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Raccomandazioni per l’impiego

delle metodiche molecolari

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in immunoematologia
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TE

Gruppo di Redazione

Serelina Coluzzi, Donatella Londero, Silvia Manfroi,


Antonella Matteocci, Simone Travali, Maria Antonietta Villa

Edizione 2018

1
Presentazione

Le metodiche molecolari in Immunoematologia costituiscono uno strumento di grande utilità in una vasta
serie di situazioni cliniche riguardanti sia la tipizzazione dei donatori, sia quella dei pazienti, e non di rado,
integrandosi con i tradizionali metodi sierologici, contribuiscono alla soluzione di casi complessi ed ad
un’appropriata terapia trasfusionale.

Queste considerazioni spiegano la progressiva diffusione di queste tecniche nelle strutture trasfusionali;
tuttavia, essa dev’essere guidata da criteri di opportunità, che da un lato tengano conto della necessità di
offrire a tutti i pazienti accesso a tali metodiche laddove indicate, dall’altro del fatto che al momento, per la
complessità stessa delle metodiche, non si può pensare che esse possano essere presenti in ciascuna
struttura trasfusionale.

La riflessione, quindi, dev’essere condotta da un lato sulle necessarie caratteristiche di qualificazione delle

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strutture e del personale in relazione ai volumi di attività svolti, dall’altro alla equilibrata ed armonica

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strutturazione in rete del sistema trasfusionale, in modo tale che esso possa rispondere efficacemente alle
necessità immunoematologiche di ogni paziente.
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Queste raccomandazioni vedono la luce in questo contesto, e non a caso gli Autori si sono impegnati non
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soltanto a fornire una guida alla soluzione delle diverse problematiche tecniche, ma anche a suggerire
criteri di qualificazione basati su esperienza e volumi di attività, distinguendo fra diversi livelli di laboratori,
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tenendo conto anche di quanto SIMTI raccomanda nei propri Standard di Medicina Trasfusionale.
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Un grazie sincero quindi ai componenti del Gruppo di Redazione coordinato da Silvia Manfroi: Serelina
Coluzzi, Donatella Londero, Silvia Manfroi, Antonella Matteocci, Simone Travali, Antonietta Villa., che nel
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corso di numerosi incontri e scambi di conoscenze ed esperienze hanno steso questo approfondito testo,
che certamente sarà un utile strumento per tutti noi e che troverà positivi apprezzamenti da parte dei
Colleghi.

Pierluigi Berti
Presidente SIMTI

2
Ringraziamenti

Desidero ringraziare tutti i componenti del gruppo di lavoro, amici prima che colleghi: Antonella,
Antonietta, Donatella, Serelina e Simone che mi hanno seguito e appoggiato in questo ambizioso progetto.
Queste raccomandazioni sono la conclusione di un lungo percorso di studio, di confronto e di
progettazione. Sono il risultato di passione, impegno, determinazione e professionalità che tutti hanno
generosamente profuso. Sono il frutto della condivisione di interessi, intenti ed esperienza in un ambito che
richiede conoscenza e passione. Sono uno dei pochi documenti sull’argomento redatti da una Società
Scientifica, e questo ci rende orgogliosi oltre che soddisfatti del lavoro svolto.

Ringrazio chi ci ha supportato su argomenti a noi meno noti e chi ha fornito consigli preziosi ed esperti per
migliorare la comprensione e l’applicabilità delle raccomandazioni, in particolare Francesco Fiorin e Giorgio
Gandini per la paziente e puntuale revisione del documento finale.

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Un ringraziamento particolare a Roberta Frisenda, SIMTI Servizi e la Segreteria di Milano per il loro

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contributo, per la disponibilità e la pazienza nel gestire gli aspetti logistici e organizzativi.
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Infine un sentito ringraziamento al dott. Claudio Velati per l’interesse e l’incoraggiamento dimostrati nei
N
confronti del gruppo di lavoro e di questo progetto fin dalla loro nascita, all’attuale presidente SIMTI dott.
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Pierluigi Berti e a tutto il Consiglio Direttivo per il supporto e la fiducia che ci hanno manifestato in questo
cammino.
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ST
TE

Silvia Manfroi
Coordinatore del Gruppo di Redazione

3
ABBREVIAZIONI

cfDNA cell-free DNA

cffDNA cell-free fetal DNA

CSE cellule staminali emopoietiche

DNA acido desossiribonucleico

dNTP deossinucleoside trifosfato

EG età gestazionale

GdR Grado di Raccomandazione

HPA human platelet antigens

IP immunoprofilassi

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ISBT International Society of Blood Transfusion

N
LIM laboratorio di immunoematologia molecolare

MEFN
LI
malattia emolitica del feto e del neonato
N
NGS next generation sequencing
O

PCR polymerase chain reaction

PCR-RFLP polymerase chain reaction- restriction fragment lenght polymorphism


O

PCR-SSP polymerase chain reaction – sequence specific primer


ST

PEC posta elettronica certificata

PFNA piastrinopenia feto neonatale alloimmune


TE

RT-PCR real time - polymerase chain reaction

SBT sequence based typing

SIGO Società Italiana di Ginecologia e Ostetricia

SIMTI Società Italiana di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale

SNP single nucleotide polymorphysm

TAD test all’antiglobulina diretto

TAI test all’antiglobulina indiretto

VEQ verifica esterna di qualità

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GLOSSARIO

Accuratezza concordanza tra la media dei valori ottenuti nella misurazione di campioni di
controllo a contenuto noto
Allele forma alternativa dello stesso gene che si trova nella medesima posizione su
ciascun cromosoma omologo (locus)
Amplificato tratto di DNA o RNA ottenuto da amplificazione artificiale (PCR)

Amplificazione replicazione enzimatica in vitro di un tratto di un acido nucleico


Annealing ibridazione di due filamenti di acidi nucleici complementari
Audit esaminazione indipendente con lo scopo di ottenere prove, valutarle con
obiettività e stabilire in quale misura i criteri prefissati siano soddisfatti
Backup conservazione di dati digitali
Calibrazione allineamento tra i valori indicati da un’apparecchiatura ed uno standard di
riferimento
Cell free DNA (cfDNA) DNA fetale e materno che circolano liberamente nel sangue materno

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Cell free fetal DNA DNA fetale che circola liberamente nel sangue materno

N
(cffDNA)
Competenza capacità di un individuo nel compiere specifiche attività applicando le procedure
LI
Controllo materiale utilizzato nel processo di controllo della qualità
Controllo di test che contiene tutti i reagenti tranne il DNA, il quale è sostituito da acqua
N
contaminazione
O

Controllo di qualità test eseguito regolarmente su materiali ed apparecchiature per garantire la


loro funzione
Controllo negativo campione che è privo dell’allele target
O

Controllo positivo campione che possiede l’allele target


Coverage in NGS, copertura del gene in lunghezza o in profondità
ST

Elettroforesi tecnica per analizzare e separare acidi nucleici sfruttando le cariche elettriche
delle molecole di DNA o RNA
TE

Emocomponente prodotto ricavato dal frazionamento del sangue con mezzi fisici semplici o con aferesi
Enzima di restrizione enzima che è in grado di riconoscere nel DNA specifiche sequenze di basi e di
(endonucleasi) tagliarlo in loro corrispondenza
Epigenetica branca della genetica che descrive le modifiche ereditabili che variano
l’espressione genica pur non alterando la sequenza del DNA
Esone regione di un gene che codifica per una parte specifica di una proteina
Eterozigosi presenza di una coppia di alleli diversi per un dato gene
Fenotipo l'insieme delle caratteristiche morfologiche e funzionali di un organismo
risultanti dall'espressione del suo genotipo e dalle influenze ambientali
Fenotipo predetto il fenotipo atteso sulla base del risultato delle indagini genetiche
Fluorescenza proprietà di alcune sostanze di assorbire radiazioni nell'ultravioletto ed
emetterle nello spettro della luce visibile
Gene una sequenza di DNA che codifica una specifica proteina
Genotipo insieme di tutti i geni che compongono il DNA di un organismo o di una popolazione
Interfaccia dispositivo di collegamento che permette la comunicazione tra due sistemi
informatici altrimenti incompatibili, oppure tra unità centrale e unità periferiche

5
Introne regioni prive di funzione codificante, trascritte ma rimosse prima della
traduzione del gene
Ladder campione di controllo composto da frammenti di dimensioni note, utile per
identificare la dimensione di una molecola analizzata con elettroforesi su gel
Locus posizione occupata da un determinato gene o da uno dei suoi alleli in ciascuno
dei due cromosomi omologhi
Malattia Emolitica del quadro clinico di anemia dovuta ad un’aumentata distruzione delle emazie del
Feto e del Neonato feto e/o del neonato conseguente alla presenza nel circolo feto/neonatale di
(MEFN) anticorpi di origine materna diretti contro antigeni presenti sui globuli rossi del
feto/neonato ed ereditati dal padre
Microarray sistema diagnostico per l’identificazione di alleli definiti, basato
sull’immobilizzazione di sonde oligonucleotidiche su un substrato solido
microscopico
Middleware software che permettono la comunicazione reciproca fra strutture e
programmi informatici che utilizzano protocolli o sistemi operativi differenti

E
Multiplex PCR variante della normale PCR, costituita da più set di primer in un’unica miscela,
per individuare rapidamente delezioni o duplicazioni in un gene di grandi

N
dimensioni
Non conformità
Omozigosi
LI
mancato rispetto dei criteri definiti
presenza di due copie dello stesso allele su cromosomi omologhi
N
Polimorfismo presenza contemporanea in una popolazione di due o più distinti fenotipi
derivanti dall’espressione di alleli diversi di uno stesso gene
O

Polymerase Chain tecnica di biologia molecolare che consente l’amplificazione enzimatica di


Reaction (PCR) frammenti di acidi nucleici, dei quali si conoscano le
O

sequenze nucleotidiche iniziali e terminali, mediante coppie di primer


oligonucleotidici e variazioni cicliche della temperatura
ST

Pooling unione di acidi nucleici (DNA o RNA) di geni diversi di uno stesso campione e/o
campioni diversi in un unico insieme (pool)
Precisione concordanza tra più misure ripetute sullo stesso campione
TE

Primer sequenza oligonucleotidica a singola elica corrispondente all’inizio e alla fine


del tratto di DNA da copiare o identificare; serve come punto di innesco per la
replicazione del DNA
Procedura documento che definisce la sequenza di attività, le responsabilità e le modalità
atte a regolamentare un processo/attività a fronte di un obiettivo prefissato
Processo successione strutturata di attività finalizzate a conseguire un obiettivo
prefissato
Qualificazione azione, facente parte della convalida, consistente nell’accertare che le specifiche
caratteristiche di personale, locali, attrezzature, materiale, necessarie per compiere
una determinata azione, sono sistematicamente soddisfatte
Reads sequenze ottenute con NGS
RFLP (Restriction analisi del polimorfismo associato alla presenza o assenza di siti di clivaggio per
Fragment Lenght specifiche endonucleasi
Polymorphism)
Ripetibilità concordanza dei risultati di misura di uno stesso campione, senza variare
nessuna delle condizioni nella medesima seduta di analisi
6
Riproducibilità concordanza dei risultati di misura di uno stesso campione, effettuata
cambiando una o più condizioni di lavoro od operatori
Screening genetico strategia di indagini diagnostiche eseguite su un individuo o un gruppo di
individui allo scopo di identificare caratteri utili per la diagnosi precoce o la
prevenzione di patologie
Sensibilità proporzione di veri positivi identificati da un test
Shotgun Sequencing strategia di sequenziamento, con amplificazione di geni interi o parti di geni
molto lunghi, che necessita di frammentazione per la preparazione della
libreria
Single Nucleotide variazione della sequenza del DNA a carico di un unico nucleotide tale per cui
Polymorphys ( SNP) l'allele polimorfico è presente nella popolazione in proporzione superiore
all'1%
Sequence-Specific analisi molecolare basata su sonde marcate sequenza-specifiche, utilizzate in
Oligonucleotide (SSO) varie tecniche di ibridazione
Sonda (probe) oligonucleotide a singolo filamento utilizzato per identificare specifiche regioni

E
di DNA o RNA che portano la sequenza complementare
Specificità proporzione di veri negativi identificati da un test

N
Taq polimerasi DNA-polimerasi (DNA-dipendente), proveniente dall'organismo
LI
termofilo Thermus aquaticus, utilizzata per la tecnica di PCR
Templato (o filamento filamento di DNA a doppia elica utilizzato come modello durante la
N
stampo) replicazione o la trascrizione
O

Termociclatore strumento programmabile capace di condurre automaticamente variazioni


cicliche e definite di temperatura, necessarie per l’amplificazione di sequenze
di DNA in vitro mediante PCR
O

Test genetico indagine eseguita sul DNA di un individuo a scopo diagnostico o come studio
ST

pre-concezionale
Threshold cycle (Ct) nella metodica Real Time PCR è il punto della curva corrispondente al numero
di cicli di amplificazione in cui la fluorescenza di un campione supera il
TE

background ed inizia la fase esponenziale


Tracciabilità possibilità di seguire tutte le fasi di un processo dall’inizio alla fine
Trombocitopenia Feto- quadro clinico di piastrinopenia causata da aumentata distruzione delle
Neonatale Alloimmune piastrine del feto e /o del neonato, conseguente alla presenza nel circolo
(FNAIT) feto/neonatale di anticorpi di origine materna diretti contro antigeni presenti
sulle piastrine del feto/neonato ed ereditati dal padre
Validazione (convalida) allestimento di prove documentate ed obiettive comprovanti che i requisiti
prestabiliti di una procedura o di un processo specifico possono essere
sistematicamente soddisfatti
Valutazione Esterna di valutazione del risultato delle indagini condotte da un laboratorio per test
Qualità (VEQ) specifici o misurazioni al fine di monitorare la qualità delle prestazioni di un
laboratorio
Wipe test piano di controllo degli amplificati
Zigosità stato di omozigosi o eterozigosi di un gene

