SEMINARIO UNIDAD 2

Temario teorico: Estructura y propiedades del ADN. Estados de la cromatina. Papel de las histonas. Estructura de
los genes procarióticos y eucarióticos. Intrones y exones. Expresión de los genes. Genomas de organelas
eucarióticas: el ADN de mitocondrias y cloroplastos.
Temario práctico: Mapas de restricción. EMSA. SW, NW. Knockout. RT-PCR y qPCR.
Bibliografía complementaria: HarveyLodish-ArnoldBerk Biología Celular y Molecular -Ed. Médica Panamericana
(2005) en español. Versiones posteriores en inglés. Capitulo 9 Tecnicas de genética Molecular y Genomica. Capitulo
10 Estructura molecular de genes y cromosomas. Capitulo 11 Control transcripcional de la expresión génica.
Capitulo 12 Control génico postranscripcional y transporte nuclear.

Actividades previas:

1- ¿Qué es una enzima de restricción? ¿Que tipo de secuencias reconocen y como realizan el corte (que tipo de
extremos generan?) ¿Conoce alguna razón por la cual una secuencia de DNA que posea el sitio de reconocimiento
para una determinada enzima sea resistente a la digestión por la misma? Enumere todas las posibles causas que se
le ocurran, desde las mas teóricas hasta las relacionadas con inconvenientes practicos. En su respuesta puede
incluir ejemplos tanto de DNA plasmidico como genómico.
Puede usar los siguientes videos como ayuda
https://www.youtube.com/watch?v=6U8bGOG9OAI
https://www.youtube.com/watch?v=5hgbcdQPISI
https://www.youtube.com/watch?v=fY2lqgsaIA4
https://www.youtube.com/watch?v=DCxl1GlIkzI

2- Ingrese en el siguiente sitio web https://www.dnalc.org/resources/3d/

y visualice los videos
https://www.dnalc.org/resources/3d/09-how-much-dna-codes-for-protein.html
https://www.dnalc.org/resources/3d/07-how-dna-is-packaged-basic.html
https://www.dnalc.org/resources/3d/08-how-dna-is-packaged-advanced.html
https://www.dnalc.org/resources/3d/12-transcription-basic.html
https://www.dnalc.org/resources/3d/13-transcription-advanced.html
https://www.dnalc.org/resources/3d/24-mrna-splicing.html
https://www.dnalc.org/resources/3d/rna-splicing.html
https://www.dnalc.org/resources/animations/rna-splicing.html

3- Las micrografías a continuación corresponden a una organela celular. Figura A: micrografía electrónica de
transmisión. Figura B: técnica de criofractura.
¿De que organela se trata?
Complete las flechas con los nombres correspondientes.

4- Una célula humana promedio contiene casi 6.000 millones de pares de bases de DNA divididas entre 46
cromosomas. Cada cromosoma contiene una sola molécula continua de DNA.
a- Teniendo en cuenta que cada par de bases ocupa casi 0.34 nm de longitud, indique cuál es la longitud total DNA
presente en una célula humana
b- Teniendo en cuenta que el núcleo tiene 10 μm de diámetro. ¿Cómo es que cabe dentro del mismo?
d- Explique y esquematice cómo es la estructura de la cromatina interfásica y cuál la del cromosoma mitótico?
Represente como vería un nucleo en interfase teñido con azul de metileno (colorante básico) y como se veria el
mismo preparado si las células están en interfase (esta vez puede teñir con carmín acético, que se uno a proteínas)
e- ¿A qué se llama heterocromatina y a qué eucromatina? Por qué el grado de empaquetamiento afecta las
actividades biológicas de duplicación y transcripción del DNA?

