Guía Práctica de Laboratorio Microbiología Ambiental

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Los estudiantes deben consultar por su cuenta propia y basada en

las referencias bibliográficas entregadas en el curso la información
necesaria para las siguientes prácticas. El tutor práctico guiará y
despejará las dudas a los estudiantes en el laboratorio

Practica 1- Bioseguridad en el laboratorio

Los laboratorios de microbiología están regidos por normas de seguridad

e higiene que deben cumplirse a cabalidad para garantizar la protección
contra infecciones de los estudiantes u otro personal que labora en estas
instalaciones, así como garantizar la calidad de las técnicas y la
confiabilidad de los resultados.

Los estudiantes deberán identificar las normas de bioseguridad en el

laboratorio una vez ingresen al mismo.

El tutor práctico dará una breve explicación sobre las normas con las
que cuentan en el laboratorio donde se esté desarrollando la práctica.

Referencias bibliográficas
BENSON, HAROLD J. Microbiological applications: Laboratory Manual in
General
Microbiology. McGraw – Hill. U.S.A. 1998.
COLLINS, C. H. and M LYNE, PATRICIA. Traducción del inglés por José
María Tarazona
Vilas. Métodos microbiológicos. Editorial ACRIBIA, S. A. ZARAGOZA
(España). 1989.
OMS – Organización Mundial de la Salud. Manual de bioseguridad en el
laboratorio.
Ginebra. 2005.

Importante: los estudiantes deben leer y cumplir las normas de

laboratorio, el incumplimiento de las mismas acarreará la
sanción de la nota práctica.

Práctica no. 2
Reconocimiento del laboratorio y materiales de Microbiología

Realizar una descripción de los materiales que utilizarán en la práctica,

esto incluye equipos y materiales de vidrio. Realizar un boceto de cada
uno y una breve descripción. Dicha charla debe ser dada por el tutor
práctico.

Práctica no 3 métodos de siembra –parte A

La inoculación de medios de cultivo para la recuperación, mantenimiento
y/o aislamiento de microorganismos, es un procedimiento fundamental e
importante. Debe tenerse cuidado con las técnicas de siembra
microbiana para evitar en lo posible la contaminación por otros
microorganismos diferentes al deseado.
Materiales
1. Microorganismos previamente aislados (Bacterias y hongos)
2. Agar nutritivo en caja de Petri
3. Agar PDA
4. Asa redonda
5. Gradilla
6. Mechero
7. Incubadora
8. Vinipel
9. Marcador de vidrio
Procedimiento
1. Desinfectar el área de trabajo, prender el mechero y preparar el
material de trabajo.
2. Abrir la caja de Petri y seguir el esquema para el aislamiento para el
caso de bacterias.

3. Para el caso de Hongos tomar con el asa recta el microorganismo y

por punción sembrar en la caja de Petri con medio PDA.
4. Incubar a 37° por 24 horas para bacterias y a 25° por 8 días para
hongos.
5. Terminado la siembra, marcar las cajas en el borde de la base de la
caja y envolverla en papel vinipel.
6. Desinfectar el área de trabajo, apagar el mechero y entregar el
material

Métodos de siembra –parte b ( recuentos de ufc y diluciones)

En esta etapa los estudiantes utilizarán una de las técnicas de siembra

más usadas en laboratorio, que permite el recuento de microorganismos
en una muestra como aguas, suelos etc. La técnica a realizar en este
punto hace referencia a los recuentos de microorganismos utilizando
diluciones seriadas en base 10, donde se dispersa la población de
microorganismos permitiendo conocer el número aproximado en una
muestra.

Materiales

1. Muestra de suelo o agua residual.

2. Frascos con solución salina 0.85% o agua peptonada al 0.1% (90
ml)
3. Tubos tapa rosca con 9 ml de solución salina o agua peptonada al
0.1% (6 tubos)
4. Cajas de Petri con agar Nutritivo, Chromocult o King B.( 6 cajas)
5. Pipetas de vidrio o pipeta automática. ( 100 microlitros y 1000
microlitros)
6. Rastrillos.

Procedimiento

1. Pesar 10 gramos de la muestra, mezclarla con los 90 ml de

solución salina o agua peptonada.
2. Realizar diluciones seriadas desde 10-1 hasta 10-6
3. Tomar las 6 cajas de Petri con agar y marcar 2 con dilución 10 2, 2
cajas con dilución 104, 2 cajas con dilución 106
 4. Sembrar por duplicado las diluciones 10-2 10-4 10-6 tomando 0,1
ml de cada dilución por superficie, con ayuda del rastrillo
homogenizar la microgota sobre la superficie del agar sin
romperlo.
5. Incubar por 24 horas a 37°C y realizar el recuento.
6. Realizar los cálculos donde se toman las diluciones donde se
encuentren entre 30 y 300 colonias para realizar el recuento,
sacar promedio y aplicar la formula: Número de colonias x Factor
de dilución x 10 (factor de corrección) El resultado es informado
en UFC ( unidades formadoras de colonia)/ g o ml de la muestra.

Practica 4. Técnicas de tinción

Parte A Tinción de Gram para bacterias.

Para poder observar al microscopio los distintos tipos de

microorganismos existen distintos tipos de coloraciones o tinciones que
tienen afinidad con ciertas partes de la célula y permite diferenciarlas y
observar algunos órganos de las células. Para el caso de bacterias la
técnica más usada es la tinción de Gram, donde se permite clasificar las
bacterias en Grampositivas ( violetas) y Gramnegativas ( Fucsias).

