolución de albúmina de suero bovino 1 mg/ml
Micropipetas y puntas Disolución de metahemoglobina 1 mg/ml
Espectrofotómetro Disolución de ditionito sódico 10 mg/ml

2.4. A Caracterización espectroscópica de proteínas: albúmina de suero bovino

La albúmina de suero bovino, abreviada BSA por sus siglas en inglés, es una proteína
sérica con numerosas aplicaciones debido tanto a su estabilidad y su falta de efecto sobre las
reacciones bioquímicas, como a su fácil obtención y bajo coste. La proteína madura, constituida
por una única cadena polipeptídica con 583 aminoácidos, presenta un punto isoeléctrico en
agua de 4,7.
Método
1. Preparar dos tubos Eppendorf: i) 1 ml de agua (blanco);
ii) 1 ml de la disolución de BSA a 1 mg/ml.
2. Registrar el espectro de absorción entre 220 y 340 nm, con cubeta para UV:
i) utilizando el blanco, registrar la línea base del espectro;
ii) usando la disolución de BSA, registrar el espectro.
3. Anotar la absorbancia de la disolución de BSA a 280 nm.

2.4. B Caracterización espectroscópica de proteínas: hemoglobina

Cuando la hemoglobina une oxígeno tiene lugar un cambio en su espectro de absorción y
el color de la sangre cambia de rojo oscuro (color púrpura) a rojo brillante (escarlata). Durante
la desoxigenación tiene lugar el proceso inverso, causa de la diferencia de color entre la sangre
venosa y arterial. En ambas formas de la hemoglobina, desoxihemoglobina y oxihemoglobina,
el hierro del grupo hemo está presente en la forma ferrosa (Fe2+), ya que la unión del oxígeno
durante el proceso de oxigenación no produce su oxidación. Si el hierro ferroso es oxidado a
férrico (Fe3+) se forma la metahemoglobina. La metahemoglobina es biológicamente inactiva,
no puede combinarse con el oxígeno ni con el monóxido de carbono.
Método
1. Reactivos: Si la disolución de metahemoglobina 1 mg/ml en agua presenta turbidez,
centrifugarla antes de proceder. Disolución de ditionito sódico 10 mg/ml, se disuelve
en el momento en que se vaya a usar, ya que se descompone con rapidez.
2. Preparar tres tubos de ensayo, cada uno de ellos con 2 ml de la disolución anterior:
i) Se deja como control, corresponde a la metahemoglobina.
ii) Añadir 2 gotas de la disolución de ditionito sódico y agitar con suavidad. El
ditionito reduce el Fe3+ del hemo a Fe2+ y se forma desoxihemoglobina.
iii) Al tercer tubo se le añaden 2 gotas de ditionito sódico y se agita para que se
airee bien. En este tubo la hemoglobina une oxígeno y pasa a oxihemoglobina.
Anotar las diferencias de color observadas y si es posible, hacer una foto.
3. Registrar los espectros de las diferentes formas de la hemoglobina entre 400 y 700
nm, empleando una cubeta de VIS.
i) utilizando agua, registrar la línea base del espectro;
ii) usando 2 ml de la disolución de metahemoglobina, registrar el espectro;
iii) añadir 2 gotas de ditionito sódico a la cubeta anterior; para mezclar, taparla e
invertirla un par de veces. Registrar el espectro;
iv) agitar la disolución contenida en la cubeta, absorbiendo y vertiendo el
contenido con una pipeta Pasteur, para airearla. Registrar el espectro.
 69

Reultados
 Anotar cómo se han preparado las muestras para hacer los espectros y el aspecto de
las mismas. Imprimir y pegar los espectros en el cuaderno.
 Describir el espectro de la BSA.
 Averiguar la masa molecular de la BSA, así como el número de triptófanos, tirosinas y
puentes disulfuro que contiene la proteína madura. Tener en cuenta que la BSA se
sintetiza con un péptido señal que posteriormente se elimina, para originar la forma
madura de la proteína. Para ello, se puede emplear la base de datos UniProt
(www.uniprot.org) y el programa ProtParam del servidor bioinformático ExPASy
(web.expaxy.org/protparam/)
 Determinar el coeficiente de extinción molar teórico de la BSA a 280 nm, utilizando la
fórmula y el número de triptófanos, tirosinas y puentes disulfuro de la proteína madura.
Calcular el coeficiente de extinción E0,1 % 280 nm teórico para la BSA.
 Detallar en el cuaderno los cambios observados en cuanto al color y espectro de las
formas de la hemoglobina.

SUPPLEMENTARY QUESTIONS
1- Indicate in the following spectrum: (a) The
wavelength at what the peptide bond absorbs
(b) Where do the aromatic amino acid side-
chains absorb? Which of the aromatic amino
acids may produce the peak? (c) If the
protein contains a chromophore, where will it
absorb? (d) Assume that you are carrying out
a purification protocol and that you have to
detect specifically the presence of this
protein, at what wavelength would you
measure it? Why? (e) At what wavelength
would you measure, if you want to know the
total protein content in a sample?

2- The extinction coefficient of a protein (molecular mass 12 024 Da) can be accurately
determined by absorbance and dry weight measurements. A solution containing about 2
mg/ml of protein was filtered through a Millipore filter, and its absorbance at 280 nm was
0,43, when using 1 cm-pathlength quartz cuvettes. Three aliquots of 3 ml of this solution
were dialyzed overnight against distilled water. Thereafter, the aliquots were pipetted into
preweighed tubes and dried at 90 °C and then to 108 °C until they reached constant
weight. After this, the amount of protein determined for each aliquot was: 5,6574 mg,
5,5847 mg and 5,6863 mg, respectively. Calculate the specific extinction coefficient (E0,1 %,
(mg/ml)–1 cm–1) and the molar extinction coefficient (ε, M–1 cm–1) at 280 nm for the protein.

3- A solution containing NAD+ and NADH shows absorbances of 0,311 and 1,2 at 340 nm
and 260 nm, respectively, in a 1 cm-pathlength cuvette. Calculate the concentration of
NAD+ and NADH present in the solution. Take into account that both compounds absorb at
260 nm, but only NADH absorbs at 340 nm.
Table - Values of molar extinction coefficients for NAD+ and NADH

ε (M–1 cm–1)
Nucleotide 260 nm 340 nm
NAD+ 18000 ≈0
NADH 15000 6220
 70

2.5. DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE UNA ENZIMA

2.5.1. Introducción
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.
Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo catalítico y la
especificidad de la enzima. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede
medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la
enzima. Hay que tener en cuenta que la velocidad de la reacción es función de muchos
factores incluyendo: concentración de enzima, concentración de sustrato, tiempo de medida
(el tiempo que se deja que la reacción transcurra), pH, temperatura y medio del ensayo,
concentración de activadores o inhibidores presentes.

Como en cualquier reacción química, la

velocidad de una reacción catalizada por
una enzima se expresa como la variación en
la concentración de sustrato o de producto
con el tiempo. Al seguir la velocidad de
aparición de producto (o de desaparición del
sustrato) en función del tiempo se obtiene la
llamada curva de avance o curva de
progreso de la reacción (ver Figura). A
medida que la reacción transcurre, la
velocidad de acumulación del producto va
disminuyendo porque se va consumiendo el
sustrato de la reacción. En cinética
enzimática para evitar esta complicación se
procede a medir la velocidad inicial de la reacción (v0), que es igual a la pendiente de la
curva de progreso a tiempo cero. La medida de v0 se realiza antes de que se consuma el 5-
5-10 % del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la concentración de sustrato
como esencialmente constante a lo largo del experimento. Además, en estas condiciones no
es necesario considerar la reacción inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan
pequeña que la reacción inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican mucho las
ecuaciones de velocidad.

Para determinar los parámetros cinéticos de una enzima, se mide el efecto de la

concentración de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción, manteniendo fijos el resto
de los factores de los que depende la velocidad. Así la medida se realiza habitualmente con
una cantidad de enzima constante y en las condiciones óptimas de pH, temperatura,
presencia de cofactores, etc. En las reacciones catalizadas por enzimas con frecuencia se
observa que a medida que se aumenta la concentración de sustrato aumenta la velocidad
inicial de la reacción, pero para concentraciones de sustrato elevadas la velocidad inicial de
la reacción tiende a estabilizarse. Este comportamiento es el que describe la ecuación de
Michaelis-Menten:
 71
La determinación de la constante de Michaelis (Km) y de la velocidad máxima (Vmax)
se puede llevar a cabo mediante el ajuste de los datos experimentales directamente a la
ecuación de Michaelis-Menten, o bien empleando transformaciones lineales de la misma
tales como la representación de Lineweaver-Burk (o dobles inversas) o la representación de
Hanes-Woolf, cuyas ecuaciones son, respectivamente:

2.5.2. La enzima fosfatasa alcalina

Las fosfatasas son enzimas que catalizan la liberación del grupo fosfato de los ésteres
monofosfóricos. En el suero se valoran habitualmente dos tipos de fosfatasa: ácida y
alcalina. La fosfatasa ácida está ampliamente distribuida en el organismo; la valoración de la
isoenzima prostática se emplea en el diagnóstico del cáncer de próstata. Fosfatasa alcalina
(FA, fosfato-monoéster fosfohidrolasa, EC 3.1.3.1) es la denominación que se aplica a un
grupo de fosfatasas, con un pH óptimo de aproximadamente 10, presentes en prácticamente
todos los tejidos, fundamentalmente en hueso, hígado, riñón, intestino y placenta. Es una
metaloglicoproteína que en suero presenta formas diméricas solubles y simétricas; cada
subunidad contiene un centro activo, un ion Mg2+ y dos iones Zn2+. La determinación de su
actividad en suero tiene interés clínico para el diagnóstico diferencial de la ictericia, en
enfermedades óseas y en algunos procesos cancerosos.
Una propiedad interesante de la fosfatasa alcalina es su escasa especificidad de
sustrato, lo que permite actuar sobre diversos compuestos. La valoración de su actividad se
llevará a cabo a pH alcalino, empleando como sustrato el fenilfosfato disódico (FFDS). Este
compuesto se hidroliza liberando fenol y fosfato. El fenol liberado se determinará
colorimétricamente con el reactivo Folin (King, EJ, and Armstrong, AR (1934).Can Med
Assoc J, 31: 376).