7
INDICE

ABBREVIAZIONI 4
GLOSSARIO 5
INDICE 8
INTRODUZIONE 10
1. ORGANIZZAZIONE 12
1.1 Criteri organizzativi per l’esecuzione di indagini di immunoematologia molecolare 12
1.2 Organizzazione del lavoro 13
1.3 Bibliografia 14
2. METODICHE 15
2.1 Generalità 15
2.2 Tecniche disponibili 15
2.2.1 Tecniche a bassa produttività 15
2.2.2 Tecniche a media produttività 15

E
2.2.3 Tecniche ad alta produttività 16

N
2.3 Strumentazione 16
2.4 Gestionale informatico e software 17
2.5 Metodiche
LI 17
2.5.1 Estrazione del DNA 18
N
2.5.2 Elettroforesi 18
O

2.5.3 SSP 19
2.5.4 SSO 19
2.5.5 Real-Time PCR 19
O

2.5.6 Microarray 19
2.5.7 Sequenziamento (Secondo Sanger) 19
ST

2.5.8 Next Generation Sequencing (NGS) 20


2.6 Tracciabilità 21
TE

2.7 Controllo della contaminazione da amplificati (Wipe Test) 21


2.8 Raccolta ed identificazione del campione 22
2.9 Bibliografia 23
3. DONATORI 24
3.1 Generalità 24
3.2 Indicazioni 24
3.3 Criteri di selezione dei donatori per la creazione di un Registro/Banca di
24
sangue raro
3.4 Selezione di antigeni per la tipizzazione su larga scala 25
3.5 Donatori di etnia non caucasica 25
3.6 Tipizzazioni particolari 26
3.6.1 DEL 26
3.6.2 V/VS 26
3.6.3. LU 26
3.7 Donatore raro 26
3.8 Bibliografia 27
8
4. PAZIENTI 29
4.1 Generalità 29
4.2 Indicazioni 29
4.2.1. Ambito trasfusionale 29
4.2.2. Ambito ostetrico/prenatale 29
4.3 Quali antigeni tipizzare 30
4.3.1 Sistema ABO 30
4.3.2 Sistema RH 30
4.3.3 Sistema KEL 32
4.3.4 Sistema FY 32
4.3.5 Sistema JK 32
4.3.6 Sistema MNS 32
4.3.7 Altri sistemi gruppo-ematici 33
4.3.8 Sistemi HPA 33
4.4 Diagnosi prenatale 34

E
4.4.1 Indagini sui genitori 34
4.4.2 Indagini sul DNA fetale 34

N
4.5 Bibliografia 36
5. GESTIONE DEL RISULTATO
5.1 Generalità
LI 39
39
N
5.2 Indicazioni 39
5.3 Attribuzione del fenotipo eritrocitario/piastrinico 39
O

5.4 Gestione del risultato in caso di discrepanza 40


5.5 Discrepanze nel sistema ABO 40
O

5.6 Discrepanze nel sistema RH 41


5.7 Bibliografia 42
ST

6. QUALITÀ 43
6.1 Generalità 43
TE

6.2 Indicazioni 43
Bibliografia 45
7. CONSENSO E REFERTO 46
7.1 Consenso informato 46
7.1.1 Premessa 46
7.1.2 Il consenso nelle indagini di immunoematologia molecolare 46
7.1.3 Donatori 46
7.1.4 Pazienti 47
7.2 Referto 47
7.2.1 Generalità 47
7.3 Bibliografia 49

9
INTRODUZIONE
Le basi molecolari degli antigeni gruppo-ematici sono state identificate a partire dagli anni ’80 e ancora oggi
si continuano a scoprire geni e varianti geniche responsabili dell’assenza o della mutata espressione di un
determinato antigene. Contemporaneamente l’evoluzione delle tecniche molecolari, dalla storica PCR fino
a sofisticate piattaforme ad elevata produttività, ha favorito negli ultimi anni la diffusione nelle Strutture
Trasfusionali delle metodiche molecolari, che si sono integrate con le tecniche sierologiche offrendo
innumerevoli vantaggi in varie condizioni cliniche.
Gli ambiti di applicazione clinica dell’immunoematologia molecolare sono molteplici e sono rappresentati
dall’analisi di campioni di pazienti, con lo scopo di fornire loro una terapia trasfusionale personalizzata più
sicura ed efficace; dall’analisi di campioni di donatori per aumentare la disponibilità di unità di sangue
estesamente tipizzate e soddisfare le necessità di pazienti alloimmunizzati; dalla diagnostica prenatale non
invasiva per la prevenzione dell’alloimmunizzazione materna e l’identificazione dei feti a rischio di Malattia
Emolitica del Feto e del Neonato (MEFN) e di Piastrinopenia Feto-Neonatale Alloimmune (PFNA).
L’introduzione delle indagini molecolari in immunoematologia ha comportato numerosi cambiamenti,
primo tra tutti un cambiamento culturale. E’ pertanto necessaria una riorganizzazione della diagnostica
immunoematologica alla luce delle nuove conoscenze, integrando in modo complementare le informazioni

E
sierologiche con quelle molecolari.

N
Per questo motivo SIMTI ha predisposto nel 2017 una survey mirata alla ricognizione delle Strutture
Trasfusionali italiane che effettuano tipizzazioni molecolari e alla rilevazione delle criticità percepite, e il
LI
risultato della survey ha rappresentato il punto di partenza per la redazione delle Raccomandazioni per il
corretto impiego delle metodiche molecolari in immunoematologia.
N
Il gruppo di redazione composto da esperti nel campo dell’immunoematologia sierologica e molecolare ha
O

elaborato le presenti Raccomandazioni, basandosi sulla revisione dei lavori scientifici più rappresentativi
per ciascuno degli argomenti trattati, selezionati da Medline a partire dall’anno 2004. Per la maggior parte
delle raccomandazioni non è stato possibile esprimere una valutazione esplicita della qualità delle prove e
O

della forza con la quale sono definite; dove possibile, l’espressione dei gradi di raccomandazione si è
ST

ispirata a quella del sistema GRADE (Grading of Recommendations Assessment, Development and
Evaluation), secondo il quale le raccomandazioni sono espresse per gradi, rappresentati dalla combinazione
di numeri arabi (1, 2, 3), che esprimono la forza della raccomandazione, e da lettere maiuscole (A, B, C) che
TE

indicano la qualità e il tipo di evidenza degli studi. In assenza di prove evidenti, le raccomandazioni sono
basate sul consenso del gruppo di lavoro e delle opinioni degli esperti riportate in letteratura.
In particolare:
• Grado 1: gli autori sono certi che i benefici sono superiori ai costi, sia in termini di rischio sia di costo
economico. Si tratta quindi di una raccomandazione forte.
• Grado 2: gli autori sono meno certi, essendo meno chiaro il rapporto tra effetti desiderati ed
indesiderabili. Si tratta quindi di una raccomandazione debole.
Per quanto riguarda la classificazione in funzione della qualità e del tipo di evidenza ricavati dagli studi:
• Grado A: evidenza alta. La raccomandazione deriva dall’analisi di numerosi e consistenti studi clinici
randomizzati.
• Grado B: evidenza moderata. La raccomandazione deriva dall’analisi di studi clinici randomizzati ma con
importanti limitazioni, o da studi osservazionali con risultati molto consistenti, o da serie di casi.
Grado C: evidenza bassa. La raccomandazione deriva dall’analisi di studi clinici osservazionali con risultati
poco consistenti o da esperienze cliniche e/o opinioni di esperti.

10
E’ stato utilizzato il termine “deve” per esprimere attività che devono essere necessariamente fornite e/o
svolte per garantirne l’allineamento allo standard definito. Il termine “dovrebbe” indica le garanzie che è
auspicabile siano fornite, per quanto non di rilevanza obbligatoria.
Il termine “si raccomanda/si suggerisce” o espressioni equivalenti è utilizzato nei casi in cui gli autori sono
meno certi dell’evidenza derivata dall’esperienza e dai dati della letteratura, o nei casi in cui si intenda
privilegiare una modalità di azione rispetto ad altre.
Le metodiche molecolari hanno assunto un ruolo ben definito nel panorama diagnostico ed è ormai
imprescindibile che vi siano sul territorio nazionale dei laboratori in grado di applicare tali metodiche con
efficacia, affidabilità ed efficienza. È d’altro canto di chiara evidenza che non è ipotizzabile la creazione
diffusa di laboratori di immunoematologia eritrocitaria molecolare, e neppure una larga diffusione di test
molecolari nei laboratori di immunoematologia eritrocitaria sierologica, per motivi di efficienza e
soprattutto di qualità dei risultati. Parliamo di metodiche di non facile applicazione, che richiedono elevata
specializzazione e continuità operativa per mantenere un’adeguata capacità tecnica ed interpretativa e che
nel contempo necessitano di un costante aggiornamento su metodiche in continua evoluzione.
Le metodiche molecolari in immunoematologia eritrocitaria hanno tuttora indicazioni molto specifiche per
quanto riguarda le indagini diagnostiche sui pazienti e, nonostante siano indispensabili in alcune condizioni

E
cliniche e laboratoristiche, il loro utilizzo va limitato alla risoluzione di problemi e di casi che non possono

N
esseri chiariti con le tradizionali metodiche sierologiche. Nell’ambito della selezione di donatori con
fenotipo raro, le metodiche molecolari in immunoematologia eritrocitaria hanno un ruolo rilevante nella
LI
tipizzazione estesa di donatori e nella creazione di banche di donatori con fenotipo raro.
Questo documento vuole essere da un lato una guida per tutti gli immunoematologi ed i trasfusionisti verso
N
la conoscenza di queste metodiche, almeno negli aspetti generali, e quindi verso l’individuazione di
O

indicazioni di utilizzo precise ed appropriate; dall’altro lato si propone come uno strumento per la
strutturazione, l’accreditamento ed il mantenimento di laboratori di immunoematologia molecolare nelle
Strutture Trasfusionali, che a ciò saranno auspicabilmente deputate dalla programmazione regionale e
O

nazionale.
ST

Pertanto questo testo non ha la presunzione di fornire una risposta a tutti i quesiti, né tantomeno di essere
un testo definitivo, dato il rapido divenire di conoscenze e tecnologia; vuole invece essere un documento di
facile comprensione e consultazione, con l’obiettivo di stimolare conoscenze immunoematologiche
TE

approfondite, di orientare gli operatori del settore verso un utilizzo esperto e consapevole delle tecnologie
e di promuovere l’uniformità dei percorsi diagnostici.

Benefici attesi
I benefici attesi dalla divulgazione e applicazione delle presenti Raccomandazioni sono:
• la definizione di situazioni in cui sia appropriato eseguire le indagini molecolari
• l’individuazione di modelli di integrazione tra tecniche molecolari e tecniche sierologiche di I e II livello
• la proposta di strumenti per interpretare e gestire correttamente i risultati di tipizzazione e le eventuali
discrepanze
• l’indicazione dei punti fondamentali per governare il processo e tenere sotto controllo le sue criticità
• l’inquadramento degli aspetti cogenti della normativa vigente in relazione alla gestione del materiale
genetico e dei risultati ottenuti.

Destinatari delle Linee Guida


Medici, biologi e tecnici che operano nelle Strutture Trasfusionali, in particolare nel settore della
diagnostica immunoematologica.

11
1. ORGANIZZAZIONE

Attualmente la classificazione ISBT (International Society of Blood Transfusion) riporta 36 sistemi gruppo-
ematici (circa 400 antigeni e 1.500 alleli) e 29 sistemi HPA (Human Platelet Antigens).
La conoscenza delle basi genetiche del polimorfismo degli antigeni eritrocitari e piastrinici e l’evoluzione
delle tecniche di analisi molecolare hanno fornito potenti strumenti di analisi, che negli ultimi due decenni
si sono integrati in modo complementare con le tecniche sierologiche nel processo di diagnostica
immunoematologica:
• per supportare la risoluzione di casi immunoematologici complessi e discrepanze di tipizzazione
• per identificare varianti antigeniche
• per tipizzare estesamente pazienti e donatori e garantire una migliore efficacia e sicurezza della
trasfusione
• per identificare feti a rischio di Malattia Emolitica del Feto e del Neonato (MEFN) e Piastrinopenia
Feto-Neonatale Alloimmune (PFNA) e monitorare in modo appropriato la gravidanza.
L’impiego di tecniche di analisi molecolare impone elevata esperienza e competenza in questo campo, così
come richiesto per l’utilizzo delle indagini sierologiche. Se infatti è la sierologia che indica quando ricorrere

E
alla diagnostica molecolare, è ad essa che inevitabilmente si deve ritornare per interpretare i risultati alla

N
luce di quanto entrambi gli approcci, sierologico e molecolare, hanno evidenziato.
LI
1.1 Criteri organizzativi per l’esecuzione di indagini di immunoematologia molecolare
Le indagini di immunoematologia molecolare per lo studio degli antigeni eritrocitari e piastrinici devono
N
essere eseguite, validate e refertate da laboratori di immunoematologia presenti all’interno di Strutture
O

Trasfusionali autorizzate e accreditate secondo quanto previsto dalla normativa nazionale vigente.
Il Responsabile del laboratorio, che coordina le attività, le procedure ed i processi applicati dovrebbe avere
almeno cinque anni di documentata esperienza in immunoematologia avanzata e almeno due anni in
O

immunoematologia molecolare.
I laboratori che utilizzano tecniche di analisi molecolare per le indagini di immunoematologia devono:
ST

• partecipare almeno ogni 6 mesi a programmi di Valutazione Esterna di Qualità (VEQ) per gli antigeni
tipizzati che siano significativi per rappresentatività e numero di partecipanti
TE

• eseguire la convalida dei processi di tipizzazione molecolare prima della loro applicazione e a seguito di
modifiche rilevanti delle metodiche, delle apparecchiature e dei software di analisi ed interpretazione
• effettuare audit interni sull’intero processo diagnostico almeno una volta all’anno
• disporre di personale adeguatamente addestrato e qualificato.