5- Ingrese en el siguiente sitio

https://www.thermofisher.com/ar/es/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-of-
molecular-biology/pcr-education.html
y vea los videos
- Basics of PCR
- Principles of PCR
- Endpoint PCR, quantitative PCR

En que consiste la técnica de PCR y para qué sirven sus variantes RT-PCR, qPCR y RT-qPCR? También puede
ayudarse mirando los siguientes sitios web
https://www.e-allscience.com/blogs/news/cuales-son-las-diferencias-entre-pcr-rt-pcr-qpcr-y-rt-qpcr
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techqpcr/
https://www.thermofisher.com/ar/es/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-
time-pcr-basics/absolute-vs-relative-quantification-real-time-pcr.html

https://www.thermofisher.com/ar/es/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-
learning-center/molecular-biology-resource-library/basic-principles-rt-qpcr.html
http://www.enzolifesciences.com/science-center/technotes/2017/march/what-are-the-differences-between-pcr-
rt-pcr-qpcr-and-rt-qpcr?/
https://www.thermofisher.com/ar/es/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-learning-center/real-
time-pcr-basics/essentials-real-time-pcr.html
https://www.thermofisher.com/ar/es/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-
learning-center/molecular-biology-resource-library/basic-principles-rt-qpcr.html

6- ¿Cuáles de las siguientes preparaciones llevan secuencias de intrones?

b) DNA cromosómico de ombú.
c) DNA cromosómico del protozoo Trypanosoma cruzi.
d) DNA cromosómico de Escherichia coli.
e) RNAs mensajeros citoplasmáticos humanos.
f) RNAs nucleares precursores del mRNA (transcriptos primarios) de ratón.
g) Un banco de cDNA (cDNA “library”) de trigo.
h) Un banco de genes (genoteca o “gene library”) de trigo.
k) DNA de mitocondrias de mamíferos.
m) DNA de cloroplastos de girasol.

En clase:

1- El mapa que se muestra a continuación corresponde a un vector de DNA plasmidico (construcción realizada por
técnicas de ingeniería genética; veremos esto en unidades posteriores).
a- ¿Qué cree que indican los nombres en negrita?¿ y que los sitios en verde? ¿Por que la enzima BclI esta en gris y
tiene un asterisco?

Usted realizo efectivamente la construcción de este vector a partir de otros vectores (veremos como en la unidad
4) y como resultado obtuvo solo 2 colonias que decide crecer en medio liquido, aislar el DNA plasmidico y
caracterizarlo por restricción.
b- Elija las enzimas que utilizaría. Si elije hacer una digestión doble, ¿que consideraciones debería tener en cuenta?
c- En el laboratorio usted cuenta con las enzimas NcoI, SnaBI y SacI y realiza las siguientes digestiones
calles 1,3,5,7 DNA de clon 1 Calles 2,4,6,8 DNA de clon 2
Calles 1-2: NcoI Calles 3-4: SnaBI Calles 5-6: SacI Calles 7-8: Doble digestión SnaBI + SacI

d- Indique si los patrones de bandas obtenidos se corresponden con los esperados. Todas las digestiones le
aportaron información útil? Alguna de ellas fue determinante para carecterizar su construcción?
e- Cual podría ser la razón por la cual las 3 primeras digestiones dieron un patrón de bandas igual en ambos clones
pero la ultima no? Como explicaría las similitudes y diferencias entre los patrones del clon 1 y el clon 2? ESTA
PREGUNTA PUEDE PENSARLA PERO PODRA RESPONDERLA CORRECTAMENTE LUEGO DEL SEMINARIO DE LA
UNIDAD 4.

2- En un ensayo de retardo de la movilidad electroforética (EMSA) se empleó un fragmento de ADN radiomarcado

del gen kj56 y se incubó con (+) o sin (-) extracto nuclear aislado de los siguientes tejidos: hueso (A), pulmón (B),
cerebro (C) y piel (D). Luego los complejos ADN-proteína fueron corridos en geles de poliacrilamida no
desnaturalizantes. Los geles fueron expuestos a una película autorradiográfica; los resultados se presentan en la
figura.
a. ¿Qué tejido/s presenta/n actividad de unión que reconoce la secuencia del gen kj56?
b. Se han purificado los complejos ADN-proteína y, en todos los casos, se ha observado la misma cadena
polipeptídica. Entonces, ¿Por qué se observan bandas con distintas migraciones?
c. ¿Por qué en todos los casos aparecen bandas en la porción baja del gel? ¿Por qué algunas son más tenues?