FA
a) Fenilfosfato disódico (FFDS) + H2O Fenol + Fosfato
Reacción enzimática

en medio básico
b) Fenol + Reactivo de Folin Abs680nm
Reacción colorimétrica

2.5.3. Objetivo de la práctica

Introducir al alumno en la cinética enzimática en el estado estacionario. Mediante la
realización de una serie de ensayos enzimáticos se abordará el concepto de velocidad inicial
de la reacción y los procedimientos para determinar los parámetros cinéticos.
 72

PARTE PRÁCTICA
Materiales y Reactivos
Tubos de ensayo Tampón carbonato-bicarbonato 10 mM, pH 10
Micropipetas Fenilfosfato disódico (FFDS) 1,4 mM en
tampón carbonato-bicarbonato
Baño termostatizado Reactivo Folin-Ciocalteau diluido 1/4
Cronómetro Na2CO3 al 10 % (m/v)
Colorímetro o espectrofotómetro Fosfatasa alcalina de mucosa intestinal
bovina (0,15 mg sólido/ml en tampón)

2.5. A Determinación de los parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina

La actividad de la fosfatasa alcalina se valora por el método de King y Armstrong,
mediante un ensayo indirecto discontinuo que emplea fenilfosfato disódico en medio básico
como sustrato. La reacción enzimática se detiene al añadir el reactivo de Folin (pH ácido). La
reacción colorimétrica posterior para cuantificar el fenol liberado requiere el reactivo de Folin y
un medio fuertemente básico que se consigue adicionando carbonato sódico.

Se determinará la velocidad inicial de la reacción para cinco concentraciones de

sustrato (0,1, 0,25, 0,5, 0,75 y 1 mM). Para cada concentración de sustrato se prepararán 7
tubos, uno de ellos será el control (sin enzima) y en los otros 6 se detiene la reacción
enzimática a distintos tiempos (entre 1 y 10 minutos), de modo que se pueda construir la curva
de avance de la reacción.

a) Sustrato (FFDS) 5 min + enzima ≠ tiempos + Folin

+ tampón 1,3 ml 37ºC 0,1 ml 37ºC 0,6 ml

30 min
b) Muestra 2,0 ml + Na2CO3 0,5 ml Absorbancia 680 nm

Método
1. Preparar y rotular los tubos según se indica en la Tabla de la página 76.
2. Pipetear en cada uno de ellos el volumen correspondiente de sustrato (FFDS 1,4 mM) y
tampón carbonato-bicarbonato pH 10.
3. Añadir 0,6 ml de reactivo de Folin a los tubos control. De esta forma, cuando se añada la
enzima se inactivará de inmediato, y se podrán utilizar estos tubos para corregir las
absorbancias de cada concentración de sustrato.
4. Introducir los tubos en un baño termostatizado a 37ºC y dejar 5 minutos.
5. Para comenzar la reacción enzimática, a intervalos exactos de 20 segundos, añadir
sucesivamente 0,1 ml de enzima a cada tubo, agitar y volver a introducirlo en el baño
termostatizado. Es necesario disponer de una tabla de tiempos (pág. 75) donde se
indique el orden y el tiempo de comienzo y de parada de la reacción enzimática en cada
tubo; conviene empezar por los tubos que se van a incubar tiempos más largos.
6. Para detener la reacción enzimática, se añade 0,6 ml de reactivo de Folin al tubo
correspondiente, se agita y se saca del baño termostatizado.
7. Una vez detenida la reacción enzimática en todos los tubos, se prepara el blanco (1,4 ml
 73
tampón + 0,6 ml Folin) y se procede a realizar la reacción colorimétrica. Se añade a cada
tubo 0,5 ml de Na2CO3, se agita y se incuba a temperatura ambiente 30 minutos.
8. Leer y anotar la absorbancia a 680 nm de cada tubo, ajustando el cero en el colorímetro
con el blanco

ELIMINACIÓN DE RESIDUOS: una vez medida la absorbancia el contenido de los tubos de

ensayo se desechará en el bidón de “RESIDUOS DE FOLIN”.

Análisis de resultados
1. En cada serie de tubos (misma concentración de sustrato), a la absorbancia de los
ensayos con enzima se le resta la absorbancia del control. Se obtiene así la absorbancia
corregida, magnitud linealmente relacionada con la cantidad de producto (fenol) presente
en el ensayo y originado por la enzima
2. Para cada concentración de sustrato se construye la curva de progreso de la reacción,
representado los valores de absorbancia corregida en función del tiempo de incubación.
Esta curva debe ser lineal al principio, pero pierde la linealidad a medida que la reacción
transcurre. La velocidad inicial de la reacción se determina a partir de la pendiente de la
parte inicial de la curva (variación de absorbancia a 680 nm por minuto).
3. Representar la velocidad inicial de la reacción frente a la concentración de sustrato.
Ajustar por ordenador los valores experimentales de velocidad inicial y concentración de
sustrato a la ecuación de la hipérbola de Michaelis Menten.
4. Hacer las representaciones lineales de Lineweaver-Burk y Hanes-Woolf. Determinar el
valor de Km y Vmax a partir de los ajustes por mínimos cuadrados a las ecuaciones
correspondientes.

Resultados
 Tabla de pipeteos y tabla de tiempos utilizados.
 Valores de absorbancia originales y corregidos para cada tubo
 Curva de progreso de reacción para cada concentración de sustrato (A680 frente al
tiempo). Cálculo de las velocidades iniciales
 Representación de velocidad inicial de reacción frente a la concentración de sustrato.
Valores de los parámetros cinéticos Km y Vmax obtenidos a partir del ajuste por
mínimos cuadrados a la hipérbola.
 Representación lineal de Lineweaver-Burk y de Hanes-Woolf. Valores de los
parámetros cinéticos Km y Vmax calculados a partir de las representaciones.
 Determinar los valores de kcat y kcat/Km para la reacción catalizada por la enzima,
teniendo en cuenta que: (i) se dispone de una curva patrón para la cuantificación del
fenol producido en el ensayo (ver Figura pág. 74); (ii) la masa molecular del monómero
de la fosfatasa alcalina utilizada es de 81000 Da; (ii) la preparación de fosfatasa
utilizada contiene un 10 % de enzima (m/m).
 74

Figura – Cuantificación de fenol por el método de Folin en el ensayo de la

Fosfatasa alcalina. Se representan los valores de Absorbancia a 680 nm frente a la
concentración micromolar de fenol presente en 1,4 ml del ensayo enzimático.

SUPPLEMENTARY QUESTIONS
1. - After the purification of an enzyme, the final preparation contained 0,23 g of protein in 5
ml of buffer. Determine the specific activity, expressed as U/mg of protein, knowing that
0,5 ml of the final preparation transformed 4,7 mmol of substrate in 30 s.
2. - A purified hydrolytic enzyme (molecular mass 150 000 Da) was commercially available
with the following description: “The enzyme has a Vmax of 3200 U/ mg protein under
optimal assay conditions". (a) How many µmoles of substrate can be hydrolyzed in one
minute by 1 mg of the purified enzyme? (b) How many nmoles of the enzyme are
contained in 1 mg of protein? (c) Assuming that it is pure, determine the molecular activity
or turnover number (s-1) for the enzyme,
3.-Test tubes containing different concentrations of substrate were incubated with 1 ug of
enzyme (molecular mass 40 000 Da) in a final volume of 4 ml. At intervals of 30 s, a 0,5 ml
aliquot was withdrawn from the reaction mixture and the amount of product formed was
assessed (see Table). Determine the initial velocity (v0, μmol product formed per minute)
for each substrate concentration.
Product (µmol)
Substrate (mmol/L) 0s 30 s 60 s 90 s
2 0 0,44 0,89 1,33
3 0 0,57 1,15 1,71
5 0 0,73 1,45 2,17
15 0 1,11 2,20 3,32
40 0 1,35 2,71 4,06
100 0 1,40 2,73 4,02
200 0 1,44 2,79 4,05

4. – Without plotting, analyze the results of the previous question and estimate the values for
Vmax and Km. After this, draw a Michaelis-Menten plot and a Lineweaver-Burk plot and
determine the values of Vmax and Km.
 75