Sono indicati come Laboratori di Immunoematologia Molecolare di Riferimento quelli che ai requisiti
precedenti aggiungono anche i seguenti:
• esecuzione di almeno 500 tipizzazioni molecolari/anno complessive in pazienti e/o donatori
• disponibilità di due metodiche differenti di analisi molecolare per i principali sistemi antigenici
eritrocitari e piastrinici.

12
Si raccomanda che i laboratori che eseguono indagini di immunoematologia molecolare per gli antigeni
eritrocitari e piastrinici:
• appartengano a Strutture Trasfusionali autorizzate e accreditate
• abbiano un Responsabile con almeno cinque anni di esperienza in immunoematologia avanzata e
almeno due anni in immunoematologia molecolare

Si raccomanda che i Laboratori di Immunoematologia Molecolare di Riferimento:


• eseguano almeno 500 tipizzazioni molecolari/anno complessive in pazienti e donatori
• dispongano di due metodiche differenti di analisi molecolare per i principali sistemi antigenici.

1.2 Organizzazione del lavoro


Il laboratorio deve impiegare barriere fisiche e/o biochimiche per prevenire la contaminazione da
amplificato. In particolare devono essere garantite:

E
• la separazione tra area di pre-amplificazione e area di post-amplificazione

N
• l'uso di apparecchiature, dispositivi e materiale di consumo dedicati.

1.2.1
LI
Nell’area di pre-amplificazione devono essere eseguite solo le attività che escludano l’impiego di amplificati
N
che possano fungere da DNA stampo per l’amplificazione con qualunque metodica utilizzata in laboratorio,
O

in particolare per:
• la ricostituzione e la preparazione di aliquote di reagenti
• l’estrazione del DNA
O

• la quantificazione del DNA estratto


ST

• l’allestimento delle reazioni di amplificazione e post-amplificazione (queste ultime con l’esclusione


della dispensazione di amplificati).
TE

1.2.2
Nell’area di post-amplificazione si devono svolgere tutte le attività che riguardano l’uso di termociclatori o
sono successive ad esso:
• amplificazione del DNA
• elettroforesi post-PCR
• dispensazione degli amplificati nella fase post-amplificazione (per le metodiche che lo prevedano).

Si raccomanda di separare l’area di pre-amplificazione e l’area di post-amplificazione ed utilizzare


apparecchiature, dispositivi e materiale di consumo dedicati per prevenire la contaminazione da
amplificato.

13
Si raccomanda di eseguire nell’area di pre-amplificazione solo le attività che escludano l’impiego di
amplificati che possano fungere da DNA stampo per l’amplificazione con qualunque metodica utilizzata
in laboratorio.

Si raccomanda di eseguire nell’area di post-amplificazione tutte le attività che riguardano l’uso di


termociclatori o sono successive ad esso.

1.3 Bibliografia
1. Accordo tra il Governo, le Regioni e le Province autonome di Trento e Bolzano, ai sensi dell’art.4 del
decreto legislativo 28 agosto 1997, n.281 sui requisiti minimi organizzativi, strutturali e tecnologici
delle attività sanitarie dei servizi trasfusionali e delle unità di raccolta e sul modello per le visite di
verifica.
2. Accordo tra il Governo, le Regioni e le PA di Trento e Bolzano del 16 dicembre 2010, All. A “Requisiti
strutturali tecnologici e organizzativi minimi per l’esercizio delle attività sanitarie dei servizi

E
trasfusionali e delle unità di raccolta del sangue e degli emocomponenti, ai sensi dell’articolo 6,

N
comma 1, lettera a) e dell’articolo 19, comma 1 della legge 21 ottobre 2005, n. 219”.
3. Grazzini G, Berti P, Boccagni P, Bonini R, Fiorin F, Gandini G, Menichini I. Standard di Medicina
LI
Trasfusionale. SIMTI, 3° edizione, ottobre 2017.
4. Standards for histocompatibility & immunogenetics testing. European Federation for Immunogenetics.
N
Version 7.0, October 2017.
O

5. Standards for molecular testing for red cell, platelet and neutrophil antigens, AABB, 3nd edition,2016.
6. The ISBT (International Society of Blood Transfusion) Site: http://isbtweb.org/working-parties/red-cell-
immunogeneticsand-blood-group-terminology [accessed on 06 February 2018].
O
ST
TE

14
2. METODICHE

2.1 Generalità
Il polimorfismo della maggior parte dei gruppi sanguigni di cui sia nota la sequenza genica dipende da una
singola sostituzione nucleotidica (Single Nucleotide Polymorphysm, SNP). Data l’elevata correlazione con il
fenotipo, i test basati su tecniche molecolari forniscono informazioni sui polimorfismi che codificano per un
antigene eritrocitario o piastrinico e possono predire con un alto grado di accuratezza il fenotipo
corrispondente della maggior parte degli antigeni eritrocitari.

2.2 Tecniche disponibili


Le numerose tecniche disponibili sono tutte basate sulla reazione polimerasica a catena (PCR) e possono
essere distinte in base a: A) principi applicati, B) caratteristiche operative e differente produttività, C)
ambiti di applicazione preferenziali, come riportato nella tabella seguente.

2.2.1 Tecniche a bassa produttività

E
PCR-RFLP e PCR-SSP

N
Definizione degli alleli presenti mediante l’impiego di più coppie di primer, specifici per i punti di
A
polimorfismo del gene. LI
Metodiche interamente manuali, necessitano di processazione post-PCR, richiedono tempi
B relativamente lunghi di esecuzione. Il prodotto di PCR può essere rilevato con elettroforesi su gel
N
d’agarosio o misurazione di fluorescenza.
O

Risoluzione di discrepanze di tipizzazione ABO/Rh, identificazione di varianti alleliche (in particolare


C
per gli antigeni del sistema Rh) e zigosità RHD.
O

2.2.2 Tecniche a media produttività


ST

SSO

Analisi del polimorfismo allelico mediante la combinazione di PCR e ibridazione di sonde sequenza-
A
TE

specifiche biotinilate o marcate con fluorocromi.


Analisi simultanea di più sistemi gruppo ematici in più campioni contemporaneamente con
B esecuzione automatica, sensibilità e livello di risoluzione dipendenti dal numero di sonde/locus
utilizzate, necessita di processazione post-PCR.

C Tipizzazione di antigeni eritrocitari di donatori e pazienti.

Real-time PCR e Droplet Digital PCR

Identificazione in tempo reale della progressione dell’amplificazione di sequenze target, con


A
successiva analisi quantitativa del prodotto di PCR. Sua evoluzione è la Droplet Digital PCR.

B Sensibilità elevata, richiede limitate quantità di DNA e non necessita di processazione post-PCR.

C Determinazione del genotipo fetale da plasma materno, screening di donatori antigene-negativi.

15
Sequenziamento (SBT)

A Determinazione della sequenza nucleotidica di regioni di DNA predefinite.

Amplificazione esone-specifica con successiva rilevazione fluorimetrica dei frammenti mediante


B
elettroforesi capillare.
Risoluzione di discrepanze, identificazione di nuovi alleli o interpretazione di risultati ambigui con
C
altre metodiche.

2.2.3 Tecniche ad alta produttività

Microarray

A partire da multiplex PCR, con differenti modalità di sviluppo (fase solida, fase liquida) e
A
piattaforme semiautomatiche, permette l’analisi simultanea di più SNPs.
Analisi simultanea di più polimorfismi in più campioni contemporaneamente con esecuzione

E
B semiautomatica; l’interfacciamento al gestionale del laboratorio consente la tracciabilità dei
risultati ed evita trascrizioni manuali.

N
Tipizzazione estesa eritrocitaria e piastrinica di donatori e pazienti per la definizione di numerose
C LI
varianti alleliche.
N
Spettrometria di massa
O

A Metodo quantitativo e qualitativo che permette l’analisi di più polimorfismi in una singola reazione.

E’ flessibile (altissima produttività), sensibile e specifica, ma costosa e necessita di numerosi


O

B
passaggi manuali.
ST

C Tipizzazione estesa, determinazione del genotipo fetale e della zigosità RHD.

Next Generation Sequencing (NGS)


TE

Sequenziamento clonale di intere regioni del genoma mediante sequenze brevi, successivamente
A
mappate su una sequenza di riferimento del genoma umano.
Possiede elevata sensibilità e specificità, necessita di competenze di alto livello
B
(immunoematologiche, genetiche, bioinformatiche).

C Tipizzazione degli antigeni eritrocitari dei donatori e determinazione del genotipo RHD fetale.

2.3 Strumentazione
Deve essere identificata in maniera univoca e tracciabile la strumentazione utilizzata per i test
molecolari e ritenuta critica per l’attendibilità del risultato di tipizzazione.

16
I laboratori di immunoematologia molecolare devono:
• utilizzare strumentazione con marchio CE-IVD, qualificata prima dell’uso e a seguito di
aggiornamenti rilevanti
• descrivere e documentare le modalità operative per garantire il corretto utilizzo, la pulizia, la
calibrazione, il controllo e la manutenzione, in conformità con le indicazioni del produttore, se
disponibili, e monitorarle nel tempo
• eseguire la manutenzione preventiva delle apparecchiature secondo il calendario predisposto dal
produttore o, in assenza, almeno una volta l’anno
• verificare e registrare regolarmente la temperatura di frigoriferi e congelatori destinati alla
conservazione dei reagenti; si suggerisce una registrazione continua delle temperature con
controllo remoto, affinché sia garantita la corretta conservazione del materiale diagnostico anche in
assenza del personale del laboratorio.

2.4 Gestionale informatico e software

E
Si suggerisce, ove la dotazione tecnologica lo consenta, di interfacciare le apparecchiature ed i software
di analisi dei risultati (elaborazione del genotipo, predizione del fenotipo) in modalità Query-Host

N
(bidirezionale) con il sistema gestionale informatizzato utilizzato dalla Struttura Trasfusionale.
LI
Si raccomanda di utilizzare un sistema gestionale e/o un middleware in grado di rilevare eventuali
N
risultati discrepanti con la tipizzazione presente nel database.
O

Si suggerisce di utilizzare un software in grado di discriminare le tipizzazioni eseguite con tecniche


O

sierologiche e confermate con metodica molecolare.


ST

I programmi informatizzati utilizzati per l’analisi dei risultati (compreso il middleware) dovrebbero
essere convalidati prima dell’uso e a seguito di aggiornamenti rilevanti.
TE

Qualora le apparecchiature non siano direttamente interfacciate con i programmi gestionali,


dovrebbero essere definiti specifici controlli di accuratezza del dato da applicare e dovrebbe essere
documentato l’inserimento manuale di risultati di tipizzazione nel sistema gestionale informatizzato,
garantendone la rintracciabilità.

2.5 Metodiche
Tutte le metodiche in uso devono essere convalidate prima della loro introduzione e a seguito di
modifiche rilevanti.

17
Per ciascuna metodica devono essere definiti:
• le modalità e le condizioni tecniche di esecuzione
• i controlli di contaminazione ed i controlli negativi e positivi da includere in ciascuna sessione di
lavoro (ove applicabile)
• i criteri di accettabilità della tipizzazione
• i criteri di assegnazione dei nucleotidi (ove applicabile) e degli alleli
• i criteri per definire il genotipo ed il fenotipo predetto
• le azioni da intraprendere in caso di positività del controllo negativo o di fallimento
dell’amplificazione del controllo positivo.

Si raccomanda che l’assegnazione delle reazioni positive e negative (ove applicabile) e l’interpretazione
siano eseguite separatamente da due operatori, nel caso in cui i risultati non siano trasferiti
automaticamente in maniera bidirezionale.

E
I dati grezzi di tipizzazione (in formato cartaceo o digitale) ed i fogli di interpretazione corrispondenti ai

N
lotti utilizzati devono conservati secondo quanto previsto dalla normativa nazionale.
LI
2.5.1 Estrazione del DNA
N
Il laboratorio deve determinare la concentrazione e il grado di purezza del DNA, affinché siano adeguati a
quanto richiesto dalle metodiche in uso e sufficienti per ottenere risultati interpretabili.
O

Se il DNA non è utilizzato subito dopo l’estrazione/purificazione, deve essere conservato in modo da
preservarne l’integrità; si suggerisce di conservarlo in spazio freddo dedicato a temperatura di +4°C/-20°C
O

secondo le indicazioni dei produttori dei kit diagnostici.


ST

Si raccomanda di determinare per ogni campione la concentrazione e il grado di purezza del DNA
estratto.
TE

2.5.2 Elettroforesi
Il laboratorio deve definire le condizioni di migrazione elettroforetica (voltaggio, tempo, concentrazione del
supporto e pH delle soluzioni, scelta del colorante) per ciascuna tipologia di prodotti di amplificazione da
analizzare.
Il laboratorio deve inserire in ciascuna corsa elettroforetica su gel i campioni di controllo (ladder) composti
da frammenti di dimensioni note e con un range che comprenda le dimensioni dei prodotti di
amplificazione.