3- En un filtro de nitrocelulosa como el de la Figura 1 se depositaron 24 clones genómicos distintos conocidos (es
decir, se sabe exactamente a qué gen corresponde cada uno) en forma de manchas circulares ordenadas en una
matriz A1, A2,...; B1, B2,...; etc. Todos los clones habían sido obtenidos con el mismo vector plasmídico y los 24
insertos corresponden a 24 genes humanos diferentes.
El DNA depositado en las manchas fue inmovilizado y desnaturalizado por tratamiento del filtro con NaOH 0,5 N.
Luego el filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con una sonda radiactiva correspondiente al DNA del vector
plasmídico solo, lavado en condiciones rigurosas y expuesto a una película radiográfica, obteniéndose el resultado
de la Figura 2. Esta técnica se llama "dot blot".

Una vez obtenido el resultado, el filtro fue tratado con agua destilada a 100ºC durante 10 minutos, tratamiento
(llamado "strip off") que despega y lava la sonda radiactiva hibridada pero no despega a los DNAs de los clones que
habían sido inmovilizados en el filtro. Luego el filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con una preparación de
RNA mensajeros de hígado humano marcados radiactivamente, y luego del lavado y autorradiografía se obtuvo el
resultado de la Figura 3.
Por último, se realizó un nuevo "strip off" y el filtro fue hibridado en condiciones rigurosas con una preparación de
RNA mensajeros de páncreas humano marcados radiactivamente y, luego del lavado y autorradiografía, se obtuvo
el resultado de la Figura 4.

Preguntas:
a) ¿Cuál es la causa de que en la Figura 2 todas las manchas den hibridación positiva?
b) ¿Cuáles de los 24 genes:
i) se expresan solamente en hígado?
ii) se expresan solamente en páncreas?
iii) se expresan en ambos órganos?
iv) no se expresan en ninguno de los dos órganos?
c) Si unos de los clones llevara por inserto al gen de la insulina humana, ¿qué señal esperaría obtener en la
coordenada correspondiente a ese clon en las Figuras 3 y 4? ¿Y para otro clon que llevara por inserto el gen de
actina humana?
d) Los experimentos mostrados en este problema reflejan los principios de la moderna tecnología de los "chips" de
DNA. La diferencia es que en lugar de un filtro de nitrocelulosa se usa un soporte sólido del tamaño de un
cubreobjetos; y en lugar de depositar un arreglo ordenado de sólo 24 genes, se hace un arreglo de todos los genes
de un organismo (6.000 en la levadura, por ejemplo; ¿cuántos en el humano?). Dicho arreglo o chip puede ser
hibridado, por ejemplo, con cualquiera de las preparaciones que se listan al final de este párrafo. Los patrones de
hibridación del "chip" son analizados tanto cualitativamente como cuantitativamente por medio de computadoras.
Discuta la utilidad de cada experimento.
i) mRNAs marcados provenientes de distintos tejidos
ii) mRNAs marcados provenientes de un mismo tipo celular en dos condiciones distintas, una antes y otra después
del tratamiento con un medicamento.
iii) mRNAs marcados provenientes de un tipo celular de fenotipo normal y otro de fenotipo canceroso.
Busque información periodística, de divulgación científica o en la web sobre los "DNA chips", también llamados
"DNA microarrays" y discuta su importancia.