TABLA DE TIEMPOS Fosfatasa alcalina

tiempo
Tubo
EMPEZAR (+ enzima) PARAR (+ Folin)
A1 0 1´
B1 20” 1´ 20”
1 min C1 40” 1´ 40”
D1 1´ 2´
E1 1´ 20” 2´ 20”
A2 1´ 40” 3´ 40”
B2 2´ 4´
2 min C2 2´ 20” 4´ 20”
D2 2´ 40” 4´ 40”
E2 3´ 5´
A3 3´ 20” 7´ 20”
B3 3´ 40” 7´ 40”
4 min C3 4´ 8´
D3 4´ 20” 8´ 20”
E3 4´ 40” 8´ 40”
A4 5´ 11´
B4 5´ 20” 11´ 20”
6 min C4 5´ 40” 11´ 40”
D4 6´ 12´
E4 6´ 20” 12´ 20”
A5 6´ 40” 14´ 40”
B5 7´ 15´
8 min C5 7´ 20” 15´ 20”
D5 7´ 40” 15´ 40”
E5 8´ 16´
A6 8´ 20” 18´ 20”
B6 8´ 40” 18´ 40”
10 min C6 9´ 19´
D6 9´ 20” 19´ 20”
E6 9´ 40” 19´ 40”
 Preparación Ensayo enzimático Parada Colorimetría
[SUSTRATO] FFDS 1.4 mM TAMPÓN FOLIN ENZIMA Incubación 37 ºC FOLIN Na2CO3 10% Absorbancia Abs. 680 nm
TUBO Nº
en el ensayo (ml) (ml) (ml) (ml) TIEMPO (min) (ml) (ml) 680 nm corregida
A cont. 1.0 0.3 0.6 0.1 0 --- 0.5
A1 1.0 0.3 --- 0.1 1 0.6 0.5
A2 1.0 0.3 --- 0.1 2 0.6 0.5
A3 1.0 0.3 --- 0.1 4 0.6 0.5
1.0 0.3 --- 0.1 6 0.6 0.5

1.00 mM
A4
A5 1.0 0.3 --- 0.1 8 0.6 0.5
A6 1.0 0.3 --- 0.1 10 0.6 0.5
B cont. 0.75 0.55 0.6 0.1 0 --- 0.5
B1 0.75 0.55 --- 0.1 1 0.6 0.5
B2 0.75 0.55 --- 0.1 2 0.6 0.5
B3 0.75 0.55 --- 0.1 4 0.6 0.5
0.75 0.55 --- 0.1 6 0.6 0.5

0.75 mM
B4
B5 0.75 0.55 --- 0.1 8 0.6 0.5
B6 0.75 0.55 --- 0.1 10 0.6 0.5
C cont. 0.5 0.8 0.6 0.1 0 --- 0.5
C1 0.5 0.8 --- 0.1 1 0.6 0.5
C2 0.5 0.8 --- 0.1 2 0.6 0.5
76

C3 0.5 0.8 --- 0.1 4 0.6 0.5

0.5 0.8 --- 0.1 6 0.6 0.5

0.50 mM
C4
C5 0.5 0.8 --- 0.1 8 0.6 0.5
C6 0.5 0.8 --- 0.1 10 0.6 0.5
D cont. 0.25 1.05 0.6 0.1 0 --- 0.5
D1 0.25 1.05 --- 0.1 1 0.6 0.5
D2 0.25 1.05 --- 0.1 2 0.6 0.5
D3 0.25 1.05 --- 0.1 4 0.6 0.5
0.25 1.05 --- 0.1 6 0.6 0.5

0.25 mM
D4
D5 0.25 1.05 --- 0.1 8 0.6 0.5
D6 0.25 1.05 --- 0.1 10 0.6 0.5
E cont. 0.1 1.2 0.6 0.1 0 --- 0.5
E1 0.1 1.2 --- 0.1 1 0.6 0.5
E2 0.1 1.2 --- 0.1 2 0.6 0.5
E3 0.1 1.2 --- 0.1 4 0.6 0.5
0.1 1.2 --- 0.1 6 0.6 0.5

0.10 mM
E4
E5 0.1 1.2 --- 0.1 8 0.6 0.5
E6 0.1 1.2 --- 0.1 10 0.6 0.5
BLANCO: 1.4 ml de tampón Carbonato-Bicarbonato 10 mM, pH 10 + 0.6 ml FOLIN + 0.5 ml Na2CO3
 77

BLOQUE 3: PURIFICACIÓN DE ENZIMAS:

LISOZIMA DE CLARA DE HUEVO DE GALLINA

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 78

3.1. INTRODUCCIÓN
El nombre de lisozima o muramidasa (péptidoglicano N-acetil-muramil hidrolasa, EC
3.2.1.17) se aplica a los diferentes componentes de un grupo de enzimas que catalizan la
hidrólisis de enlaces glicosídicos β (1-4) de los polisacáridos de la pared celular bacteriana.
Concretamente, posee actividad β (1-4) glucosaminidasa sobre polímeros de N-
acetilglucosamina (NAG) y N-acetilmurámico (NAM) que junto con una serie de
componentes polipetídicos forman la estructura tridimensional de las paredes bacterianas.
Su efecto bacteriolítico fue descrito por primera vez por Fleming en 19222. Esta enzima se
encuentra en secreciones humanas (saliva, lágrima, mucus nasal, bronquial y cervical, sudor
y plasma sanguíneo) así como en otros vertebrados, invertebrados, bacterias, virus y
plantas. Debido a esta distribución tan amplia se ha considerado que pertenece a un sistema
primitivo e inespecífico de defensa también llamado “inmunidad innata”. La lisozima fue la
primera enzima secuenciada, la primera de la que se dispuso de un modelo tridimensional
(por cristalografía de rayos X) y la primera para la que se propuso un mecanismo catalítico
detallado3.
Las diferentes lisozimas pueden diferir significativamente en su estructura primaria, si
bien todas ellas son proteínas globulares, constituidas por una única cadena polipeptídica y
con una serie de características comunes:
a) Son proteínas básicas (pI= 10,5 - 11,0)
b) Su masa molecular es baja (14000 - 30000 Da)
c) Son estables a pH ácido
d) Presentan actividad lítica frente a Micrococcus lysodeikticus (bacteria Gram-
positiva, actualmente denominada Micrococcus luteus).

De todas las proteínas pertenecientes al grupo de las lisozimas, la más estudiada es la

de clara de huevo de gallina. En este bloque, para poner a punto la purificación de lisozima
de clara de huevo de gallina, se llevarán a cabo de modo comparativo dos tipos de
cromatografía: la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de exclusión
molecular.
La CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO es un tipo de cromatografía en la
que la fase estacionaria tiene grupos cargados que interaccionan electrostáticamente con los
iones de signo contrario de la fase móvil. Los distintos intercambiadores de iones se
diferencian en la naturaleza de sus grupos cargados (grupos con carga positiva en los
intercambiadores de aniones, o con carga negativa en los intercambiadores de cationes), así
como en el tipo de matriz o soporte al cual están anclados esos grupos cargados (silicatos,
polisacáridos o polímeros sintéticos). El grado de movilidad de un ión es función de su
capacidad de ionización, de la concentración de otros iones presentes y de la afinidad
relativa por los grupos cargados del intercambiador. Ajustando el pH y la fuerza iónica de la
fase móvil, los iones unidos mediante fuerzas electrostáticas al intercambiador son eluídos
diferencialmente, para así conseguir la separación deseada.

2
Fleming A. & Allison V.D. (1922). Observations on a bacteriolytic substance (lysozyme) found in secretions
and tissues. Br J Exp Pathol 13, 252-260.
3
Vocadlo D.J., Davies G.J., Laine R. & Withers S.G. (2001). Catalysis by hen egg-white lysozyme proceeds via
a covalent intermediate. Nature 412, 835-838.
 79
La CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR es una técnica que separa
moléculas en función de su tamaño molecular, utilizando polímeros reticulados inertes como
tamiz molecular (ver sección 2.1.2). La técnica se puede aplicar, además de en la
determinación de la masa molecular de proteínas en su estado nativo, en el proceso de
purificación de proteínas.

Consulte en el Campus Virtual la ficha de “Purificación de proteínas” para recordar las

etapas más importantes del proceso. Antes de iniciar una purificación, es recomendable
recabar información a partir de lo publicado por otros autores (consulte la ficha de
“Bibliografía”).
Resultados que deben figurar en el cuaderno de laboratorio (indicado como ©):
Buscar en las bases de datos PubMed o Web of Sciences con las palabras clave “Lysozyme,
purification”. Apuntar en el cuaderno la referencia completa de 3 artículos, indicando título,
autores, año de publicación, nombre de la revista, volumen y páginas. Para cada una de las
referencias, indicar qué material biológico se emplea como fuente de lisozima y qué técnicas
de fraccionamiento utilizan.

3.2. OBJETIVOS EXPERIMENTALES

El objetivo principal de este bloque es proponer un método para la purificación de la
enzima lisozima a partir de clara de huevo de gallina. Para ello, se aprovechan las
características propias y diferenciales de la enzima. Así, en primer lugar, se somete a la
clara de huevo a un tratamiento con medio ácido y a un breve período de calentamiento, con
lo que se consigue desnaturalizar otras proteínas sin que se afecte la lisozima.
A continuación, se neutraliza la preparación y se lleva a cabo una cromatografía de
intercambio iónico utilizando Amberlita CG-50, una resina con restos carboxilo ionizados a pH
neutro y básico. En el tampón utilizado a pH 6,6, la lisozima es prácticamente la única proteína
que se une a la Amberlita; posteriormente puede disociarse de la resina mediante lavado con
un tampón de alta fuerza iónica.
Con fines comparativos, en lugar de la cromatografía de intercambio iónico, se puede
llevar a cabo una cromatografía de exclusión molecular en Sephadex G-75. La lisozima, debido
a su baja masa molecular, puede separarse de otras proteínas contaminantes de mayor
tamaño.
Una vez realizado el proceso de purificación, se determinará la actividad y la cantidad de
proteína presente en las diferentes fracciones con objeto de establecer el grado de purificación
y la recuperación de la enzima a lo largo del proceso. Todos estos datos se recogen en una
tabla de purificación. La composición de proteínas de las diferentes fracciones se analizará
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. A partir de los datos de la tabla y de los
geles, se propondrá un método de purificación de la lisozima sugiriendo mejoras posibles.