Si raccomanda di definire le condizioni di migrazione elettroforetica e di inserire un DNA di controllo in


ciascuna corsa elettroforetica su gel.

18
2.5.3 SSP
Ciascuna reazione di PCR deve includere un controllo interno che produca un amplificato distinguibile dal
prodotto di amplificazione del campione e garantisca l’avvenuta amplificazione in ogni reazione.
In ciascuna seduta di PCR deve essere presente anche un controllo negativo, composto dai reagenti
utilizzati escluso il DNA.

Si raccomanda che ciascuna reazione di amplificazione includa un controllo interno di amplificazione e


che in ciascuna seduta di amplificazione sia presente un controllo negativo.

2.5.4 SSO
Si raccomanda che:
• sia definita e monitorata la specificità e l’intensità del segnale per ciascuna sonda
• l’amplificazione sia verificata mediante elettroforesi su gel prima della fase di ibridazione
• ciascun test contenga un controllo negativo e controlli positivi di ibridazione e di rilevazione.

E
N
2.5.5 Real-Time PCR
Si raccomanda di utilizzare primer rappresentativi del gene da analizzare e dei suoi principali
LI
polimorfismi.
N
Si raccomanda che sia definito il valore soglia (Threshold cycle, Ct) accettabile per ciascun prodotto di
O

amplificazione se diverso da quello proposto dal sistema diagnostico utilizzato o assente in caso di
tecnica home-made.
O
ST

2.5.6 Microarray
Si raccomanda che ogni seduta di tipizzazione includa un controllo negativo ed un controllo positivo,
ove possibile, dei principali sistemi antigenici analizzati.
TE

2.5.7 Sequenziamento (Secondo Sanger)


Gli amplificati devono essere purificati dopo l’amplificazione per rimuovere dNTP, Taq polimerasi, primer
residui; non devono contenere inibitori o contaminanti che possano compromettere il risultato.
Deve essere definita la sequenza target del primer specifico per i locus e per gli alleli analizzati; devono
essere garantite quantità e qualità di amplificati, primer e reagenti per la reazione di sequenza; per geni
altamente polimorfici deve essere eseguito il sequenziamento bidirezionale.
Devono essere definite e documentate le condizioni ottimali per ottenere dati validabili: valore medio di
intensità del segnale/background di fluorescenza, fluttuazioni della linea di base, intensità di fluorescenza,
forma e distanza dei picchi di fluorescenza.

Si raccomanda che gli amplificati siano purificati dopo l’amplificazione e non contengano inibitori o
contaminanti che possano compromettere il risultato.

19
Si raccomanda di definire la sequenza target del primer specifico per i locus e per gli alleli analizzati, di
garantire la quantità e la qualità di amplificati, primer e reagenti per la reazione di sequenza; per geni
altamente polimorfi è raccomandato il sequenziamento bidirezionale.

Si raccomanda di definire e documentare le condizioni ottimali per ottenere dati validabili: valore
medio di intensità del segnale/background di fluorescenza, fluttuazioni della linea di base, intensità di
fluorescenza, forma e distanza dei picchi di fluorescenza.

2.5.8 Next Generation Sequencing (NGS)


Il laboratorio deve documentare la marcatura del campione, la purificazione, la normalizzazione, il metodo
di pooling; devono essere descritte e documentate la procedura utilizzata per la prevenzione di artefatti di
PCR. Devono essere definiti controlli e procedure per garantire la tracciabilità del campione durante le fasi
di pooling e la marcatura di ogni campione con un codice-sequenza (barcoding)
Se viene utilizzato il metodo shotgun-sequencing devono essere specificati il metodo di frammentazione, di

E
selezione dei frammenti e le strategie di arricchimento per pannelli contenenti più geni; deve essere

N
documentata la dimensione dei frammenti di ciascuna corsa.
Devono essere definite e documentate le condizioni per l’accettazione del campione, per l’assegnazione dei
LI
nucleotidi e le deviazioni dallo standard, definendo criteri scientificamente e tecnicamente consolidati per
accettare o rifiutare regioni della sequenza di difficile risoluzione.
N
Il laboratorio deve definire i criteri per l’assegnazione degli alleli, escludendo le regioni dei primer
amplificati dall’assegnazione allelica e stabilendo un coverage adeguato.
O

Devono essere stabiliti e documentati i parametri di qualità per una performance ottimale. I dati grezzi, i
dati intermedi e finali e le impostazioni di corsa devono essere conservati secondo quanto previsto dalla
O

normativa nazionale vigente.


Deve essere tracciabile tutto il processo bioinformatico per ciascun campione analizzato.
ST

Gli attuali ambiti di ricerca della bioinformatica includono l'allineamento di sequenze geniche, la predizione genica, l’allineamento di
sequenze genetiche, la predizione della struttura genetica, l’espressione genica e l’interazione proteina-proteina.
TE

Si raccomanda di:
• includere un controllo interno di amplificazione ed un controllo negativo in ciascuna reazione di
amplificazione
• documentare la marcatura del campione, la purificazione, la normalizzazione e il metodo di pooling
• quantificare la libreria
• specificare il metodo di frammentazione e documentare la dimensione dei frammenti, se utilizzato
il metodo shotgun-sequencing
• specificare e documentare la percentuale di reads di bassa qualità, le “passing filter reads” della
corsa, un coverage adeguato, le condizioni ottimali per ottenere dati validabili (readlength,
readdepth, coverage)
• specificare, rispettare e documentare le condizioni per l’accettazione del campione e deviazioni
dallo standard.

20
Si raccomanda di dare evidenza di tutto il processo bioinformatico per ciascun campione analizzato.

2.6 Tracciabilità
Le procedure di analisi molecolare devono essere documentate in modo tale da garantire la tracciabilità
di:
• sistema diagnostico utilizzato
• lotto e scadenza dei reagenti critici
• apparecchiatura e profilo di estrazione/analisi (ove applicabile)
• termociclatore e programma di amplificazione utilizzato (ove applicabile)
• operatori coinvolti nelle attività diagnostiche, di interpretazione e di refertazione
• eventuali deviazioni riscontrate nel corso del processo e relative modalità di gestione.

E
È auspicabile che la tracciabilità sia garantita, ove possibile, mediante procedure informatizzate per
l’identificazione del campione e l’interfacciamento degli strumenti al sistema gestionale informatizzato

N
della Struttura Trasfusionale. Poiché attualmente ciò è possibile solo parzialmente e per un numero limitato
LI
di tecnologie, il laboratorio deve definire procedure documentate per colmare le lacune di tracciabilità
informatica e darne evidenza, con particolare attenzione alle fasi del processo che comportano il
N
trasferimento manuale del campione biologico (sangue, DNA, prodotto di amplificazione).
O

La tracciabilità deve essere garantita, ove possibile, mediante procedure informatizzate per
l’identificazione del campione e l’interfacciamento degli strumenti al sistema gestionale informatizzato.
O
ST

Il laboratorio deve definire procedure documentate, al fine di garantire la tracciabilità di


procedure/processi non informatizzati, e darne evidenza.
TE

2.7 Controllo della contaminazione da amplificati (Wipe Test)


L’elevata sensibilità delle tecniche di biologia molecolare implica un corrispondente rischio di
contaminazioni, la più temibile delle quali è la contaminazione da amplificati. Infatti la PCR può generare
fino a 1012 molecole di amplificati di DNA in 0,1 mL di reazione e, in assenza di precauzioni e controlli
rigorosi, le contaminazioni possono causare pericolosi risultati falsi positivi.
Le usuali precauzioni per la prevenzione della contaminazione da amplificati (controllo negativo in ogni
seduta di lavoro, separazione di ambienti, strumentazione e reagenti tra area pre- e post-amplificazione,
pulizia di superfici e strumentazione) devono essere integrate con un piano di controllo degli amplificati
(wipe-test) prodotti in laboratorio, come verifica dell’efficacia delle misure di prevenzione ed a garanzia
dell’attendibilità dei test.
Il wipe-test deve includere zone di lavoro (ad es. estrazione del DNA, allestimento PCR) e strumentazione
critica (pipette, estrattore, centrifughe) dell’area pre-amplificazione; possono essere incluse anche altre
aree del laboratorio se ritenute rilevanti.
Il wipe-test deve essere eseguito con una metodica di sensibilità comparabile a quelle utilizzate di routine e
deve includere un controllo positivo per garantire un adeguato monitoraggio. Il laboratorio deve descrivere
e documentare le azioni da intraprendere nel caso in cui il wipe test rilevi la presenza di amplificato.
21
Il wipe-test deve essere eseguito almeno ogni sei mesi o a seguito di contaminazione del controllo negativo
in tre sedute consecutive di analisi, anche con metodiche differenti.

Si raccomanda di integrare le usuali precauzioni per la prevenzione della contaminazione da amplificati


con un piano di monitoraggio della contaminazione da amplificati (wipe-test) con cadenza almeno
semestrale o a seguito di contaminazione del controllo negativo in tre sedute consecutive di analisi,
anche con metodiche differenti.

Si raccomanda che il wipe-test sia eseguito con una metodica di sensibilità comparabile a quelle
utilizzate di routine, includa zone di lavoro e strumentazione critica dell’area pre-amplificazione ed un
controllo positivo.

Si raccomanda che il laboratorio definisca e documenti le azioni da intraprendere nel caso in cui il wipe
test rilevi la presenza di amplificato.

E
N
2.8 Raccolta ed identificazione del campione
Il laboratorio deve definire le caratteristiche del campione biologico accettabili per le indagini
LI
immunoematologiche molecolari (identificazione, volume, anticoagulante, modalità di trasporto e
N
temperatura di conservazione del campione, presenza della richiesta e del consenso, se applicabile).
I campioni biologici destinati alla tipizzazione molecolare di antigeni eritrocitari e piastrinici devono essere:
O

• prelevati in provette sterili con appropriato anticoagulante (no eparina)


• identificati in modo univoco con cognome, nome, data di nascita, data e ora del prelievo (dove
O

rilevante) e firma di chi ha effettuato il prelievo .


È auspicabile che il campione riporti un codice identificativo univoco che ne permetta la rintracciabilità.
ST

I campioni destinati ad indagini immunoematologiche molecolari devono essere accompagnati da un


modulo di richiesta con le seguenti informazioni:
• dati anagrafici del paziente
TE

• codice identificativo univoco


• genere ed etnia
• data ed ora del prelievo (se rilevante)
• test richiesto ed indicazione (breve anamnesi immunoematologica/ostetrica/trasfusionale)
• nome e recapito del professionista a cui inviare il referto.

Il laboratorio deve definire le caratteristiche del campione biologico accettabili per le indagini
molecolari.

I campioni biologici destinati alla tipizzazione molecolare di antigeni eritrocitari e piastrinici mediante
indagini immunoematologiche molecolari devono essere prelevati in provette sterili con appropriato
anticoagulante ed essere identificati in modo univoco con cognome, nome, data di nascita e firma del
prelevatore. E’ auspicabile che il campione riporti un codice identificativo univoco che ne permetta la
rintracciabilità.

22
2.9 Bibliografia
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blood group genotyping. Vox Sang 2005; 88: 136–142.
2. Daniels G, van der Schoot CE & Olsson ML. Report of the Second International Workshop on molecular
blood group genotyping. Vox Sang 2007; 93: 83–88.
3. Daniels G, van der Schoot CE, Gassner C & Olsson ML. Report of the Third International Workshop on
Molecular Blood Group Genotyping. Vox Sang 2009; 96: 337–343.
4. Daniels G, van der Schoot CE & Olsson ML Report of the Fourth International Workshop on molecular
blood group genotyping. Vox Sang 2011; 101: 327–332.
5. Denomme GA, Schanen MJ. Mass-scale donor red cell genotyping using real-time array technology.
Immunohematology 2015; 31: 69-74.
6. Goldman M, Nogués N, Castilho LM. An overview of the Progenika ID CORE XT: an automated
genotyping platform based on fluidic microarray system. Immunohematology 2015; 31: 62-67.
7. Guidance for Standards for molecular testing for red cell, platelet and neutrophil antigens. AABB, 2nd
edition, 2013.
8. Johnsen JM. Using red blood cell genomics in transfusion medicine. Hematology 2015; 1: 168-176.

E
9. Keller MA. The role of red cell genotyping in transfusion medicine. Immunohematology 2015; 31: 49-

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52.
10. Latini FRM, Castilho LM. An overview of the use of SNaPshot for predicting blood group antigens.
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Immunohematology 2015; 31: 53-57.
11. Lopez M, Apraiz I, Rubia M, et al. Performance evaluation study of ID CORE XT, a high throughput
N
blood group genotyping platform. Blood Transfus 2018; 16: 193-9.
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12. Manfroi S, Pagliaro P. Genotyping patients’ and donors’ blood groups for efficient blood therapy.
Blood Transfus 2014; 12 Suppl.1: s305-7.
13. McBean RS, Hyland CA, Flower RL. Blood group genotyping: the power and limitations of the Hemo ID
O

Panel and MassARRAY platform. Immunohematology 2015; 31: 75-80.