4- Existe un solo gen para la fibronectina (FN) en cada célula de mamífero (en realidad dos copias, dos alelos, cuyas
secuencias son idénticas). El gen tiene 70 kpb de longitud. Sin embargo, se han encontrado en el citoplasma de
fibroblastos dos RNA mensajeros de 7,7 y 8,0 kb de longitud, respectivamente. El de 7,7 kb es idéntico en secuencia
al de 8,0 kb, excepto por el hecho de que carece de un segmento interno de 0,3 kb.
a) ¿Cómo explica la gran diferencia de tamaño entre el gen (70 kpb) y sus mensajeros (aproximadamente 8,0 kb)?
b) ¿Cómo explica la existencia de dos tipos de RNA mensajeros de FN diferentes? Discuta los posibles mecanismos
que pudieron originar los dos mRNAs. ¿Qué implicancias biológicas podría tener la presencia de los dos mRNAs?
Ud. supone que algunos tejidos expresan el mensajero de 7,7 kb, mientras que otros sólo expresan el de 8,0 kb, y
decide investigarlo usando hibridación de sondas de cDNA radiactivo a preparaciones de mensajero total de
distintos tejidos.
c) ¿Cuál de las dos especies de mensajero detecta en un Northern con cada una de las siguientes tres sondas?
Justifique.
i) un cDNA del mRNA de FN de 7,7 kb.
ii) un cDNA del mRNA de FN de 8,0 kb.
iii) un cDNA del mRNA del segmento diferencial de 0,3 kb.

5-- Con el objetivo de estudiar la función de un gen (AtbZIP1) y su posible participación en la respuesta de las
plantas a estrés abiótico se generó una mutante knockout (KO) de Arabidopsis (planta modelo) en el gen AtbZIP1
mediante la inserción de un gen de resistencia al antibiótico kanamicina (1248 pb). Para corroborar dicha mutación
se realizó un estudio de Southern blot, en el cual se digirió el ADN de Arabidopsis con la enzima EcoRI y se utilizó
como sonda un fragmento de ADN correspondiente al extremo 3’ del exón 1 del gen AtbZIP1 (El gen AtbZIP1 no
posee sitio de reconocimiento para la enzima EcoRI). En la figura a se muestra la estructura del gen AtbZIP1,
indicándose el sitio de hibridación de la sonda y el sitio de inserción del gen de resistencia (KanR) en la planta
mutante.
a- La figura b muestra el resultado del Southern blot en la planta salvaje de A. thaliana (WT). Grafique en la figura lo
que esperaría ver en este ensayo para la planta mutante en el gen AtbZIP1 (KO). Justifique.
b- En la figura c se muestra el resultado obtenido en un ensayo de RT-PCR utilizando los cebadores F y R que se
indican en la figura a, tanto para la planta salvaje (WT) como para la planta mutante en el gen AtbZIP1 (KO).
b1- ¿El tamaño del producto de PCR obtenido en este ensayo es el esperado? ¿Por qué?
b2- ¿Por qué se analizo también el gen de actina?
c- Por último, para estudiar la función de AtbZIP1, se evaluó la expresión de diferentes genes de respuesta a estrés
abiótico (RD17, LEA14, RD29, COR15A y COR15B) en la planta salvaje (WT) y en la mutante AtbZIP1 (KO), ambas
sometidas a estrés por sequía. Para ello, se extrajo ARN total de ambas plantas y se realizaron ensayos de Northern
blot, utilizando sondas específicas para los diferentes genes de respuesta a estrés.
Indique qué conclusiones puede sacar de estos resultados respecto a la función de AtbZIP1 como regulador
transcripcional.

6- El gen Bdf codifica para la proteína BDF, un factor de transcripción que controla la transcripción de diversos
genes involucrados en la diferenciación del tejido óseo en los vertebrados. La Figura 1 muestra que la transcripción
del gen Bdf es "despertada" por la unión de otro factor de transcripción, la proteína BAF, a un enhancer que está
presente en la región promotora del gen Bdf. El transcripto primario del gen Bdf puede ser procesado por "splicing"
alternativo generando 2 mRNAs distintos, uno con y otro sin el exón 3. Nunca los dos tipos de mRNAs se dan
simultáneamente en el mismo tipo celular o tejido. Uno de los dos mRNAs da polipéptidos de BDF activos y el otro
no. La inclusión del exón 3 en el mRNA es provocada por la unión específica de la proteína SF2 (factor de splicing
alternativo) a una secuencia de 9 bases presente en el exón 3 del transcripto primario.