3.3. PURIFICACIÓN DE LA LISOZIMA DE CLARA DE HUEVO DE GALLINA

Materiales y reactivos:
1 l de ácido acético 0,1 M *
100 ml de tampón fosfato potásico 0,6 M, pH 6,6 *
Sephadex G-75 o Amberlita CG-50
350 ml de tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 6,6 *
50 ml de tampón fosfato potásico 1 M, pH 7,0 *
Material biológico: huevo de gallina
Gasa y embudo
Tubos de centrífuga y centrífuga
Baño termostatizado
Espectrofotómetros y colorímetros
 80

© Apuntar en el cuaderno los cálculos de la elaboración de los tampones señalados con *.

© Elaborar un esquema del aislamiento en el cuaderno antes de empezar. Apuntar en el
cuaderno el color del huevo y sus características.

3.3.1. Preparación del extracto enzimático (E1)

1. Separar cuidadosamente la yema de la clara. Pasar la clara a una probeta y medir su
volumen.
2. Diluir la clara 1/4 con ácido acético 0,1 M y agitar durante 5 min a temperatura ambiente.
3. Filtrar a través de una gasa doble colocada en un embudo, recogiendo el filtrado en un
Erlenmeyer limpio.
4. Cada equipo debe partir de 16 ml de la preparación de clara diluida y filtrada y
centrifugar 5 min a 4500 rpm.
5. Medir el volumen de sobrenadante (E1). Guardar en la nevera una alícuota de 1 ml de
E1 bien rotulada, para valorar posteriormente concentración de proteína, ensayar la
actividad enzimática y analizarlo por electroforesis.
© Apuntar en el cuaderno el volumen de E1, la presencia o no de sedimento y color del
mismo.

3.3.2. Tratamiento térmico (E2)

1. Incubar el sobrenadante E1 en un baño de agua a 60ºC durante 5 min.
2. Centrífugar a 4500 rpm durante 5 min.
3. Del sobrenadante de esta centrifugación (E2), medir el volumen y guardar otra alícuota
de 1 ml en la nevera para valorar proteínas, medir la actividad enzimática y someterla a
una separación electroforética.
© Apuntar en el cuaderno el volumen de E2, la presencia o no de sedimento y color del mismo.

3.3.3. Cromatografía de intercambio iónico (E3)

* Tipo de resina: Amberlita CG-50 (Matriz de poliestireno entrecruzado con ácido metacrílico.
Intercambiador de cationes, débilmente ácido).
* Montaje y equilibrado de la columna: Adicionar la Amberlita en la columna de vidrio ( 3
cm), colocada en posición vertical sobre el soporte, equipada con goma de salida y pinza
Hoffman, y con un filtro de lana de vidrio en su extremo inferior. La resina se deja sedimentar,
por gravedad, hasta una altura de unos 3 cm. Para eliminar el exceso de líquido, abrir la salida
de la columna con cuidado de que la columna no quede nunca seca. Una vez empaquetada la
columna, equilibrar la resina con tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 6,6 ( 100 ml).
* Preparación de la muestra: En un vaso de precipitado pequeño se adicionan 2 ml de
tampón fosfato potásico 1 M, pH 7,0, por cada 10 ml del extracto E2. Agitar suavemente y
comprobar que el pH de la mezcla está entre 6,5 y 6,7.

Desarrollo de la cromatografía:
1. CARGA o aplicación de la muestra. Abrir la llave de paso de la columna y dejar salir el
tampón hasta que prácticamente no quede líquido sobre la resina. Cerrar la columna y
cargar cuidadosamente la muestra (mezcla de E2 y tampón fosfato): dejarla resbalar
lentamente por las paredes de la columna para que penetre en la resina sin alterar el
frente del lecho. Abrir de nuevo la llave y empezar a recoger fracciones; mantener un
flujo lento hasta que apenas quede de muestra sobre la superficie de la resina.
 81
2. LAVADO. Una vez que ha penetrado la muestra, lavar la columna con tampón fosfato
potásico 0,1 M, pH 6,6 ( 120 ml). Se recogen manualmente fracciones de 10 ml
hasta que se comprueba, mediante medidas de absorción a 280 nm, que no eluye
más proteína.
3. ELUCIÓN. Se emplea tampón fosfato potásico 0,6 M, pH 6,6 ( 60 ml) para eluir las
proteínas retenidas en la columna, recogiendo fracciones de 3 ml de las que se mide
absorbancia a 280 nm.
4. Elaborar un cromatograma, representando Abs280 frente a número de fracción para
todas las fracciones eluídas de la columna.
5. Para establecer la posición de la lisozima en el perfil de elución, se determina la
actividad enzimática (ver apartado 3.4) de aquellas fracciones que presentan
absorbancia a 280 nm. Representar sobre el perfil cromatográfico previo los valores
de actividad de lisozima de cada fracción en UAL/ml.
6. Seguidamente, juntar los tubos más significativos (con mayor actividad de lisozima)
de acuerdo con los criterios de pureza y actividad específica, y medir el volumen de la
preparación final obtenida, a la que se denominara E3. Mantener el extracto
enzimático en la nevera o en hielo mientras no se utilice.
© Representar el perfil de elución de la cromatografía (Absorbancia a 280 nm y unidades de
actividad enzimática, UAL/ml, para cada fracción eluída de la columna).
© Indicar qué fracciones se juntan para formar E3 y su volumen.

3.3.4. Cromatografía de exclusión molecular (E3´)

* Tipo de gel: Sephadex G-75 (polímero de dextrano, con un intervalo de fraccionamiento para
proteínas globulares de: 3000-80000 Da).
* Equilibrado de la columna: Se va a utilizar la columna montada en el apartado 2.1, pero la
cromatografía se llevará a cabo en ácido acético 0,1 M.
Colocar un reservorio con ácido acético 0,1 M a la altura adecuada para obtener un
buen flujo y equilibrar la columna (pasar 2,5 veces el volumen de lecho). Determinar el flujo de
la columna en mililitros por hora y comprobar el pH del eluído final.
© Apuntar en el cuaderno las características de la columna, indicando altura y diámetro de la
misma, el flujo (ml/h), y volumen de exclusión y volumen total (determinados previamente).
* Aplicación de la muestra y desarrollo de la cromatografía:
1. Aplicar en la columna 1 ml del extracto de clara de huevo tratado térmicamente (E2),
siguiendo el procedimiento descrito en la sección 2.1.A.
2. La cromatografía se desarrolla en ácido acético 0,1 M, recogiendo fracciones de 2 ml,
hasta que haya eluído un volumen un 20 % mayor que el volumen total de la columna.
3. Medir la absorbancia a 280 nm de las diversas fracciones recogidas y elaborar el
cromatograma (representar Abs280 frente a número de fracción).
4. Para detectar la posición de la lisozima en el perfil de elución, determinar la actividad
enzimática (apartado 3.4) de aquellas fracciones que presentan absorbancia a 280
nm. Representar sobre el cromatograma anterior los valores de actividad (UAL/ml)
para las distintas fracciones eluídas de la columna.
5. Tras juntar los tubos más significativos (con mayor actividad de lisozima) de acuerdo
con los criterios de pureza y actividad específica, medir el volumen de la preparación
final (E3'). Mantener el extracto E3´ en hielo o en nevera mientras no se utilice.
 82

© Representar el perfil de elución de la cromatografía (Absorbancia a 280 nm y unidades de

actividad enzimática, UAL/ml, para cada fracción eluída de la columna).
© Indicar qué fracciones se juntan para formar E3 y su volumen.

3.3.5. Análisis del proceso de purificación

Con objeto de establecer la bondad del procedimiento empleado, hay que construir
una tabla de purificación. Para ello es necesario determinar la concentración de proteínas y
la actividad enzimática de las fracciones E1, E2 y E3 (o E3´). Además, una alícuota de cada
una de estas fracciones se aplicará en una electroforesis para poder evaluar el grado de
pureza de la preparación final obtenida. Cuando en la electroforesis se desee aplicar
cantidades comparables de proteína de todas las muestras será necesario concentrar la
fracción E3 (o E3´). Para reducir la alta concentración de sales en E3 o de ácido acético en
E3´, se dializan 2 ml de E3 (o E3´) frente a tampón fosfato 0,01 M, pH 6,6, antes de poder
proceder a concentrar la muestra.
© Apuntar en el cuaderno qué muestra se dializa y en qué condiciones, cómo se concentra y
en qué volumen final se obtiene. Calcular la concentración de proteína de la muestra
dializada una vez concentrada.