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14. Monteiro F, Tavares G, Ferreira M et al. Technologies involved in molecular blood group genotyping.
Vox Sang ISBT Sci Ser 2011; 6: 1-6.
15. Motemayor-Garcia, Westhoff CM. The “next generation” reference laboratory? Transfusion 2018; 58:
TE

277-9.
16. Paccapelo C, Truglio F, Villa MA et al. HEA BeadChip TM technology in immunohematology.
Immunohematology 2015; 31: 81-90.
17. Reid ME. Overview of molecular methods in immunohematology. Transfusion 2007; 47: 10S-16S.
18. Reid ME, Denomme GA. DNA-Based methods in the Immunohematology Reference Laboratory.
Transfus Apher Sci 2011; 44: 65–72.
19. Shoeman EM, Roulis EV, Liew Y, et al. Targeted exome sequencing defines novel and rare variants in
complex blood group serology cases for a red blood cell reference laboratory setting. Transfusion
2018; 58: 284-93.
20. Sillence KA, Halawani AJ, Tounsi WA et al. Rapid RHD zygosity determination using digital PCR. Clin
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21. Svobodova I, Pazourkova E, Horinek A e al. Performance of droplet digital PCR in non-invasive fetal
RHD genotyping – Comparison with a routine Real-Time PCR based approach. PLoSONE 2015; 10(11):
e0142572.doi:1371/journal.pone.0142572.

23
3. DONATORI

3.1 Generalità
La conoscenze delle basi molecolari della gran parte degli antigeni eritrocitari ha permesso di utilizzare le
tecniche di analisi molecolare per predire con un alto grado di accuratezza la maggioranza dei fenotipi
eritrocitari e piastrinici dei donatori di sangue.
L’uso delle metodiche molecolari sui donatori deve essere fondamentalmente riservato alle strutture
trasfusionali che sono sede di banca dei fenotipi rari o che, per specifiche esigenze cliniche, necessitino di
un numero significativo di donatori con tipizzazione estesa.
Le metodiche molecolari possono trovare indicazione in caso di rari quadri di tipizzazione sierologica non
conclusiva nei quali si ritenga fortemente opportuno, se non necessario, dirimere i dubbi lasciati dalle
metodiche sierologiche.
L’impiego routinario della tipizzazione molecolare dei donatori è da considerarsi non indicato.

3.2 Indicazioni
3.2.1

E
La determinazione in biologia molecolare degli antigeni eritrocitari e piastrinici dei donatori è indicata nei

N
seguenti casi:
• risoluzione di quadri sierologici discrepanti o inconclusivi: (es. O2 o altra variante)
LI
• determinazione di un antigene debolmente reattivo: (es. varianti RHD, antigeni di altri sistemi
antigenici)
N
• conferma di tipizzazione sierologica di un antigene per cui non sia disponibile l’antisiero (es. sistema
O

Dombrock , antigeni rari ad alta frequenza)


• tipizzazione eritrocitaria e/o piastrinica estesa con metodiche ad alta produttività per l’istituzione di
una Banca/Registro di donatori con fenotipo raro.
O
ST

Si raccomanda di determinare gli antigeni eritrocitari e piastrinici con tecniche di biologia molecolare nei
donatori di sangue per la risoluzione di discrepanze sierologiche, per la caratterizzazione di antigeni deboli
o di varianti, per la conferma di antigeni rari e nell’ambito di programmi di tipizzazione estesa volti a
TE

creare banche di fenotipi rari.


3.2.2

La tipizzazione genomica deve essere confermata su un secondo campione biologico, utilizzando


metodiche sierologiche o, in alternativa, una diversa metodica molecolare qualora non esistano antisieri
specifici.

3.3 Criteri di selezione dei donatori per la creazione di un Registro/Banca di sangue raro
3.3.1
Il laboratorio deve stabilire preventivamente i criteri di selezione dei donatori da tipizzare su larga scala
per i sistemi gruppo-ematici eritrocitari, tenendo in considerazione: età, gruppo ABO, fenotipo Rh/K,
numero di donazioni.

24
3.3.2
E’ possibile individuare i donatori con fenotipo raro utilizzando due differenti strategie: mediante la
tipizzazione di tutti i donatori periodici oppure applicando la tipizzazione solo a donatori selezionati in
base al gruppo ABO, al fenotipo Rh o all’etnia. A causa dei costi e della scarsa disponibilità di antisieri per
la tipizzazione, l’approccio più frequentemente utilizzato è quello di ottimizzare le risorse applicandole a
donatori selezionati in base alle proprie necessità, attraverso la tipizzazione di alcuni antigeni mirati.
Pertanto, come raccomandato dalle Banche/Registri Internazionali, si indicano i seguenti criteri per i
donatori caucasici:

Età: ≤ 55 anni

Gruppo sanguigno: O e/o A

Fenotipi Rh: CCDee, ccdee, ccDee, ccDEE, CCdee, ccdEE, Ccdee, ccdEe

Fenotipo Kell: KK, kk

E
Numero di donazioni: ≥ 2

N
LI
Per la tipizzazione eritrocitaria su larga scala si raccomanda di selezionare donatori con almeno due
N
donazioni in base ad età, gruppo ABO, fenotipo Rh/K.
O

3.3.3
Il laboratorio che esegua la tipizzazione su larga scala dei donatori per i sistemi piastrinici HPA deve
O

stabilire preventivamente i criteri di selezione, tenendo in considerazione la tipologia di emocomponente


donato e l’età.
ST

3.4 Selezione di antigeni per la tipizzazione su larga scala


Il laboratorio deve individuare i sistemi gruppo ematici che intende tipizzare con tecniche di biologia
TE

molecolare in base a studi di popolazione o alle esigenze dettate dalla tipologia di attività.

Si raccomanda di tipizzare in biologia molecolare i sistemi gruppo ematici con maggior potere
immunogeno (RHD, RHCE, MNS, KEL, FY, JK, LU) e/o antigeni piastrinici del sistema HPA.

3.5 Donatori di etnia non caucasica


La frequenza degli antigeni eritrocitari varia, anche significativamente, tra i differenti gruppi etnici. Poiché
in futuro saremo parte di una popolazione sempre più multietnica, questa eterogeneità potrebbe
rappresentare una criticità in ambito trasfusionale a causa del difficile reperimento di unità di gruppo raro
compatibili con i soggetti immunizzati.
Pertanto nella tipizzazione su larga scala può essere opportuno inserire i donatori di sangue di etnia non
caucasica, indipendentemente da gruppo ABO, fenotipo Rh/K, età e numero di donazioni.

Si suggerisce di includere nella tipizzazione su larga scala tutti i donatori non caucasici, senza alcun
criterio di selezione.

25
3.6 Tipizzazioni particolari
3.6.1 DEL
Il fenotipo DEL rappresenta un’espressione molto debole dell’antigene RhD, generalmente non rilevato
con le metodiche sierologiche di routine ed evidenziabile sierologicamente solo con tecniche di
assorbimento ed eluizione. Gli individui con tale fenotipo possono essere erroneamente tipizzati come
RhD negativi ed essere causa di alloimmunizzazione qualora le unità donate siano trasfuse ad individui
RhD negativi.
Pertanto è recentemente emersa in letteratura l’importanza di tipizzare in biologia molecolare, mediante
test in singolo o pooling, i donatori RhD negativi con fenotipo RhC+ o RhE+ per rilevare o escludere la
variante DEL.

Si suggerisce di selezionare per la tipizzazione in biologia molecolare i donatori RhD negativi con
fenotipo RhC+ o RhE+, per escludere la presenza della variante DEL.

3.6.2 V/VS

E
La tipizzazione eritrocitaria in biologia molecolare ha permesso di identificare nuovi varianti alleliche dei

N
geni RHD e RHCE, non infrequenti in individui risultati V o VS positivi.
LI
Si suggerisce di tipizzare con metodiche molecolari i donatori risultati V o VS positivi per escludere la
presenza di varianti alleliche dei geni RHD e RHCE.
N
O

3.6.3 LU
Il fenotipo Lu(a-b-) deriva da 3 distinti meccanismi molecolari che determinano un’inattivazione o una
O

riduzione del controllo dell’espressione genica degli antigeni di questo sistema. Per questa sua peculiarità
ST

nelle Banche di fenotipi rari il fenotipo raro Lu(a-b-) dovrebbe essere confermato in biologia molecolare,
utilizzando anche tecniche di sequenziamento.
TE

Si suggerisce di confermare con metodiche molecolari e sierologiche i donatori risultati Lu(a-b-).

3.7 Donatore raro


Un donatore si definisce raro se è negativo per un antigene ad alta incidenza o per la combinazione di più
antigeni che presentano una frequenza compresa tra <1:1.000 e <1:5.000 nella popolazione generale.
È importante che tali donatori siano segnalati come rari alla Struttura di Raccolta e nel sistema informatico
trasfusionale, e va valutata l’opportunità che ricevano comunicazione scritta della rarità del loro gruppo
sanguigno e dell'importanza della loro donazione di sangue per i pazienti immunizzati.

Si suggerisce di inviare comunicazione scritta ad ogni donatore che è identificato come raro.

26
3.8 Bibliografia
1. Ba A, Bagayoko S, Chiaroni J, et al. Genotyping of 28 blood group alleles in blood donors from Mali:
prediction of rare phenotypes. Transfus Apher Sci, 2016; 54: 289-295.
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E
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heterozygous group O-labeled red blood cell units. Transfusion 2008; 48: 1650-1657.
O
ST
TE

28
4. PAZIENTI

4.1 Generalità
Le indagini sierologiche rappresentano un metodo semplice e robusto per la tipizzazione gruppo-ematica di
pazienti e gestanti; tuttavia solo in specifiche condizioni diagnostiche e cliniche può risultare appropriata
l’esecuzione di indagini molecolari per superare le limitazioni dei metodi convenzionali e permettere la
definizione antigenica singola o estesa di sistemi eritrocitari e piastrinici.

4.2 Indicazioni
La tipizzazione in biologia molecolare dei sistemi gruppo-ematici e piastrinici può essere indicata in ambito
trasfusionale e ostetrico/prenatale nei seguenti casi:

4.2.1. Ambito trasfusionale (GdR 2B)


• risultati sierologici discrepanti: presenza di antigeni deboli o varianti dei sistemi ABO, RH, KEL, JK, FY,
MNS, LU
• definizione e conferma di fenotipi rari (se antisieri non disponibili)

E
• necessità di identificare il fenotipo eritrocitario (con presenza di agglutinazione a campo misto) di un

N
paziente senza precedente determinazione di gruppo, ma recentemente trasfuso presso un’altra
struttura LI
• supporto trasfusionale cronico in pazienti ad elevato rischio di immunizzazione (es. mielodisplasia,
emoglobinopatie, e in particolare pazienti drepanocitici non Caucasici)
N
• pazienti con test all’antiglobulina diretto positivo (TAD) e anemia emolitica autoimmune, non tipizzabili
O

con le tecniche sierologiche


• immunizzazione complessa: presenza di autoanticorpi, miscele di auto e alloanticorpi, alloanticorpi
O

multipli o diretti contro antigeni ad alta incidenza


• terapia farmacologica con anticorpi monoclonali diretti verso antigeni presenti sui globuli rossi (ad es.
ST

trattamento con anti-CD38)


• trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche (CSE), come test addizionale per il monitoraggio
dell’attecchimento emopoietico in caso di incompatibilità gruppo-ematica donatore-ricevente
TE

(testando, se disponibile, anche il campione del paziente pre-trapianto)


• alloimmunizzazione piastrinica.

Si suggerisce di eseguire la determinazione degli antigeni eritrocitari e piastrinici con metodi molecolari
in caso di: discrepanze sierologiche per la caratterizzazione di antigeni deboli o varianti, conferma di
fenotipi rari, test all’antiglobulina diretto positivo e anemia emolitica autoimmune, immunizzazione
complessa, terapia farmacologica con anticorpi monoclonali, trapianto allogenico di CSE con
incompatibilità donatore-ricevente, alloimmunizzazione piastrinica.

4.2.2. Ambito ostetrico/prenatale (GdR 2B)


• caratterizzazione delle varianti RhD nelle donne in gravidanza o con potenziale gravidico per la gestione
appropriata dell’immunoprofilassi anti-D (IP)
• studio della zigosità RHD paterna in caso di alloimmunizzazione anti-D materna
• tipizzazione genomica RH/KEL/HPA fetale con metodi invasivi o da plasma materno per la definizione
del rischio di MEFN (madre immunizzata) o per la gestione antenatale dell’IP (madre non immunizzata)

29
• definizione dei sistemi HPA materni e paterni in presenza di alloimmunizzazione piastrinica materno-
fetale o sospetta PFNA, essendo la tipizzazione neonatale indicata solo in caso di assenza di uno o
entrambi i genitori.

Si suggerisce di eseguire la determinazione degli antigeni eritrocitari e piastrinici con metodi


molecolari in caso di: varianti RhD per gestione appropriata dell’IP in gravidanza, studio della zigosità
RHD paterna, tipizzazione genomica Rh/K/HPA fetale con metodi invasivi o da plasma materno per la
definizione del rischio di MEFN (madre immunizzata) o per la gestione antenatale dell’IP (madre non
immunizzata), definizione dei sistemi HPA materni e paterni in presenza di alloimmunizzazione
piastrinica materno-fetale o sospetta PFNA.

4.3 Quali antigeni tipizzare


4.3.1 Sistema ABO
Deve essere evitata la tipizzazione molecolare ABO come test di routine; le uniche indicazioni sono le
discrepanze risolvibili grazie all’integrazione appropriata dei risultati ottenuti da metodiche di

E
assorbimento-eluizione e dalla caratterizzazione genomica.