Preguntas:
a) Ubique la señal y el sitio de corte y poliadenilación, y la TATA box en las regiones que corresponda en los
esquemas del gen, del transcripto primario y de los mRNAs de la Figura 1.
b) ¿Cuántas bandas de hibridación y de qué tamaño en pares de bases (pb) se observaría en un Southern de DNA
genómico humano digerido simultáneamente con las enzimas de restricción BamHI y HindIII, en dos experimentos
distintos: uno hibridado con una sonda correspondiente al exón 2 y otro hibridado con una sonda correspondiente
al exón 4? Si lo considera necesario ayúdese con esquemas.
Se analizó la expresión del gen Bdf en 3 tejidos humanos (sangre, hueso en desarrollo e hígado) mediante las
técnicas de Northern y Western (Figura 2). En el Northern, se corrieron RNAs de los 3 tejidos mencionados en 3
calles separadas en geles de agarosa, transferidos e hibridados con una sonda correspondiente al exón 2. En el
Western, se corrieron proteínas de los 3 tejidos mencionados en geles de poliacrilamida con SDS, sin y con pre-
tratamiento con b-mercaptoetanol b-MSH), transferidas y reveladas por un anticuerpo contra la porción de la
proteína BDF codificada por el exón 2.

d) Por que no se observa proteína en hígado? Por que no se observa banda en el NW para esa misma muestra?
Asigne los tamaños en bases a las bandas de mRNAs alfa y beta de las otras muestras que si se ven en Northern. Es
coherente con lo que ve en el gel?
e) Calcule y asigne los pesos moleculares en Daltons a las bandas b y c del Western. El PM de la banda a es de
aproximadamente 42 kDa. PM de un aminoácido = 110 Da. Son coherentes los cálculos con lo que ve en el wb?
f) Ahora realice una interpretación completa de los resultados obtenidos ¿Para cuál de los 3 dominios
característicos de los factores de transcripción (unión al DNA, dimerización y transactivación) codifica el exón 3?
¿Cuál es la estructura cuaternaria de BDF?
g) ¿En cuál/es de los 3 tejidos analizados será activo el factor de transcripción BDF?
h) Teniendo en cuenta que la velocidad de degradación de los mRNAs de BDF es igual en todos los tejidos, ¿en
cuál/es de los 3 tejidos analizados esperaría Ud. que se exprese la proteína BAF?
i) ¿En cuál/es de los 3 tejidos analizados se expresa la proteína SF2?
j) Las proteínas BAF, BDF y SF2 participan en el mecanismo de diferenciación del tejido óseo.
Sin embargo la tabla muestra que los correspondientes knock outs tienen fenotipos muy diferentes. ¿Cómo explica
cada uno de ellos?

k) Dos mutaciones distintas en el medio del exón 3 provocan el mismo fenotipo: la ausencia
de actividad de la proteína BDF. ¿Por qué mecanismo actúa cada una de ellas?
SEMINARIO UNIDAD 3
Temario teorico: Estructura, propiedades y tipos del ARN (ribosomal, de transferencia y mensajero). Procesado del
ARN en procariotas y eucariotas. Código genético. Traducción de ARN mensajero a proteína. Retículo endoplásmico
y Ribosomas. Translocación de proteínas co- y post-traduccional. Mecanismos de regulación en la síntesis y
procesamiento de proteínas y otras macromoléculas.

Temario práctico: uso de codones, herramientas para optimización de secuencias. Estrategias para el estudio de
localización y seguimiento de proteínas. WB. Co-Inmunoprecipitación

Bibliografía complementaria: HarveyLodish-ArnoldBerk Biología Celular y Molecular -Ed. Médica Panamericana

(2005) en español. Versiones posteriores en inglés. Capitulo 9 Tecnicas de genética Molecular y Genomica. Capitulo
10 Estructura molecular de genes y cromosomas. Capitulo 11 Control transcripcional de la expresión génica.
Capitulo 12 Control génico postranscripcional y transporte nuclear.