3.4. ENSAYO ENZIMÁTICO

La lisozima es capaz de lisar las paredes bacterianas. Para medir su actividad se
emplean paredes de Micrococcus lysodeikticus. La medida de la actividad se lleva a cabo
utilizando una suspensión de agregados de paredes celulares del microorganismo en
concentración suficientemente elevada para atenuar, por dispersión, la transmisión de luz
monocromática a través de la cubeta de un colorímetro o espectrofotómetro4. Al incubar esta
suspensión con lisozima los fragmentos de pared celular se hidrolizan originando otros más
pequeños, lo que reduce la dispersión de luz y se manifiesta en una reducción en la turbidez de
la suspensión. Este efecto se puede cuantificar midiendo la absorbancia aparente o densidad
óptica (D.O.) a una longitud de onda fija de 450 nm, longitud de onda a la que la contribución a
la absorbancia de la enzima, el tampón y la pared celular es mínima. La actividad enzimática
será, por tanto, proporcional a la disminución en la densidad óptica a 450 nm.
Materiales y reactivos:
Paredes de Micrococcus lysodeikticus 0,3 mg/ml en tampón fosfato 0,1 M, pH 6,6
Tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 6,6 Espectrofotómetros y colorímetros

* Protocolo
La suspensión de paredes celulares de Micrococcus lysodeikticus debe ser agitada cada vez
que se vaya a emplear.
1. Ajustar el cero de absorbancia del colorímetro con tampón fosfato 0,1 M pH 6,6.
2. Pipetear 2 ml de la suspensión de paredes bacterianas en la cubeta del colorímetro y
anotar su densidad óptica a 450 nm (debe estar entre 0,6-0,7, en colorímetro, y entre
1,2-1,3, en espectrofotómetro).

4
Morsky P. (1983). Turbidimetric determination of lysozyme with Micrococcus lysodeikticus cells:
reexamination of reaction conditions. Anal. Biochem. 128, 77-85.
 83
Asegurarse de que dicho valor se mantiene constante en los diferentes ensayos que
se realicen, ya que refleja la concentración inicial de sustrato.
3. Sacar la cubeta del colorímetro y añadir 0,2 ml de la fracción a ensayar; disparar el
cronómetro y AGITAR. Volver a introducir la cubeta en el colorímetro y sin retirarla,
medir la densidad óptica cada 0,5 minutos durante 3 minutos.
Para poder cuantificar la velocidad de la reacción, la desaparición de turbidez debe
ser lineal durante el tiempo de medida; si no es así, se debe diluir la muestra de
lisozima con tampón fosfato 0,1 M, pH 6,6 y repetir el ensayo hasta que sea lineal.

* Cálculos
La actividad enzimática de la lisozima se cuantifica midiendo la velocidad de la reacción
de lisis de las paredes bacterianas. Por tanto, la actividad será proporcional a la velocidad con
la que disminuye en el ensayo la densidad óptica a 450 nm.
En condiciones estándar de ensayo (25ºC, pH 6,6, fosfato 0,1 M) se define la unidad de
actividad enzimática para la lisozima (UAL) como la cantidad de enzima capaz de producir
una disminución en la densidad óptica a 450 nm de 0,001 por minuto.
Para cuantificar la actividad enzimática de una muestra en UAL/ml se representa la
densidad óptica a 450 nm frente al tiempo en minutos. En un ensayo donde la variación de
densidad óptica con el tiempo sea lineal, se determina la pendiente (D.O.450nm/min) que
corresponde a la velocidad de reacción. En el cálculo final hay que tener en cuenta la variación
de densidad óptica por minuto que corresponde una UAL, el volumen de muestra empleado en
el ensayo y las diluciones previamente realizadas con la muestra.

UAL D. O. 450 nm 1 𝑈𝐴𝐿 1

𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 ∗ 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 
𝑚𝑙 𝑚𝑖𝑛 0.001/𝑚𝑖𝑛 0.2 𝑚𝑙

© Para cada muestra, representar la D.O. a 450 nm frente al tiempo y determinar la actividad
enzimática en UAL/ml.
© Juntar las fracciones que presentan actividad de lisozima para formar E3. Anotar qué
fracciones se juntan y el volumen total de E3.
© Determinar la actividad en UAL/ml de E1, E2 y E3.

3.5. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS

Se realiza según el método de Bradford5 . Dicho procedimiento se basa en el hecho de
que en medio ácido la unión del azul de Coomassie a las proteínas causa un desplazamiento
de la longitud de onda del máximo de absorción del colorante de 465 nm a 595 nm, de modo
que la absorbancia a 595 nm es directamente proporcional a la concentración de proteínas de
la muestra. El azul de Coomassie se une mediante interacciones electrostáticas e hidrofóbicas
a las cadenas laterales de residuos de aminoácidos básicos y aromáticos. Estas interacciones
son suficientemente fuertes y estables para ser utilizadas en métodos de cuantificación.
Preparación del reactivo de Bradford: Se disuelven 100 mg de azul de Coomassie G-250
en 50 ml de etanol al 95 % (v/v) y se añaden 100 ml de ácido fosfórico al 85 % (m/v). La
disolución resultante se diluye al volumen final de 1 litro.

5
Bradford M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing
the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
 84
Materiales y reactivos:
Reactivo de Bradford Espectrofotómetros y colorímetros
Disolución de BSA 0,2 mg/ml

* Protocolo
1. Preparar 0,3 ml de las muestras a ensayar.
2. Añadir a cada tubo 2,7 ml de reactivo de Bradford, agitando enérgicamente.
3. Medir la absorbancia a 595 nm, después de 5 minutos y antes de 1 hora.
* Desarrollo experimental
El volumen de muestra emplear es siempre 0,3 ml. El blanco contendrá 0,3 ml de agua
destilada más 2,7 ml de reactivo de Bradford. Hay que preparar una recta patrón partiendo de
una disolución de BSA 0,2 mg/ml (intervalo de linealidad: 0,02-0,2 mg/ml). Elaborar una tabla
de pipeteos que incluya al menos 8-10 concentraciones de BSA.
Cuando sea necesario, se diluirán previamente las muestras a ensayar con agua
destilada. Las muestras E1, E2 y E3, adecuadamente diluidas, se ensayarán por duplicado.
ELIMINACIÓN DE RESIDUOS: una vez medida la absorbancia el contenido de los tubos de
ensayo se desechará en el bidón de “RESIDUOS DE BRADFORD”.

* Cálculos
Dibujar la curva patrón representando absorbancia a 595 nm frente a concentración (mg
BSA/ml existentes en 0,3 ml de muestra).
Calcular la media de los valores de absorbancia registrados para cada muestra;
interpolarla en la curva patrón y obtener la concentración de proteína de la muestra analizada.
Determinar la concentración de la muestra original, considerando las diluciones realizadas
antes de aplicar el protocolo del ensayo.

© Recoger en el cuaderno la tabla de pipeteos elaborada y la curva patrón obtenida, así como
las diluciones de las muestras efectuadas.
© Calcular las concentraciones de E1, E2, E3 (mg proteína/ml) interpolando los valores de
Abs595 de las muestras en la curva patrón.

3.6. ELECTROFORESIS PAGE-SDS

Se llevará a cabo una electroforesis en condiciones desnaturalizantes (PAGE-SDS)
según el método de Laemmli6 (ver sección 2.2.). Para ello, preparar un gel al 15 % de
acrilamida. En el gel se cargarán: E1, E2, E3 dializado y concentrado, el máximo de proteína
no retenido en la cromatografía de intercambio iónico o los máximos de la cromatografía de
exclusión molecular, junto con la mezcla de proteínas patrón de masa molecular conocida
(ver página 55). En algunos casos, para disminuir la cantidad de proteína aplicada en el gel
será necesario diluir las muestras con agua destilada antes de añadir el tampón de
muestras.
Tras la electroforesis teñir el gel la disolución de teñido, conteniendo Azul de
Coomassie R-250, desteñirlo adecuadamente y analizar los resultados.

6 Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature 277, 680-685.
 85
ELIMINACIÓN DE RESIDUOS: La disolución de tinción, se recupera en su botella original. La
disolución de desteñido, se elimina en el bidón “RESIDUOS de ELECTROFORESIS”:
Procesamiento de los resultados ©
1. Calcular los microgramos de proteína aplicados en el gel de cada una de las muestras.
2. Determinar la distancia migrada en el gel separador por el frente, por las proteínas
patrones y por las proteínas más abundantes en cada una de las muestras.
3. Construir la curva de calibrado representando el logaritmo de la masa molecular frente a
la distancia migrada por cada una de las proteínas patrones empleadas (ver sección
2.2.).
4. Determinar la masa molecular de las proteínas mayoritarias presentes en las
preparaciones E1, E2 y E3. Determinar la masa molecular de la lisozima.
5. Evaluar el grado de pureza de la preparación final de lisozima obtenida.

3.7. SEGUIMIENTO DEL PROCESO: TABLA DE PURIFICACIÓN

La purificación de una proteína es un procedimiento, que consta de varias etapas,
cuyo objetivo final es recuperar una proteína específica partiendo de una mezcla compleja. A
medida que se realiza la purificación se construye una tabla descriptiva denominada Tabla
de purificación que permite realizar un seguimiento de la purificación de la proteína de
interés. Si se trata de una enzima, la cantidad de enzima presente en cada etapa se
cuantifica midiendo la actividad enzimática de la misma.
En cada paso se pierde actividad enzimática, las enzimas son frágiles y se degradan,
además la recuperación de una proteína tras una etapa de purificación nunca es del 100 %.
Pese a las perdidas, en cada paso de purificación la relación entre la actividad enzimática y
la cantidad de proteína total (cociente denominado actividad específica) debe aumentar.
También es importante cuantificar la cantidad de la proteína de interés que se recupera
respecto a la existente en la preparación inicial (rendimiento o recuperación, expresado en
porcentaje). La purificación ideal es aquella en la que al final solo queda la proteína que
queríamos aislar. Esto lo comprobaremos mediante la electroforesis (PAGE-SDS).