N
I kit del commercio (che applicano la tecnica PCR-SSP) sono in grado di definire le varianti solo nel 50% dei
casi, comparando i polimorfismi identificati con la sequenza consensus dell’allele A1; nei rimanenti casi il
LI
riferimento per la refertazione è il risultato dei metodi sierologici.
Si raccomanda particolare attenzione all’analisi molecolare del fenotipo Oh (Bombay) e dell’allele O2.
N
O

La tipizzazione genomica ABO deve essere evitata come test di routine per la definizione del fenotipo
ABO, ma è da considerare come eventuale test di approfondimento nei casi di sospette varianti
antigeniche di rilevanza trasfusionale.
O
ST

4.3.2 Sistema RH (GdR 2B)


L’analisi molecolare ha contribuito ampiamente alla risoluzione e alla chiara definizione dei casi discrepanti
o inconclusivi della tipizzazione sierologica RhD secondo l’algoritmo diagnostico riportato in Fig.1.
TE

4.3.2.1
Si suggerisce di avviare alla tipizzazione molecolare per sospetta variante RhD solo le seguenti categorie di
pazienti:
• donne in stato di gravidanza o con potenziale gravidico (<50 anni)
• pazienti sottoposti a regime trasfusionale cronico (emoglobinopatici, oncoematologici, trapiantati)
• pazienti affetti da anemie emolitiche autoimmuni
• pazienti tipizzati come RhD positivi che presentano anticorpi con specificità anti-D
• pazienti pediatrici o in età giovanile (<30 anni).
4.3.2.2
I criteri sierologici dei campioni da selezionare per l’analisi molecolare del gene RHD sono:
• campioni con risultato negativo con sieri monoclonali anti-D IgM e/o IgM + IgG e risultato positivo al
test all’antiglobulina indiretto (TAI);
• campioni con debole reattività se testati con diversi antisieri (≤2+ in fase liquida, ≤3+ all’agglutinazione
su colonna e micropiastra) o con risultati discordanti e/o score differenti con sieri anti-D di cloni diversi.

30
4.3.2.3
Le varianti RhD comprendono:
• varianti D-partial (cluster DAU, D-weak tipo 4 e DIVa), prevalenti negli Africani
• varianti D-weak, prevalenti nei Caucasici
• varianti DEL, prevalenti negli Asiatici.
L’incidenza delle varianti alleliche RHD è 0,2-1% nei soggetti caucasici, ma molto più elevata negli individui
di origine Africana in cui possono essere presenti fenotipi categorizzati come parziali ad alto rischio di
immunizzazione nell’ambito degli antigeni RhC e Rhe.
4.3.2.4
Le varianti Rh individuate con tecniche sierologiche dovrebbero essere confermate in biologia molecolare e
sul referto devono essere riportate le implicazioni cliniche relative alla specifica variante identificata.
In particolare devono essere approfonditi in biologia molecolare tutti i casi di discrepanze o dubbi di
tipizzazione in sierologia in donne in gravidanza o con potenziale gravidico, per l’appropriata
somministrazione dell’IP, ovvero escludere dalla sua somministrazione le gravide che presentano le varianti
D-weak tipo 1, 2 e 3 e somministrarla esclusivamente in caso di varianti a rischio di sensibilizzazione.

E
N
Si raccomanda in caso di discrepanza di avviare all’analisi molecolare per il gene RHD le donne in stato di
gravidanza o con potenziale gravidico (GdR 1B); l’analisi molecolare del gene RHD è altresì suggerita in
LI
caso di discrepanza nei pazienti sottoposti a regime trasfusionale cronico, pazienti affetti da anemie
emolitiche autoimmuni, pazienti che presentano un alloanticorpo anti-D pur se classificati come RhD
N
positivi, pazienti pediatrici o in età giovanile (<30 anni).
O

Si raccomanda di definire in biologia molecolare le sospette varianti individuate con le tecniche


sierologiche relative agli antigeni RhD (D-partial, D-weak e DEL), RhC e Rhe. (GdR 1C)
O
ST
TE

31
4.3.3 Sistema KEL
È opportuno confermare in biologia molecolare i fenotipi rari definiti sierologicamente per assenza di un
antigene pubblico (es: Kpb- in soggetti Caucasici) o di più antigeni dello stesso sistema (es: Knull in soggetti
dell’Isola Reunion), o per i quali non sono disponibili antisieri specifici (es. Jsb- in soggetti Africani).

Si suggerisce di confermare in biologia molecolare i fenotipi rari per assenza di antigeni pubblici (Kpb,
Jsb) ed il fenotipo Knull.

4.3.4 Sistema FY
Il fenotipo Fy(a-b-) dovrebbe essere confermato in biologia molecolare per stabilire se è presente la
mutazione GATA nel sito promoter del gene FY*B, responsabile della mancata espressione dell’antigene
Fyb solo sulla membrana dei globuli rossi ma non delle cellule non eritroidi: la conferma della presenza
della mutazione GATA permette di trasfondere il paziente con globuli rossi Fyb positivi senza alcun rischio
di alloimmunizzazione eritrocitaria.

E
Si suggerisce di studiare con analisi molecolare gli individui con fenotipo Fy(a-b-) al fine di determinare la

N
presenza della mutazione GATA.

4.3.5 Sistema JK
LI
N
Si suggerisce di confermare in biologia molecolare le varianti deboli o parziali, in particolare quelle
dell’antigene Jka. Nei Polinesiani deve essere confermato il fenotipo molto raro Jk(a-b-).
O

Si suggerisce di eseguire la tipizzazione molecolare per la definizione di varianti deboli o parziali degli
O

antigeni del sistema JK.


ST

4.3.6 Sistema MNS


In considerazione del riscontro prevalente di varianti in popolazioni Africane ed Asiatiche, è indicato
eseguire in biologia molecolare la tipizzazione di:
TE

• fenotipi rari, U- e U+var (S-s-), causati rispettivamente dalla delezione del gene GYPB (GYPB*Null) o da
due differenti alleli GYPB (GYPB*P2 e GYPB*NY) che silenziano l’espressione dell’antigene S, nei
soggetti di origine Africana
• varianti Mia/Mur che possono indurre anticorpi clinicamente significativi in ambito trasfusionale e
materno-fetale, nei soggetti di origine Asiatica.

Si suggerisce di eseguire la tipizzazione molecolare per la definizione dei fenotipi rari U- e degli antigeni
Mia/Mur.

Si suggerisce (GdR 2B) di effettuare la caratterizzazione genomica almeno dei sistemi gruppo-ematici RH
(geni RHD e RHCE), KEL, FY, JK, MNS nei soggetti emoglobinopatici cronicamente trasfusi per garantire un
match antigenico esteso, con particolare riguardo alle varianti RH in pazienti di origine Africana.

32
4.3.7 Altri sistemi gruppo-ematici
Alcuni antigeni appartenenti ai sistemi Dombrock, Diego, Cartwright, Colton e Vel non possono essere
definiti con le metodiche sierologiche per la scarsa disponibilità di reagenti commerciali specifici ed è quindi
necessaria l’analisi molecolare in caso di sospetta immunizzazione verso tali antigeni.
Il fenotipo raro Lub- deve essere confermato in biologia molecolare, utilizzando anche tecniche di
sequenziamento.

Si raccomanda di definire in biologia molecolare gli antigeni minori (es: Do, Yt, Di, ecc.) per i quali non
esistono sieri commerciali specifici, in caso di sospetta immunizzazione verso tali antigeni.

Si raccomanda di confermare in biologia molecolare il fenotipo raro Lub-.

4.3.8 Sistemi HPA


4.3.8.1
La tipizzazione di singoli antigeni piastrinici può essere determinata con tecniche immunoenzimatiche o

E
citofluorimetriche, peraltro non disponibili presso tutti i laboratori di immunoematologia; la tipizzazione
estesa dei sistemi HPA può essere effettuata esclusivamente con tecniche molecolari.

N
4.3.8.2
LI
Le tipologie di pazienti in cui va presa in considerazione ed eventualmente suggerita l’analisi molecolare dei
N
sistemi HPA sono:
• donne in gravidanza con alloimmunizzazione HPA e storia pregressa di feti/neonati affetti da emorragia
O

cerebrale ed i loro partner


• feti di madri con alloimmunizzazione HPA e storia pregressa di feti/neonati affetti da emorragia
O

cerebrale, mediante metodo invasivo (villocentesi, amniocentesi) o non invasivo (DNA fetale libero nel
plasma materno), se il padre è eterozigote per l’antigene nei confronti del quale la madre presenta
ST

l’anticorpo
• pazienti che abbiano presentato porpora post trasfusionale
• pazienti con refrattarietà documentata alla trasfusione piastrinica e alloimmunizzati verso gli antigeni
TE

HPA.

Si suggerisce di avviare all’analisi molecolare dei sistemi HPA le seguenti tipologie di pazienti: donne in
gravidanza con alloimmunizzazione HPA e con storia pregressa di feti/neonati con emorragia cerebrale e
i loro partner, feti di donne nella suddetta condizione se il padre è eterozigote per l’antigene piastrinico
coinvolto, pazienti che abbiano presentato porpora post-trasfusionale, pazienti alloimmunizzati refrattari
alla trasfusione piastrinica.

La tipizzazione estesa degli antigeni piastrinici deve comprendere almeno i sistemi HPA-1, 3, 4, 5, 15, più
frequentemente implicati nell’alloimmunizzazione trasfusionale e materno-fetale.

Si raccomanda la determinazione in biologia molecolare almeno dei sistemi HPA-1, 3, 4, 5, 15, che sono
più frequentemente implicati nell’alloimmunizzazione trasfusionale e materno-fetale.

33
4.4 Diagnosi prenatale
In epoca prenatale le indagini molecolari sono in grado di predire il fenotipo eritrocitario e/o piastrinico del
nascituro e dei genitori e rappresentano uno strumento utile per la definizione del rischio di MEFN e PFNA
e per la gestione appropriata della gravidanza.

4.4.1 Indagini sui genitori


In caso di alloimmunizzazione materna anti-D dovrebbe essere effettuata con metodica molecolare la
definizione della zigosità RHD del padre, se rintracciabile.
Poiché sono descritte varianti nella Rhesus box downstream associate anche ad alleli RHD varianti (es. DAU,
DAR, DVI), la zigosità RHD deve essere eseguita con sistemi diagnostici che contengano due primer, in
particolare in individui di etnia non Caucasica, per evitare falsi negativi.

Nel caso sia definita la zigosità RHD paterna utilizzando tecniche molecolari, si raccomanda di utilizzare
test che consentano una corretta interpretazione del risultato anche in individui di etnia non Caucasica.

E
N
4.4.2 Indagini sul DNA fetale
A partire dal primo trimestre di età gestazionale (EG) è presente nel circolo ematico della gravida una
LI
piccola quota di DNA libero di origine fetale (cell-free fetal DNA, cffDNA), che può essere ottenuto dal
plasma materno ed utilizzato per predire il fenotipo Rh/K/HPA fetale.
N
Lo studio del genotipo fetale da DNA libero circolante ha sostituito altre fonti di DNA che necessitano di
O

procedure invasive, le quali possono mettere a rischio la gravidanza e causare alloimmunizzazione materna.

4.4.2.1
O

Le possibili applicazioni cliniche della determinazione non invasiva del genotipo fetale sono:
ST

• in gravide RhD negative non alloimmunizzate, per predire il fenotipo RhD fetale e somministrare in
modo appropriato l’IP antenatale (GdR 2B)
• in gravide alloimmunizzate verso antigeni dei sistemi RH, KEL, HPA con padre Rh/K/HPA eterozigote o
TE

non noto, per definire se il feto è a rischio di MEFN/PFNA e gestire in modo appropriato la gravidanza.
(GdR 1B)
Il laboratorio deve validare l’intero processo con particolare attenzione all’identificazione di tutte le fasi
critiche e definire l’intervallo massimo tra la raccolta del campione e la separazione del plasma, in
particolare se la metodica utilizzata è la NGS.
Un alto livello di automazione può migliorare la standardizzazione ed aumentare l’efficienza di estrazione
del DNA fetale e l’accuratezza del risultato.

Per le indagini sul DNA fetale si raccomanda di definire e validare l’intervallo massimo tra la raccolta del
campione e la separazione del plasma, in particolare se la metodica utilizzata è la NGS.

Per le indagini sul DNA fetale si raccomanda di utilizzare una metodica di estrazione di cffDNA,
possibilmente automatizzata, che abbia la migliore efficienza di estrazione del DNA fetale.

34
4.4.2.2
Per la tipizzazione dei geni RHD/K con metodica PCR-Real Time si raccomanda:
• l’utilizzo di primer specifici per gli esoni 5 e 7 del gene RHD e possibilmente per l’esone 10, per
identificare le possibili varianti presenti in una popolazione multietnica
• l’esecuzione del test almeno in duplicato
• l’inclusione di un controllo positivo ed un controllo negativo per gli alleli analizzati, estratti in parallelo
con i campioni, in particolare nella tipizzazione dell’antigene K
• l’utilizzo per ciascun campione testato di un controllo interno specifico per la presenza di DNA fetale o
almeno un controllo che confermi l'efficacia della fase di estrazione del cfDNA (cell-free DNA, cfDNA) e
l’assenza di inibizione della reazione di PCR; l’NGS non necessita di un controllo di presenza di DNA
fetale poiché analizza contemporaneamente più polimorfismi insieme al genotipo materno
• la ripetizione del test su un campione prelevato dopo quattro settimane, in caso di risultato negativo
ottenuto da un campione prelevato in età gestazionale precoce (<16a settimana di EG)
• il monitoraggio della percentuale di falsi negativi.