Actividades previas:

1- Vea los siguientes videos

https://www.dnalc.org/resources/3d/15-translation-basic.html
https://www.dnalc.org/resources/3d/16-translation-advanced.html
https://www.youtube.com/watch?v=5bLEDd-PSTQ
https://www.youtube.com/watch?v=WNZf4ip_R9s

2- Repase los siguientes conceptos

-codón y anticodon
-codigo genético y sus características (organizado en tripletes, degenerdo/redundante, no ambiguo/no solapado,
lectura ¨sin comas¨, universal). Es totalmente universal? Que excepciones conoce?
-uso de codones
-ORF, marco de lectura abierto
-secuencia de Shine-Dalgarno y Kozak. Cumplen la misma función?

http://webs.ucm.es/info/genetica/grupod/Codigo/Codigo%20genetico.htm

3- Explicar el mecanismo involucrado desde el inicio del proceso de traducción hasta su destino final (es decir,
dodne cumple su función) para las siguientes proteínas:
- Tubulina.
- RNA polimerasa.
- Colágeno (proteína de secreción constitutiva).
¿Cuáles poseen señales para su direccionamiento?

4- Describa las siguientes técnicas e indique su aplicación/utilidad

-Western blot
-Inmunoprecipitación
https://worldwide.promega.com/resources/multimedia/protein-expression-purification-and-
analysis/coimmunoprecipitation-to-study-protein-protein-interactions-using-the-tnt-systems/
https://www.youtube.com/watch?v=OrVVZ8X3n6k
En clase:

1- El splicing es una reacción enzimática por la cual se eliminan los intrones del RNA transcripto primario y los
exones son unidos entre sí para formar el RNA maduro. Se ha descripto splicing en transcriptos primarios tanto de
RNAs mensajeros (el más común) como de RNAs ribosomales y de transferencia (menos frecuentes). Las reacciones
de splicing pueden ser reproducidas "in vitro", es decir, en un tubo de ensayo si se colocan en el mismo los
sustratos adecuados y las enzimas o complejos enzimáticos correspondientes. Se estudiaron "in vitro" dos tipos
distintos de reacciones de splicing:

I) Splicing de un transcripto primario de RNA mensajero.

II) Splicing de un transcripto primario de RNA ribosomal.

Cada uno de los transcriptos primarios marcados radiactivamente fue incubado en presencia o en ausencia de una
preparación nuclear enriquecida en spliceosomas. A distintos tiempos (de 0 a 2 hs de incubación) se tomaron
muestras y se las sembró en calles de un gel de poliacrilamida donde, luego de la electroforesis, se observan
bandas radiactivas correspondientes a los sustratos, moléculas intermediarias y productos de las
reacciones. La posición de cada uno de éstos está representada por diagramas, donde los rectángulos son exones y
las líneas, intrones.
I) Splicing de un transcripto primario de RNA mensajero

a) Identifique sustrato, producto/s y molécula/s intermediaria/s de la reacción e interprete la variación con el paso
del tiempo de las intensidades de cada banda en el panel de la izquierda.
b) ¿Por qué el patrón de bandas del panel de la derecha es diferente?
c) ¿Qué patrón de bandas habría obtenido en los siguientes experimentos en los que la preparación de
spliceosomas hubiera sido pretratada de las siguientes maneras:
iii) Digestión con una proteasa (enzima que degrada proteínas).
iv) Digestión con una DNasa (enzima que degrada DNA).
v) Digestión con una RNasa (enzima que degrada RNA).
Nota: Las enzimas mencionadas fueron eliminadas antes de agregar la preparación de spliceosomas pre-tratada al
tubo donde se ensaya la reacción de splicing in vitro.