Proteína Actividad Actividad

ETAPA Volumen total total Específica Rendimiento Purificación
total (ml) (mg) (UAL) (UAL/mg) (%) (nº de veces)

E1
E2
E3

Actividad total (U) Actividad (U/ml)

ACTIVIDAD ESPECÍFICA (U/mg) = =
Proteína total (mg) Proteína (mg/ml)

Actividad total en etapa “n”

RENDIMIENTO ( % ) = x 100
Actividad total en extracto inicial

Actividad Específica etapa “n”

PURIFICACIÓN ( nº veces ) =
Actividad. Específica extracto inicial
 86

3.8. CARACTERIZACIÓN DE LA LISOZIMA PURIFICADA

Siempre que se disponga del tiempo suficiente, se sugiere llevar a cabo una
caracterización más detallada de la lisozima purificada. Por ejemplo se podría estudiar el
efecto del pH y la fuerza iónica sobre la actividad enzimática, así como el efecto de la
temperatura sobre la estabilidad de la enzima.

3.9. RESULTADOS QUE DEBEN FIGURAR EN EL CUADERNO DE

LABORATORIO
 Cálculos de la elaboración de los tampones.
 Esquema del aislamiento.
 Observaciones sobre el color/forma/origen del huevo, presencia o no y color de los
sedimentos, volúmenes de E1, E2 y E3.
 Características de la columna cromatográfica utilizada.
 Perfil de elución de la cromatografía (Absorbancia a 280 nm y unidades de actividad
enzimática (UAL/ml) para cada fracción eluída de la columna).
 Figuras para la determinación de la actividad de lisozima de cada fracción valorada
anotando la dilución realizada. Valores de actividad enzimática para las fracciones de la
cromatografía y las preparaciones E1, E2 y E3.
 Curva de calibrado para determinar la concentración de proteína. Diluciones utilizadas y
concentración final de proteína obtenida para E1, E2 y E3.
 Proceso de diálisis y preparación de las muestras para la electroforesis. Apuntar cuántos
microgramos de proteína se cargan por pocillo.
 Indicar en la foto del gel obtenido, qué se ha cargado en cada calle y qué se puede
apreciar. Identificar las proteínas patrones de masa molecular
 Recta de calibrado para determinar masas moleculares en la electroforesis. Estimar la
masa molecular de la lisozima y de las proteínas mayoritarias presentes en E1 y E2.
 Estimar la masa molecular de la lisozima nativa a partir de su volumen de elución en la
columna de Sephadex G-75 previamente calibrada.
 Tabla de purificación para la lisozima y discusión de los resultados obtenidos. Analizar
en paralelo los datos de la Tabla de purificación y los resultados de la electroforesis.

Elaborar un informe que recoja una propuesta razonada para aislar la lisozima a partir
de clara de huevo de gallina, utilizando los datos experimentales propios y los de, al menos, un
equipo que haya hecho una cromatografía diferente a la efectuada. Incluir una breve
introducción, materiales y métodos, resultados, discusión y citas bibliográficas. Consultar en el
Campus virtual las fichas “Elaboración de Informes” y “Cómo citar Bibliografía”.
 87

BLOQUE 4: LAS ENZIMAS COMO CATALIZADORES:

CARACTERIZACIÓN CINÉTICA DE
LA β-GLUCOSIDASA DE ALMENDRA
 88

4.1. INTRODUCCIÓN
Las -glucosidasas (-D-glucósido glucohidrolasa, EC 3.2.1.21) constituyen un grupo
amplio, heterogéneo y bien caracterizado de enzimas dentro de las glicosidasas. Las
glicosidasas (o glicósido hidrolasas, EC 3.2.1) son enzimas que hidrolizan enlaces O- o S-
glicosídicos entre dos o más carbohidratos o entre un carbohidrato y una parte de distinta
naturaleza (no-carbohidrato) denominada aglicona (Figura 1). Las -glucosidasas catalizan
la hidrólisis del enlace O--glicosídico en el extremo terminal no reductor de oligosacáridos
de cadena corta, disacáridos y aril- o alquil--D-glucósidos, liberando -D-glucosa. En
determinadas condiciones, la enzima es también capaz de catalizar la reacción de
transglicosilación (Figura 1), es decir, la síntesis de un enlace glicosídico entre diferentes
moléculas Dicha reacción constituye un proceso biológico dirigido a la modificación de
moléculas pequeñas con el fin de aumentar su solubilidad, estabilidad y actividad biológica
[1], lo que ha suscitado gran interés por sus aplicaciones biotecnológicas [2,3].

Figura 1. Reacciones catalizadas por las β-glucosidasas

Las -glucosidasas están extensamente distribuidas en la naturaleza. Dependiendo del

organismo del que proceden y de la especificidad de sustrato de la enzima, las -
glucosidasas están implicadas en diferentes funciones fisiológicas [4]. En bacterias y
hongos, las -glucosidasas se encuentran fundamentalmente formando parte de complejos o
sistemas multienzimáticos denominados celulasas [5], que se encargan de la degradación
de la celulosa, polímero lineal de -D-glucosa muy abundante en la biomasa (Figura 2). En
dichos sistemas la actuación sinérgica de las enzimas endoglucanasa (EC 3.2.1.4) y
celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91) sobre la celulosa origina oligosacáridos de cadena corta y
celobiosa, los cuales, a su vez, son hidrolizados por la -glucosidasa produciendo glucosa
[6]; esta última etapa es la etapa limitante de la velocidad del proceso global (Figura 3).
 89

Figura 2. Estructura de la celulosa. La celulosa es un polímero lineal, insoluble, formado por

unidades de D-glucosa unidas mediante enlaces ß-1,4-glicosídicos, con un elevado grado de
polimerización. Las distintas cadenas de celulosa interaccionan entre sí mediante numerosos
puentes de hidrógeno intermoleculares, formando fibrillas que resultan ser muy resistentes al
ataque químico.

Figura 3. Sistema multienzimático celulasa,

responsable de la degradación de la celulosa.
EG: endoglucanasa; CBH: celobiohidrolasa
(exoglucanasa); y BG: β-glucosidasa.

En plantas [7], las -glucosidasas son

 90
muy abundantes y están implicadas en importantes funciones incluyendo: i) reciclado de los
oligosacáridos de la pared celular durante su remodelación (germinación de las semillas,
procesos de lignificación, …); ii) mecanismos de defensa química frente a patógenos y otras
plagas, mediante la liberación de compuestos tales como saponinas, terpenos, cumarinas,
tiocianatos o ácido cianhídrico (HCN) a partir de los correspondientes glucósidos (Figura 4);
iii) activación de fito-hormonas e intermediarios metabólicos por eliminación de los grupos
glucosilos que los bloquean; iv) liberación de las agliconas responsables del aroma y el
sabor de las frutas y bebidas derivadas (vino, zumos de fruta, té, ...) y de las agliconas
tóxicas y/o HCN existentes en las partes comestibles de algunas plantas (mandioca,
almendras amargas, …); v) metabolismo secundario.
Los mamíferos presentan también varias -glucosidasas. Una -glucosidasa citosólica
presente en hígado e intestino delgado está implicada en el metabolismo de xenobióticos de
la dieta, incluyendo glicósidos de fitoestrógenos, de flavonoides y de la vitamina B6. En
humanos, la deficiencia en la -glucosidasa ácida lisosomal, enzima que hidroliza las
glucosilceramidas, origina la enfermedad de Gaucher [8,9].

Figura 4. Ejemplos de sustratos naturales de las β-glucosidasas

Hasta el momento no se dispone de un esquema definitivo para la clasificación de las -

glucosidasas. Inicialmente se agruparon en tres tipos, considerando su especificidad de
sustrato: i) aril--glucosidasas; ii) celobiasas; y iii) -glucosidasas de especificidad amplia,
con actividad sobre una amplia variedad de sustratos. La aproximación más aceptada en la
actualidad se basa en similitudes de secuencia y plegamiento, y clasifica las glicósido
 91
hidrolasas en más de 100 familias [10,11]. Existe un portal de internet de libre acceso
(http://www.cazy.org) donde se pueden consultar la base de datos actualizada de dichas
familias [12]. Las -glucosidasas, junto con otras glicósido hidrolasas (GH), se localizan
principalmente en las familias GH1, GH2, GH3, GH5, GH9, GH30 y GH116 [13]. . En
general, las -glucosidasas de arqueas, plantas y mamíferos pertenecen a la familia GH1,
mientras que en la familia GH3 se localizan principalmente -glucosidasas de bacterias,
hongos y levaduras. Dentro de la familia GH30, se encuentra la -glucosidasa ácida
lisosomal (GBA1), cuyo déficit provoca la enfermedad de Gaucher [14]. En mamíferos
existen otras -glucosidasas implicadas en el metabolismo de glicolípidos y glucósidos de la
dieta, como la -glucosidasa de los ácidos biliares (GBA2) y la -glucosidasa citoplasmática.

Mediante cristalografía de rayos X, se ha descrito la estructura tridimensional de alguna de

estas -glucosidasas (Figura 5). Las -glucosidasas de las familias GH1, GH5, y GH30 se
encuentran dentro del Clan A de las glicósido hidrolasas cuyos miembros son proteínas con
estructuras de barril (/)8. Por el contrario, el centro activo de las enzimas de la familia GH3
poseen dos dominios, mientras que aquellas de la familia GH9 tienen una estructura de barril
(/)6 [15]. Las -glucosidasas de la familia GH1 suelen ser proteínas glicosiladas y
multiméricas.