E
Per le indagini sul DNA fetale si raccomanda di:
• utilizzare primer specifici per gli esoni 5 e 7 del gene RHD e, possibilmente, anche per l’esone 10

N
• eseguire il test almeno in duplicato

LI
includere un controllo positivo ed un controllo negativo per gli alleli analizzati, estratti in parallelo
con i campioni
N
• includere controlli positivi specifici per DNA fetale o almeno controlli di estrazione e amplificazione
del cfDNA
O

• ripetere il test su un secondo campione prelevato dopo quattro settimane, in caso di risultato
negativo di un campione prelevato prima della 16a settimana di EG
O

• monitorare la percentuale di falsi negativi.


ST

4.4.2.3
Il laboratorio che utilizza la PCR-RT, ai fini di una corretta interpretazione del risultato, deve definire e
TE

documentare le azioni da intraprendere in caso di:


• contaminazione del controllo negativo
• ciclo soglia precoce o tardivo
• discordanza di risultato tra i diversi primer o tra i test eseguiti in duplicato nella stessa seduta
• sospetto di variante RhD materna.
A tale riguardo la tipizzazione RhD materna deve seguire le indicazioni riportate nelle Raccomandazioni per
la prevenzione ed il trattamento della Malattia Emolitica del Feto e del Neonato – SIMTI SIGO 2014 ed è
raccomandata la tipizzazione molecolare delle gravide con fenotipo RhD negativo C+ e/o E+.

Per le indagini sul DNA fetale si raccomanda di definire e documentare le azioni da intraprendere in
caso di: contaminazione del controllo negativo, ciclo soglia precoce o tardivo, discordanza di risultato
tra i primer, sospetto di variante RhD materna.

35
Si raccomanda di eseguire la tipizzazione RhD materna seguendo le indicazioni riportate nelle
Raccomandazioni per la prevenzione ed il trattamento della Malattia Emolitica del Feto e del Neonato
– SIMTI SIGO 2014 e di eseguire la tipizzazione molecolare delle gravide con fenotipo RhD negativo C+
e/o E+.

4.4.2.4
La conoscenza del genotipo HPA fetale consente di conoscere il rischio di PFNA in gravide alloimmunizzate
con partner eterozigote e di prevenire le più severe complicanze della PFNA, senza ricorrere allo studio
della zigosità paterna o a procedure invasive.
Il laboratorio deve adottare sistemi che garantiscano la sensibilità del metodo ed eliminino risultati falsi
positivi o non conclusivi causati da amplificazione aspecifica degli alleli HPA materni, consentendo la
corretta assegnazione del risultato.
Nel caso in cui l’analisi non mostri incompatibilità HPA tra madre e feto il test deve essere ripetuto su un
secondo campione prelevato almeno quattro settimane dopo.

E
Per le indagini sul DNA fetale si raccomanda di:

N
• adottare sistemi che garantiscano la sensibilità del metodo, escludano l’amplificazione aspecifica


LI
degli alleli HPA materni e consentano la corretta assegnazione del risultato
ripetere il test su un secondo campione prelevato dopo quattro settimane, nel caso in cui l’analisi
N
non mostri incompatibilità HPA tra madre e feto.
O

4.5 Bibliografia
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ST
TE

38
5. GESTIONE DEL RISULTATO

5.1 Generalità
La gestione del risultato dei test molecolari rappresenta un aspetto critico, poiché la conoscenza del
genotipo di un individuo può consentire di predire il fenotipo eritrocitario/piastrinico; tuttavia molto
spesso, a causa di meccanismi di regolazione genica (epigenetica), non esiste corrispondenza tra ciò che si
osserva a livello genetico e quanto espresso a livello biochimico. Pertanto il risultato di un test molecolare
in immunoematologia deve essere sempre confrontato ed integrato con il risultato di test sierologici.

5.2 Indicazioni
L’impiego esclusivo di tecniche sierologiche consente di definire il fenotipo di un individuo quando i risultati
di test effettuati su due diversi campioni diano lo stesso risultato, anche utilizzando lo stesso
metodo/antisiero.
Qualora invece sia necessario ricorrere ad indagini genomiche, il risultato dell’analisi molecolare (genotipo)
deve essere confermato, ai fini della definizione del fenotipo predetto, con un test sierologico o con un test
molecolare effettuato con diversa metodica. Inoltre deve essere tenuto un differente approccio nella

E
gestione del risultato, qualora si considerino test eseguiti su campioni di pazienti o di donatori/unità di

N
sangue.
LI
Si raccomanda di confermare il risultato dell’analisi molecolare con un test sierologico o con altra
N
metodica molecolare.
O

5.3 Attribuzione del fenotipo eritrocitario/piastrinico


L’attribuzione del fenotipo eritrocitario/piastrinico di un individuo deve essere effettuata sulla base di
O

risultati ottenuti e confermati mediante l’integrazione tra test sierologici (ove possibile per le piastrine) e/o
molecolari.
ST

5.3.1
Qualora i risultati dei test di tipizzazione utilizzati (prima determinazione e conferma) coincidano, l’antigene
TE

deve essere indicato come presente/assente.

5.3.2
Qualora i risultati dei test utilizzati non siano confermati devono essere impiegate indagini di
approfondimento per la risoluzione della discrepanza e, nell’attesa, l’attribuzione del fenotipo deve essere
cautelativamente antigene positiva nel caso di donatori e neonati e antigene negativa nel caso di
riceventi/gravide/donne con potenziale gravidico.

5.3.3
Nel caso di etichettatura di un’unità di sangue per la quale persistano dubbi sull’attribuzione del fenotipo,
l’antigene interessato non può essere riportato sull’etichetta, e deve essere lasciata traccia nel sistema
gestionale, nella storia del donatore e dell’unità, della possibile presenza dell’antigene oggetto di
discrepanza, per un successivo controllo.

39
Si raccomanda, in attesa di risoluzione di una discrepanza di tipizzazione, di gestire il risultato, in via
cautelativa, come antigene negativo se trattasi di ricevente o di donna in gravidanza/con potenziale
gravidico, e come antigene positivo se trattasi di donatore.

Si raccomanda, in caso di dubbi sull’attribuzione del fenotipo di un’unità, di non riportare l’antigene
sull’etichetta e di lasciare l’informazione della possibile presenza dell’antigene nel gestionale, sia nella
storia del donatore sia dell’unità.

5.4 Gestione del risultato in caso di discrepanza


Le cause di una discrepanza possono essere limiti metodologici per differente sensibilità dei reagenti
utilizzati (ad esempio metodi sierologici incapaci di evidenziare varianti antigeniche deboli/parziali) e/o
varianti alleliche anche nuove che possono o meno tradursi in varianti antigeniche.

5.4.1

E
Il primo passo per la risoluzione della discrepanza prevede di ripetere i test su un campione differente da
quelli utilizzati in precedenza e di raccogliere un’attenta anamnesi immunoematologica, ostetrica,

N
trasfusionale e trapiantologica.

5.4.2
LI
N
I campioni con risultati ancora discrepanti devono essere ripetuti in sierologia con metodo/reagente
alternativo (in fase liquida, in micropiastra, in microcolonna) o con metodiche di secondo livello (ad
O

esempio assorbimento/eluizione).
O

5.4.3
I campioni la cui discrepanza non venga risolta in sierologia, devono essere avviati alla tipizzazione
ST

molecolare.

5.4.4
TE

I campioni la cui tipizzazione molecolare sia discordante da quella sierologica, devono essere confermati
con altra tecnologia molecolare o avviati ad approfondimento mediante sequenziamento.

Si raccomanda, nei casi di discrepanza tra tipizzazione sierologica e molecolare, di confermare il risultato
con altra tecnologia molecolare o mediante sequenziamento.

5.5 Discrepanze nel sistema ABO


La corretta definizione del fenotipo ABO ha importanti implicazioni trasfusionali, ostetriche e
trapiantologiche. In considerazione anche dei limiti dei kit del commercio, nel percorso di attribuzione del
fenotipo eritrocitario ABO deve essere eseguita l’indagine sierologica di assorbimento/eluizione prima di
ricorrere alle indagini molecolari.

40
5.5.1
Nel caso in cui le procedure di assorbimento/eluizione abbiano dimostrato la presenza di sostanza gruppo-
specifica A/B, deve essere attribuito il fenotipo debole sulla base dei risultati integrati dei test sierologici e
molecolari. Quando non sia possibile risolvere la discrepanza, deve essere attribuito cautelativamente il
fenotipo antigene positivo se trattasi di donatore e antigene negativo se trattasi di ricevente.

Nella gestione delle discrepanze del sistema ABO si raccomanda di:


• eseguire l’indagine sierologica di assorbimento/eluizione prima delle indagini molecolari
• attribuire un fenotipo debole se è dimostrata la presenza di sostanza gruppo-specifica A/B
• attribuire in via cautelativa il fenotipo antigene positivo se trattasi di donatore e antigene negativo se
trattasi di ricevente.

5.6 Discrepanze nel sistema RH


A causa delle importanti implicazioni cliniche e dei conseguenti risvolti medico-legali in determinate
categorie (donne con potenziale gravidico), le discrepanze nell’attribuzione del fenotipo Rh necessitano

E
direttamente dell’analisi molecolare del gene RHD, in quanto essa è in grado di risolvere la maggior parte

N
delle discrepanze sierologiche.

5.6.1
LI
Qualora non si disponga di un laboratorio di riferimento per i test molecolari o non sia possibile ottenere i
N
risultati in tempo utile, il fenotipo Rh deve essere attribuito in base alla categoria del soggetto considerato
O

(donatore, ricevente, donna in stato di gravidanza/con potenziale gravidico o neonato), descrivendo nel
gestionale la particolarità della condizione osservata e adottando un atteggiamento di tipo cautelativo (vedi
paragrafo 5.3.2).
O
ST

5.6.2
Nel sospetto, anche se non confermato dai test di approfondimento, della presenza di una variante Rh, il
fenotipo RhD deve essere considerato negativo se trattasi di ricevente o di donna in stato di gravidanza/con
TE

potenziale gravidico e RhD positivo se trattasi di neonato o di donatore (riportando di conseguenza questa
caratteristica sull’etichetta degli emocomponenti prodotti).

Nella gestione delle discrepanze del sistema Rh si raccomanda di:


• eseguire l’analisi molecolare del gene RHD
• attribuire in via cautelativa, in attesa della conferma, il fenotipo antigene positivo se trattasi di
donatore e antigene negativo se trattasi di ricevente o di donna in stato di gravidanza/con potenziale
gravidico.

41
5.7 Bibliografia
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transfusion therapy for sickle cell anemia. Transfusion 2017; 57: 2738-2746.

42
6. QUALITÀ

6.1 Generalità
I laboratori di immunoematologia che si accingono ad implementare e ad offrire indagini di
immunoematologia molecolare devono sviluppare, mantenere e documentare un sistema di qualità basato
sui requisiti della Direttiva Europea 1214/2016 ed avere procedure convalidate che assicurino il controllo
dell’intero processo analitico e la qualità del prodotto/servizio offerto.

6.2 Indicazioni
L’utilizzo di metodiche di immunoematologia molecolare richiede che il laboratorio preveda la convalida del
metodo diagnostico utilizzato al fine di garantire precisione, ripetibilità e accuratezza dei risultati forniti.

6.2.1
Il laboratorio di immunoematologia molecolare deve convalidare il nuovo metodo analizzando un numero
di campioni che comprendano, se possibile, alleli in omozigosi ed in eterozigosi. Si raccomanda di testare
un numero di campioni sufficiente a garantire la significatività statistica dei risultati ottenuti (comunque

E
non inferiore a venti campioni).

N
6.2.2 LI
Le prove di convalida devono valutare la precisione del metodo, mediante test di ripetibilità e
riproducibilità, e la sua accuratezza, in termini di sensibilità e specificità, mediante la valutazione della
N
concordanza dei risultati ottenuti su campioni precedentemente testi con altro metodo o ottenuti da un
O

altro Laboratorio qualificato.

6.2.3
O

Il laboratorio di immunoematologia molecolare deve stabilire la durata dello stato di convalida mediante il
ST

monitoraggio del processo analitico con l’uso di appropriati controlli interni. Ogni seduta analitica deve
comprendere almeno un controllo negativo (H2O) ed un controllo positivo. Ad ogni cambio di lotto devono
essere valutati i controlli al fine del rilascio dei reagenti utilizzati prima del loro utilizzo in routine.
TE

L’evidenza di risultati non conformi deve indirizzare il laboratorio nella definizione della durata dello stato
di convalida che deve essere comunque valutato e attestato con cadenza annuale. Nella definizione dello
stato di convalida dei metodi analitici devono essere utilizzati i dati provenienti dagli esercizi di valutazione
esterna di qualità.

6.2.4
La qualità analitica offerta dal Laboratorio di Immunoematologia molecolare deve essere valutata
periodicamente mediante la regolare partecipazione ad un programma di VEQ sufficientemente
rappresentativo per numerosità di campioni e strutture partecipanti che garantisca l’invio di almeno due
esercizi all’anno.

6.2.5
Tutti i materiali/reagenti utilizzati per le indagini di immunoematologia molecolare devono essere
sottoposti a verifica in seguito a prima fornitura e/o a cambio di lotto e rilasciati a seguito del superamento
delle prove di conformità effettuate e precedentemente definite (integrità e funzionalità dei kit diagnostici
tramite ispezione visiva e validità dei controlli di qualità).

43
6.2.6
Il laboratorio di immunoematologia molecolare deve preparare e conservare, la documentazione delle
prove eseguite, delle procedure operative che descrivano dettagliatamente le metodiche introdotte e tutte
le registrazioni applicabili per il tempo previsto dalla normativa vigente.