Materiales

1. Muestras de Microorganismos, ( practica aislamiento)

2. Colorantes para tinción de Gram (Cristal violeta, lugol. Alcohol
acetona, Fucsina de Gram)
3. Aceite de inmersión
4. Microscópio.
5. Asas redondas

Procedimiento

1. Tomar las colonias de bacterias que los estudiantes sembraron

anteriormente (técnicas de aislamiento) y realizar un frotis en una
 lámina portaobjetos, colocando una gota de agua y con ayuda del
asa redonda homogenizar para expandir el frotis en la lámina.

2. Dejar secar al aire libre la muestra, una vez se encuentre seca,

fijar al calor la muestra en el mechero (se coloca 3 veces
rápidamente sobre el fuego la lámina)
3. Una vez se encuentra la muestra fijada se procede a colocarle
varias gotas de cristal violeta, dejando por un minuto y luego
lavar en el grifo (solo para quitar el exceso de colorante.
4. Colocar unas gotas de lugol, dejar por un minuto y lavar.
5. Colocar una gota de alcohol acetona, dejar por 15 minutos, lavar.
6. Colocar unas gotas de Fucsina de Gram, dejar por un minuto,
lavar y dejar secar la muestra.
7. Una vez se encuentra seca la muestra agregar una gota de aceite
de inmersión y observar en el microscópio en el objetivo de 100x.
8. Observar las morfologías (bacilos, cocos, Grampositivos,
Gramnegativos)

Parte B Tinción de Azul de Lactofenol para hongos.

Para ver la morfología de los hongos filamentosos se utiliza la tinción de

azul de lactofenol, la cual permite contrastar y ver las diferentes partes
de un hongo (hifa, conidios, septos, etc)

Materiales

1. Muestras de Microorganismos, (practica aislamiento)

2. Azul de lactofenol.
3. Microscópio
4. Cinta transparente.
5. Asas rectas o agujas de disección.
6. Láminas y laminillas.

Procedimiento

1. Tome con una cinta o con las agujas de disección un trozo del
hongo ( tomar micelio, parte algodonosa)
 2. En una lámina portaobjetos colocar una gota de azul de lactofenol.

3. Si tomó la muestra con aguja de disección, ponerla en contacto

sobre la gota e ir desglosando las hifas, colocarle una lámina
portaobjetos, si utilizó la cinta transparente sólo debe colocarla
sobre la gota sin necesidad de laminilla cubreobjetos.
4. Llevar al microscópio y observar en el objetivo de 40x.
5. Observar las estructuras y anotarlas para el informe.

Práctica 5 algunas técnicas aplicadas en microbiología

ambiental.

La microbiología enfocada en la parte ambiental ha permitido

diagnosticar e implementar nuevas alternativas para el desarrollo
agrícola, en el ámbito de la ingeniería ambiental y la industria.

Con los conocimientos adquiridos en el curso y teniendo un

conocimiento básico de la microbiología, los estudiantes realizaran las
siguientes pruebas que actualmente se utilizan a nivel mundial y
específicamente en el país.

Indicadores de contaminación de aguas potables

Los indicadores de contaminación son utilizados para medir el grado de
contaminación o afectación de cuerpos de agua, agua de consumo etc,
en Colombia para el caso de aguas potables la normatividad exige un
valor de 0 unidades formadoras de colonia en 100 ml de agua
muestreada para el caso de coliformes totales como indicador.
Para esta prueba si el laboratorio de su CEAD, UDR, CERES no tiene los
elementos necesarios para realizarla, deberán consultar cual es la
normativa vigente y qué otros indicadores (microorganismos) se utilizan
en el ámbito de contaminación de aguas.

Materiales

1. Equipo de filtración por membrana (equipo millipore de

plástico)
2. Membrana de nitrocelulosa de 0.45 micrometros para
filtración.
3. Jeringa (para hacer vacío)
4. Cajas de Petri con agar Chromocult para coliformes.

Procedimiento

1. Tomar 100 ml de agua de la llave, la cual se inoculará con

una asada de cultivo de E. coli, agitar muy bien.
2. Colocar la muestra en la parte superior de la campana de
filtración y con la ayuda de la jeringa realizar el vacío para
permitir el paso del agua de un lado al otro.
3. Con unas pinzas estériles retirar la membrana y colocarla
sobre el agar Chromocult, la parte de la cuadrícula debe ir
mirando hacia arriba.
4. Incubar por 24 horas a 37° c y observar el número de
colonias con las características típicas de E. coli y coliformes
totales (consultar la coloración en este medio, se encuentra
por internet)

Nota: si no cuentan con los materiales deben consultar la

normatividad y cómo se informan los resultados, deben realizar
los dibujos correspondientes a la actividad.

El informe de laboratorio será entregado al tutor práctico, el

tutor práctico realizará la evaluación correspondiente a la
práctica, él será el encargado de evaluar y entregar los puntos
correspondientes en el aplicativo oil.
El documento debe tener la estructura básica de un informe de
laboratorio, una breve introducción sobre la práctica, el
procedimiento realizado, las fotografías o bocetos de lo
observado, conclusiones y referencias bibliográficas con normas
APA. No debe exceder el número de 8 páginas, la forma de
entrega deben coordinarla con el tutor práctico.

¡Muchos éxitos!!!!