Figura 5. Estructura tridimensional de algunas -glucosidasas

La determinación de la estructura tridimensional de muchas -glucosidasas ha permitido

conocer con más detalle su mecanismo de catálisis. Las familias GH1 y GH3 están formadas
por enzimas que hidrolizan sus sustratos con retención neta de la configuración del carbono
anomérico (Figura 6), mediante un mecanismo de doble desplazamiento, muy similar al
propuesto para la lisozima [16-18]. La hidrólisis del enlace glicosídico habitualmente ocurre
con la ayuda de las cadenas laterales de dos residuos ácidos, que actúan como ácido/base
y nucleofilo..
 92

Figura 6. Mecanismo propuesto para la hidrólisis del enlace -glucosídico catalizada por -
glucosidasas capaces de retener la configuración del carbono anomérico

El mecanismo de retención de la configuración del carbono anomérico implica una catálisis

ácida general por parte de un residuo ácido que provoca la protonación del -D-
glucopiranósido, y la formación de un ión oxocarbonio en conformación de “media-silla”
(estado de transición). La aproximación de esta especie iónica a un residuo catalítico de
carácter nucleófilico propicia la formación de un intermedio covalente (con configuración
invertida del carbono anomérico, y una conformación relajada en forma de “silla”), y la
consiguiente liberación de la aglicona. La formación de esta especie covalente tiene como
consecuencia la disminución de 2-3 unidades de pH en el valor del pKa del catalizador ácido,
transformándolo en catalizador básico. Posteriormente un protón es sustraído de una
molécula de agua por el catalizador básico, de tal manera que puede atacar
nucleofílicamente al carbono C1 del sacárido. De nuevo, se forma el ión oxocarbonio como
segundo estado de transición, y posteriormente se produce la liberación de la -D-
glucopiranosa cuyo carbono anomérico presenta su configuración restaurada, así como la
recuperación de la enzima para proceder a un nuevo ciclo catalítico. En las -glucosidasas
que presentan este mecanismo catalítico, los residuos implicados poseen grupos
carboxílicos que distan aproximadamente 5,5 Ångström (Å). Concretamente se trata dos
ácidos glutámicos (E) en la mayoría se los casos, que se encuentran situados en secuencias
conservadas dentro de la familia GH1 (Figura 7). Por un lado, el ácido glutámico con función
de catalizador ácido/base se encuentra en el motivo TFNEP mientras que el ácido glutámico
con carácter nucleofílico está en el motivo I/VTENG [19].
 93

Figura 7. Alineamiento de secuencias en algunas -glucosidasas de la familia GH1. Sólo

aparecen aquellos tramos de la cadena polipeptídica que flanquean el catalizador ácido/base
y el nucleófilo. Los códigos Genbank están indicados en azul: 1. Zea mays; .2. Sorghum
bicolor; 3. Avena sativa; 4. Coctus speciosus; 5. Arabidopsis thaliana; 6. Brassica napus; 7.
Prunus avium; 8. Trifolium repens; 9. Sinapsis alba (mirosinasa); 10. conejo (lactase-
phloridzin hydrolase); 11. Bacillus spp.; 12. Agrobacterium tumefaciens; 13. Bacillus
polymyxa.

Las -glucosidasas presentan interés como un versátil catalizador industrial. En la

conversión de la biomasa (degradación de la lignocelulosa a glucosa), la -glucosidasa es
indispensable para que el sistema multienzimático celulasa sea eficaz, ya que evita la
acumulación de celobiosa, inhibidor de las otras dos enzimas celulolíticas [20]. Las
aplicaciones de las -glucosidasas incluyen las industrias de la alimentación, de la
elaboración de bebidas, textil, del papel, de biocombustibles, etc. En este sentido, se ha
comentado que existen glicoconjugados cuya hidrólisis enzimática permite incrementar el
aroma del vino, zumos de frutas y productos similares por liberación de las agliconas
correspondientes [21,22]. En el procesado de residuos lignocelulósicos, se ha observado un
incremento en la hidrólisis de celulosa y posterior producción de etanol cuando se añade una
cantidad adicional de -glucosidasa a las preparaciones comerciales de celulasas. Por otra
parte, su capacidad de llevar a cabo reacciones de “transglicosilación” la convierten en un
biocatalizador muy interesante para la síntesis estero/regio-específica de glicósidos y
oligosacáridos, moléculas potencialmente útiles como nutrientes o bien como compuestos de
interés farmacéutico [2]. La aplicación de las -glucosidasas en procesos industriales,
requiere un conocimiento detallado de las mismas, en particular de su mecanismo de
reacción.

En este sentido, y atendiendo a los objetivos experimentales planteados en este bloque, se

han recopilado las características catalíticas de un gran número de -glucosidasas de
microorganismos y plantas (Tabla 1).
 94

Tabla 1. Características catalíticas de las β-glucosidasas de diferentes especies.

pKas
Km (mM) Temp Ki (mM)
Especie esenciales
pNPG Celobiosa pK1 pK2 (ºC) glucosa D-GcLac Ref.
Bacterias
Agrobacterium faecalis 0,078 6,4 0,0014 [22]
Alcaligenes faecalis 3 [23]
Alternaria alternata 4,0 5,3 72 [24]
Brevibacterium sp. 0,05 4,7 7,2 53 [25]
Clostridium
2,6 83,0 135 [26]
thermocellum
Paenibacillus sp. 0,10 55 [27]
Pyrococcus furiosus 0,20 40 0,080 [28]
Ruminococcus albus 2,20 26,0 5,5 7,5 35 [29]
Streptomyces
5,8 7,5 43 [30]
granaticolor
Thermophilum pendens 0,189 0,149 90 [31]
Thermotoga
1,5 95 1000 [32]
naphthophila
Hongos
Aspergillus niger 1,11 2,9 6,5 70 [33,34]
Humicola insolens 0,16 0,51 60 [35]
Penicillium brasilianum 0,09 1,58 2,3 0,10 [36]
Penicillium canescens 0,11 70 [37]
Penicillium funiculosum 0,40 2,10 4,1 5,3 1,7 [38]
Penicillium occitanis 0,37 1,43 60 1 0,03
[39]
(2 isoenzimas) 0,55 0,90 60 1 0,03
Penicillium oxalicum 0,37 8,0 [40]
Sclerotinia sclerotiorum 50 [41]
Stereum hirsutum 2,50 86,0 65 29 [42]
Talaromyces emersonii 52 [43]
Trichoderma reesei 0,19 1,21 4,27 5,72 65 0,5 [44,45]
Levaduras
Candida wickerhamii 4,17 67,4 3,7 5,3 38 [46]
Candida peltata 2,3 66 50 [47]
Clavispora sp. 0,35 45 15,2 [48]
Dekkera intermedia 0,20 55 3 [49]
Plantas
Camellia sinensis 3,1 50 [58]
Hordeum vulgare 21 0,016 [50]
Malus domestica 1,2 70 [51]
Manihot esculenta 4,4 7,2 [52]
Olea europaea 2,22 42 6,4 0,016 [53]
Oryza sativa 6,3 15,3 [54]
Phaseolus lunatus 1,21 1,0 4,8 6,5 [55]
Zea mays 0,65 4,5 6,5 50 148 0,84 [56,57]
 95

4.2. OBJETIVOS EXPERIMENTALES

Dado que la actividad ß-glucosidasa es limitante en la degradación de la celulosa por el
complejo celulasa, y que algunas ß-glucosidasas catalizan reacciones de transglicosilación y se
emplean en la síntesis de glucósidos, la caracterización cinética de la enzima constituye un primer
paso esencial para su utilización en procesos de interés biotecnológico. En este contexto podría
encuadrarse el estudio que se propone, que incluye la puesta a punto de un ensayo enzimático
para cuantificar la actividad de la enzima ß-glucosidasa de la emulsina de almendra dulces, la
determinación de sus parámetros cinéticos en el estado estacionario, el estudio del efecto sobre la
catálisis de factores ambientales como la temperatura, así como el análisis del comportamiento
inhibidor de productos de la reacción y análogos del estado de transición. El objetivo final será
proponer, hasta donde sea posible, un modelo para el mecanismo catalítico de la ß-glucosidasa
de almendra. Así, el estudio incluirá:

1. Estandarización de las condiciones de ensayo para la ß-glucosidasa

2. Determinación de los parámetros cinéticos macroscópicos de la ß-glucosidasa de almendra
para el sustrato p-nitrofenil-ß-D-glucósido (pNPG).
3. Efecto de la temperatura sobre los parámetros cinéticos de la ß-glucosidasa para la
hidrólisis del pNPG. Cálculo de la energía de activación para la reacción.
4. Estudio de la inhibición de la catálisis de la ß-glucosidasa por la glucosa, producto de la
reacción, y por la D-glucono-1,5-lactona, como análogo del estado de transición.
Determinación del tipo y las constantes de inhibición.
5. Propuesta de un modelo para el mecanismo cinético de la reacción catalizada por la ß-
glucosidasa.

4.3. MÉTODOS
* Material biológico.
Preparación comercial de la enzima ß-glucosidasa aislada a partir de emulsina de almendras
dulces (Prunus dulcis). La enzima es un homodímero (Mr=67,000 por subunidad).