6.2.7
Il personale che opera nei laboratori di immunoematologia molecolare deve essere formato e competente
nell’utilizzo delle metodiche in uso e nell’interpretazione dei risultati. Ogni laboratorio deve definire per
ogni metodica utilizzata un numero minimo di test da eseguire per l’addestramento del personale e
pianificare un programma di formazione continua (ad esempio la partecipazione ad almeno un evento
formativo/anno), al fine del mantenimento delle competenze acquisite. Le registrazioni delle attività di
addestramento, di formazione e le valutazioni sul mantenimento delle competenze acquisite devono
essere conservate secondo quanto previsto dalla normativa vigente.

6.2.8
La competenza di tutto il personale coinvolto deve essere valutata per ciascun operatore almeno due volte

E
all’anno tramite l’esecuzione di almeno due procedure analitiche per ogni metodica utilizzata e la

N
partecipazione ad almeno un esercizio di VEQ all’anno.
LI
Si raccomanda di convalidare il metodo diagnostico molecolare prima della sua introduzione, mediante
l’esecuzione di prove di precisione ed accuratezza su almeno venti campioni, mediante la valutazione
N
della concordanza con i risultati ottenuti con altro metodo.
O

Si raccomanda di utilizzare per ogni seduta analitica un controllo negativo ed un controllo positivo noto,
ove possibile, e di partecipare ad un programma di VEQ almeno due volte/anno, per garantire la qualità
O

analitica.
ST

Si raccomanda di definire un programma di formazione del personale che opera nel laboratorio di
immunoematologia molecolare, di valutare il mantenimento delle competenze e di conservarne
TE

documentazione.

44
6.3 Bibliografia
1. Appendices to the guidelines on validation and qualification, including change control, for hospital
transfusion laboratories. BCSH 2010.
2. CNS – Guida alle attività di convalida dei processi nei Servizi Trasfusionali e nelle Unità di Raccolta del
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3. DIRETTIVA (UE) 2016/1214 DELLA COMMISSIONE del 25 luglio 2016 recante modifica della direttiva
2005/62/CE per quanto riguarda le norme e le specifiche del sistema di qualità per i servizi trasfusionali.
4. D.Lgs N. 208 del 09.11.2007 attuazione della Direttiva 2005/62/CE che applica la DE 2002/98/CE per
quanto riguarda le norme e le specifiche comunitarie relative a un sistema qualità dei servizi
trasfusionali.
5. EDQM Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components, Appendix to
Recommendation No. R (95) - 19th Edition (2017).
6. Guidelines for Validation & Quantification, Including Change Control, for Hospital Transfusion
Laboratories- BCSH 2010.

E
N
LI
N
O
O
ST
TE

45
7. CONSENSO E REFERTO

7.1 Consenso informato


7.1.1 Premessa
Gli artt. 23 e 26 del Codice in materia di protezione dei dati personali prevedono che il trattamento dei dati
genetici e l’utilizzo dei campioni biologici avvenga soltanto per gli scopi indicati nella “Autorizzazione
generale al trattamento dei dati genetici n.8/2016 del 15 dicembre 2016 “ (G.U. .303 del 29/12/2016)” e
rispetto ai quali la persona abbia manifestato precedentemente e per iscritto il proprio consenso
informato.
La suddetta Autorizzazione ha efficacia dal 1° gennaio 2017 fino al 24 maggio 2018: infatti dal 25 maggio
2018 sarà applicabile il Regolamento (UE) 2016/679 (relativo alla protezione delle persone fisiche con
riguardo al trattamento dei dati personali, nonché alla libera circolazione di tali dati), che abroga la direttiva
95/46/CE, salve le modifiche che il Garante ritenga di dover apportare in conseguenza di eventuali novità
normative rilevanti in materia, e ferme restando le determinazioni adottate dall'Autorità in applicazione del
Regolamento citato.

E
7.1.2 Il consenso nelle indagini di immunoematologia molecolare

N
L’analisi genomica dei sistemi gruppo-ematici è considerata oggi una modalità di tipizzazione alternativa a
quella sierologica e, pur se non citata in nessuna normativa specifica, fornisce risultati che possono essere
LI
assimilati alla definizione di “dato genetico”, così come riportato dalla suddetta Autorizzazione: “il risultato
di test genetici o di altra informazione che, indipendentemente dalla tipologia, identifica le caratteristiche
N
genotipiche di un individuo, trasmissibili nell’ambito di un gruppo di persone legate da vincoli di parentela.”
O

Le procedure molecolari prevedono l’estrazione del DNA e la conservazione dello stesso, e ciò rende
particolarmente delicata la questione in merito alla necessità del rilascio del consenso informato da parte
del soggetto da sottoporre alle suddette procedure diagnostiche.
O

Se la conservazione del materiale genetico solleva questioni di carattere etico, c’è tuttavia consenso nel
ST

ritenere indispensabile ottenere l’autorizzazione formale da parte del soggetto coinvolto.

7.1.3 Donatori
TE

Nel caso di effettuazione di test immunoematologici in biologia molecolare la Struttura Trasfusionale deve
attenersi a quanto previsto dall’Art. 8 del DM 02/11/2015, il quale indica che “… i servizi trasfusionali e le
unità di raccolta prevedono la raccolta di un autonomo e specifico consenso del donatore e, a tal fine,
predispongono una informativa circostanziata che illustri gli elementi caratterizzanti i trattamenti di dati
personali, i soggetti destinatari del trasferimento del materiale donato e l’ambito di comunicazione dei dati.
Ove gli studi e le ricerche comportino il trattamento di dati genetici l’informativa deve essere conforme ai
Provvedimenti del Garante relativi alla autorizzazione generale al trattamento dei dati genetici”.
In caso di effettuazione di analisi molecolari legate alla validazione biologica, al fine di ottimizzare i tempi
necessari per il rilascio dell’unità donata, si suggerisce di integrare il modulo di consenso al trattamento dei
dati sensibili, già in uso all’atto della donazione, con un paragrafo dedicato alla “richiesta di specifico
consenso:
• all’effettuazione di test genomici
• alla successiva conservazione, in forma anonima, del materiale genetico (DNA)
• all’utilizzo del materiale genetico per la ripetizione della stessa tipologia di test, per il controllo di
qualità del laboratorio, per la convalida di nuove piattaforme diagnostiche, o per finalità di ricerca
scientifica o statistica

46
• all’impiego dei dati clinici, in forma anonima, anche per finalità di ricerca clinica, epidemiologica, di
studio di patologie e di formazione, con l’obiettivo di migliorare le conoscenze, le cure, la prevenzione.”

7.1.4 Pazienti
Il consenso al trattamento dei dati sensibili è richiesto per obbligo di legge a tutti i pazienti in occasione di
una prestazione ambulatoriale o di un ricovero. Qualora si renda necessaria l’esecuzione di un’indagine
genomica, anche in urgenza, si suggerisce di integrare il consenso generico al trattamento dei dati sensibili
già in uso con un paragrafo dedicato alla “richiesta di specifico consenso:
• all’effettuazione di test genomici
• alla successiva conservazione, in forma anonima, del materiale genetico (DNA)
• all’utilizzo del materiale genetico per la ripetizione della stessa tipologia di test, per il controllo di
qualità del laboratorio, per la convalida di nuove piattaforme diagnostiche, o per finalità di ricerca
scientifica o statistica
• all’impiego dei dati clinici, in forma anonima, anche per finalità di ricerca clinica, epidemiologica, di
studio di patologie e di formazione, con l’obiettivo di migliorare le conoscenze, le cure, la prevenzione.

E
Si raccomanda di ottenere il consenso informato scritto del donatore e del paziente in tutti i casi si renda

N
necessaria l’effettuazione di test (sierologici e/o molecolari) che forniscano dati genetici.
LI
N
Si raccomanda di ottenere il consenso informato scritto del donatore e del paziente in tutti i casi si
preveda di conservare il materiale genetico (DNA), in forma anonima, dopo l’effettuazione dei test per
O

cui era stato estratto, esplicitando le possibili motivazioni di un successivo utilizzo.


O

7.2 Referto
7.2.1 Generalità
ST

Il Laboratorio deve definire procedure documentate che comprendano la definizione di responsabilità


specifiche per la validazione, l’interpretazione e la refertazione dei test molecolari nonché la consegna dei
referti, la conservazione del materiale genetico e di tutta la documentazione prodotta.
TE

Tutti i test molecolari devono essere validati da due operatori qualificati, uno dei quali deve essere il
Responsabile del Laboratorio o un suo Delegato.

7.2.2
La seduta analitica deve essere validata dall’operatore che ha effettuato i test, dopo aver valutato la
conformità dei controlli previsti dalla metodica in uso.

7.2.3
La supervisione dei risultati validati dal primo operatore deve essere effettuata, prima del rilascio del
referto, da parte del Responsabile del Laboratorio (o di un suo Delegato) che, in caso di ambiguità
analitiche, deve valutare se avviare la ripetizione del test o procedere con un approfondimento diagnostico.

7.2.4
Il Responsabile del Laboratorio (o un suo Delegato) deve elaborare il referto integrando i risultati dei test
sierologici e molecolari. In caso di discrepanze tra i metodi analitici, per la loro risoluzione deve applicare gli
specifici algoritmi diagnostici precedentemente definiti. (vedi Capitolo 5)
47
7.2.5
Se le tecniche di sequenziamento genico identificano un allele non noto, il Responsabile del Laboratorio (o
un suo Delegato) deve richiedere all’ISBT di classificare la nuova variante.

7.2.6
I referti devono contenere tutte le seguenti informazioni:
• intestazione del Laboratorio e Struttura di appartenenza
• nome, cognome e data di nascita del donatore o paziente, con eventuale codice identificativo
• provenienza
• data del prelievo
• tipologia di test effettuato e metodo diagnostico utilizzato
• risultato del test espresso come genotipo (o allele in caso di variante) e fenotipo predetto secondo
la terminologia ISBT (vedi paragrafo 7.2.7)
• conclusioni diagnostico-cliniche
• data del referto

E
• firma del responsabile del referto.

N
7.2.7
LI
Nel referto devono essere riportati il genotipo ed il fenotipo predetto secondo la terminologia ISBT, come
indicato nel seguente esempio per il sistema Duffy (FY):
N
Genotipo Fenotipo predetto
O

FY*A/FY*B oppure FY*01/FY*02 Fy(a+b+)


O

Nella refertazione del genotipo RHD devono essere riportati l’allele ed il fenotipo predetto secondo la
ST

terminologia ISBT, come indicato nel seguente esempio:

Allele (zigosità RHD non determinata) Fenotipo predetto


TE

RHD*01 D positivo
RHD*01W.01 oppure RHD*weak type 1 D weak tipo 1

La determinazione della zigosità RHD è richiesta soltanto in casi selezionati.

7.2.8
La consegna dei referti deve avvenire esclusivamente con una delle seguenti modalità:
• in busta chiusa per posta ordinaria o direttamente al richiedente o suo delegato
• via e-mail con posta elettronica certificata (PEC)

7.2.9
Il Laboratorio deve conservare il materiale genetico:
• secondo le modalità operative riportate nel paragrafo 2.5.1
• secondo le disposizioni vigenti per donatori e pazienti in tema di privacy (vedi paragrafo 7.1)

48
7.2.10
Il Laboratorio deve conservare tutta la documentazione prodotta secondo la normativa vigente.

Si raccomanda di definire le procedure e le responsabilità per la validazione, l’interpretazione e la


refertazione dei test molecolari nonché la consegna dei referti, la conservazione del materiale genetico
e di tutta la documentazione prodotta.

Si raccomanda di effettuare la doppia validazione dei test da parte di due operatori qualificati, uno dei
quali deve essere il Responsabile del Laboratorio (o un suo Delegato), il quale deve supervisionare i
risultati prima del rilascio del referto.

Si raccomanda di richiedere all’ISBT la classificazione di una variante allelica non nota, identificata con
tecniche di sequenziamento.

E
Si raccomanda di riportare nel referto tutte le informazioni relative a: intestazione del Laboratorio, dati

N
anagrafici del donatore o paziente, tipologia di test e metodo utilizzati, risultato espresso come genotipo
(o allele in caso di variante) e fenotipo predetto, conclusioni diagnostico-cliniche, data e firma del
LI
Responsabile del referto.
N
Si raccomanda di consegnare il referto con una delle seguenti modalità: in busta chiusa o via e-mail con
O

PEC.
O

Si raccomanda di conservare il materiale genetico secondo le disposizioni vigenti in tema di privacy.


ST

Si raccomanda di conservare tutta la documentazione prodotta secondo la normativa vigente.


TE

7.3 Bibliografia
1. Sandler SG, Chen LN, Flegel WA. Serological weak D phenotypes: a review and guidance for interpreting
the RhD blood type using the RHD genotype. Br J Haematol. 2017; 179 :10-19.
2. Autorizzazione n.8/2016 ”Autorizzazione generale al trattamento dei dati genetici-15 dicembre 2016“
(G.U. .303 del 29/12/2016).
3. Regolamento UE 2016/679 relativo alla protezione delle persone fisiche con riguardo al trattamento dei
dati personali, nonché alla libera circolazione di tali dati. 25 maggio 2018.
4. DECRETO 2 novembre 2015. Disposizioni relative ai requisiti di qualità e sicurezza del sangue e degli
emocomponenti. Gazzetta Ufficiale n. 300 del 28 dicembre 2015.

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E
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N
O
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ST
TE

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Nessuna parte (testi, tabelle, figure) di questo volume può essere riprodotta o fotocopiata senza
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