* Reactivos
Disoluciones que debe preparar cada equipo de trabajo:
- Tampón citrato sódico 100 mM, pH 5,0 (pKa3 = 5,4), 0,4 litros
- NaOH 0,2 M, 0,5 litros

El resto de los reactivos se proporcionan disueltos en tampón citrato 100 mM, pH 5,0:
- ß-glucosidasa, disolución 170 nM (50 g sólido/ml)
- pNP (p-nitrofenol) 25 mM
- pNPG (p-nitrofenil-ß-D-glucósido) 50 mM
- Glucosa 2,0 M
- D-glucono-1,5-lactona 20 mM
 96

* Valoración de la actividad de la enzima

La actividad de la ß-glucosidasa de almendra se valora utilizando un sustrato cromogénico, el p-
nitrofenil-ß-D-glucósido (pNPG). Tras detener la reacción enzimática, la actividad de la enzima se
cuantifica midiendo la absorbancia a 410 nm en medio básico de uno de los productos de la
reacción, el p-nitrofenol (pNP). La reacción enzimática trascurre en tampón citrato sódico 100 mM,
pH 5,0, disolución en la que se preparan todos los reactivos.

Procedimiento: En un tubo de ensayo se añaden 0,9 ml de tampón conteniendo el sustrato y se

atempera 5 minutos a 40ºC. La reacción se inicia adicionando 0,1 ml de la disolución de ß-
glucosidasa, agitando e introduciendo la mezcla en un baño de incubación a 40ºC. Transcurrido el
tiempo de ensayo, la reacción se detiene por adición de 1,5 ml de NaOH 0,2 M e introducción del
tubo de ensayo en un baño de hielo/agua. La cantidad de pNP producido por la enzima se
determina midiendo la Absorbancia a 410 nm de la muestra, restando la absorbancia del
correspondiente control sin enzima e interpolando la absorbancia corregida en una recta patrón
construida con concentraciones conocidas de pNP procesadas en las mismas condiciones.
ELIMINACIÓN DE RESIDUOS: una vez medida la absorbancia el contenido de los tubos de
ensayo se desechará en el bidón de “RESIDUOS DE p-NITROFENOL”.
La actividad de una enzima se determina calculando la velocidad inicial de la reacción, es decir, la
concentración de sustrato consumido o de producto originado por la enzima en las condiciones de
ensayo establecidas por unidad de tiempo. La actividad de la ß-glucosidasa se expresará como
concentración micromolar de pNP originada por la enzima en el volumen de reacción por minuto
trascurrido (μM/min).

4.4. EXPERIMENTACIÓN
4.4.1. Estandarización de las condiciones de ensayo
Un ensayo enzimático es un método de laboratorio para medir la actividad de una
enzima, en el que se determina la velocidad de la reacción catalizada por la enzima. La
actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente en una
preparación y del nivel de actividad de la misma. Por tanto, la medida de la actividad depende
de las condiciones experimentales en las que ocurra la reacción, condiciones que deben ser
especificadas cuando se dan valores de actividad.
Al establecer las condiciones experimentales para medir la actividad de una enzima hay
que considerar los supuestos realizados en la deducción de la ecuación de Michaelis-Menten.
 97
Estos supuestos son: i) la enzima actúa en condiciones de estado estacionario; ii) la reacción
ocurre únicamente en el sentido directo, no hay reacción inversa; y iii) la enzima no sufre
inhibición por producto. Desde el punto de vista experimental, se confirma que las condiciones
del ensayo son las adecuadas para que se cumplan estas suposiciones, comprobando existe
linealidad en la formación de producto con el tiempo y con la concentración de enzima.
Aspectos prácticos
1. Para estandarizar las condiciones de ensayo para la ß-glucosidasa de almendra,
utilizando pNPG como sustrato, hay que fijar:
a) la concentración de enzima;
b) la concentración de sustrato;
c) el tiempo de incubación del ensayo enzimático.
Conviene seleccionar las condiciones adecuadas para que la liberación de producto se
mantenga lineal en una escala de tiempo cómoda para los ensayos, es decir, al menos
10 minutos, y para que la máxima variación de absorbancia a 410 nm producida en ese
tiempo sea menor de 0,7.
2. Comprobar la linealidad de la formación de producto con el tiempo y con la concentración
de enzima
3. Comprobar el porcentaje de sustrato transformado y la relación molar sustrato/enzima en
las condiciones de ensayo elegidas.

4.4.2. Determinación de los parámetros cinéticos

Para determinar los parámetros cinéticos macroscópicos de una enzima es necesario
analizar la dependencia de la velocidad inicial de catálisis con la concentración de sustrato. Por
tanto, se llevarán a cabo ensayos en las condiciones experimentales previamente establecidas,
con una cantidad fija de enzima y concentraciones variables de sustrato. A partir de las
velocidades iniciales determinadas, se pueden calcular los parámetros cinéticos macroscópicos
de la ß-glucosidasa en el estado estacionario, empleando el ajuste por mínimos cuadrados a la
hipérbola (programa de ordenador) o las representaciones lineales de Lineweaver-Burk, Eadie-
Hofstee, Hanes-Woolf o Eisenthal y Cornish-Bowden, según las ecuaciones y gráficas de la
página siguiente:

4.4.3. Efecto de la temperatura en la catálisis

Previamente al estudio del efecto de los factores ambientales sobre la actividad enzimática,
conviene comprobar la estabilidad de la enzima en el intervalo de pH o de temperaturas de
interés.
El efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima se analizará determinando los
parámetros cinéticos de la enzima a diferentes temperaturas. La energía de activación de la etapa
catalítica de la reacción se estima representando ln kcat frente a 1/T (K-1), según la ecuación de
Arrhenius:
𝐸𝑎
𝑘𝑐𝑎𝑡 𝐴𝑒 𝑅𝑇  
98
 99

Aspectos prácticos
1. Analizar el efecto de la temperatura en la catálisis de la ß-glucosidasa, determinando los
parámetros cinéticos de la enzima para el pNPG, en incubaciones a diferentes temperaturas
(ver Tabla 3). Representar el ln kcat frente a la inversa de la temperatura en grados Kelvin, y
estimar la energía de activación.
2. Determinar el valor del coeficiente Q10, definido como el factor por el que aumenta la velocidad
de la reacción cuando se incrementa la temperatura de reacción 10ºC.

4.4.4. Estudios de inhibición reversible

El comportamiento inihibidor de la glucosa, uno de los productos de la hidrólisis del pNPG, y de la
D-glucono-1,5-lactona, considerado un análogo del estado de transición, se analizarán
determinando los parámetros cinéticos de la enzima para el pNPG en presencia de cuatro
concentraciones diferentes de inhibidor.
Aspectos prácticos
1. Para decidir qué concentraciones de inhibidor se van a emplear, puede consultarse el
comportamiento de los inhibidores sobre otras ß-glucosidasas (ver Tabla 3). Conviene hacer
previamente un experimento de tanteo con una concentración fija de sustrato y
concentraciones crecientes del inhibidor en cuestión.
2. Calcular los parámetros cinéticos de la enzima para el pNPG en presencia de las diferentes
concentraciones de glucosa o de D-glucono-1,5-lactona empleadas.
3. Determinar el tipo de inhibición ejercida por cada uno de los compuestos y calcular sus
constantes de inhibición KI.

β‐D‐glucosa              D‐glucono‐1,5‐lactona 
                              (o glucono‐ δ‐lactona) 

4.5. DISCUSIÓN
Una vez realizados los experimentos que se proponen en el apartado anterior, y con todos los
datos procesados en conjunto, redactar una discusión general que plantee toda la información
que pueda extraerse de los datos sobre el mecanismo catalítico de la ß-glucosidasa. La discusión
debería responder estas cuestiones:
 100
 ¿Cuáles son las condiciones de ensayo más adecuadas, en lo que se refiere a tiempo de
incubación, concentración de enzima o intervalo de concentraciones de sustrato, para estudiar
los parámetros cinéticos de la ß-glucosidasa en el estado estacionario?
 ¿Cuáles son los parámetros cinéticos macroscópicos de la ß-glucosidasa de almendra para la
hidrólisis de pNPG? ¿Cómo se comparan con los parámetros de otras ß-glucosidasas?
 ¿Qué temperatura resulta ser más adecuada para la catálisis de la ß-glucosidasa? ¿Se ha
observado la desnaturalización térmica de la enzima? ¿Qué valores de pH y T convendría
seleccionar para utilizar la enzima en aplicaciones biotecnológicas?
 ¿Qué tipo de inhibición produce la glucosa sobre la hidrólisis de pNPG por la ß-glucosidasa?
¿Y la D-glucono-1,5-lactona? Comparar las constantes de inhibición obtenidas para ambos
compuestos. Proponer un mecanismo cinético que explique el comportamiento inhibitorio de la
glucosa y de la D-glucono-1,5-lactona. ¿Qué experimentos adicionales sería necesario realizar
para comprobar si ese mecanismo es correcto?
 ¿Se parece la ß-glucosidasa de almendra a otras ß-glucosidasas estudiadas en la
bibliografía?

4.6. REFERENCIAS
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 104

4.7. ANEXOS

Tabla I. Valores de pKa (25ºC) de los

compuestos utilizados como tampones
Compuesto pKa
Ácido acético 4,76
Ácido succínico (pKa2) 5,57
Ácido cítrico (pKa3) 5,40
MES (pKa2) 6,15
Ácido fosfórico (pKa2) 6,84
HEPES (pKa2) 7,55
TRIS 8,10
Etanolamina 9,44