II) Splicing de un transcripto primario de RNA ribosomal

d) Identifique sustrato, producto/s e intermediario/s de la reacción e interprete la variación con el paso del tiempo
de las intensidades de cada banda en el panel de la izquierda.
e) Dado que los patrones de bandas son idénticos en ambos paneles, es decir en presencia o en ausencia de
preparación de spliceosomas, ¿qué puede Ud. concluir sobre el mecanismo del splicing de este RNA ribosomal
comparativamente con el del RNA mensajero?
f) ¿En cuál de los dos splicings estudiados (I o II) será crítica la estructura secundaria del transcripto primario para
que la reacción ocurra?
g) ¿Cuál podría ser la causa de que la cantidad de la forma varíe con el tiempo de incubación de manera
diferente de la cantidad de la forma ?

2- Se ha descubierto que, pese a tener secuencias aminoacídicas muy diversas, todas las proteínas peroxisomales
poseen cerca de su extremo carboxilo la secuencia Ser-Lys-Leu (SKL). Esta secuencia consenso SKL sirve de
"etiqueta" para dirigir estas proteínas a los peroxisomas. Por métodos de ingeniería genética es posible construir
un plásmido de expresión en células de mamíferos con un ADNc para la proteína peroxisomal luciferasa que
contiene la secuencia SKL (figura 1). Cuando se transfectan células de mamífero en cultivo con este plásmido se
observa que la luciferasa codificada por él se almacena correctamente en los peroxisomas. Mediante manipulación
genética es posible eliminar la secuencia SKL o agregar secuencias provenientes de genes de otras proteínas
(figuras 2 y 3). En todos los casos, las modificaciones no alteran el marco de lectura del resto de la luciferasa.

a) ¿Por qué mecanismo entra al peroxisoma la luciferasa codificada por el plásmido de la figura 1?
b) ¿En qué compartimento celular se almacenará la luciferasa codificada por el plásmido de la figura 2? Justifique.
c) ¿En qué compartimento celular se almacenará la luciferasa codificada por el plásmido de la figura 3? Justifique. Si
corresponde, describa la orientación final de la proteína.
d) Los tres ADNc de luciferasa codifican para la secuencia consenso de glicosilación Asparagina-X-Serina (NXS)
¿Cuál/es de las tres luciferasas producidas terminarán glicosiladas? Justifique su respuesta.

3- En las levaduras, la degradación de los ácidos grasos ocurre en los peroxisomas. Los ácidos grasos se degradan
totalmente hasta fragmentarse en moléculas de Acetil-CoA. Este Acetil-CoA sale del peroxisoma gracias a una
enzima de localización peroxisomal llamada carnitina acetiltransferasa y entra en la mitocondria ayudado por la
misma enzima, de localización en la membrana mitocondrial interna. Una vez en la mitocondria, el Acetil-CoA entra
al ciclo de Krebs, contribuyendo a la obtención de energía metabólica (ATP) del mismo modo que el Acetil-CoA
proveniente de la glucólisis. Un único gen de localización nuclear codifica para las dos formas (peroxisomal y
mitocondrial) de la carnitina acetiltransferasa:
Este gen tiene 2 promotores alternativos de la transcripción. El promotor 1 (P1) es constitutivo. El promotor 2 (P2)
es inducible por ácidos grasos. El transcripto iniciado por el promotor 1 no incluye nunca al exón 2 en el ARNm
maduro, que se elimina por splicing alternativo. El transcripto iniciado por el promotor 2 incluye a todos los exones
que se encuentran corriente abajo de P2 en el ARNm maduro. Ambos promotores pueden funcionar
simultáneamente. La actividad enzimática de la carnitina acetiltransferasa está codificada por los exones 3 y 4.
a) ¿En qué compartimento celular se sintetizan las carnitina acetiltransferasas mitocondrial y peroxisomal y qué
tipo de translocación las lleva a sus destinos? b) ¿En qué compartimento/s celular/es se acumulará la actividad de
carnitina acetiltransferasa en las siguientes condiciones?
i) levaduras cultivadas sin ácidos grasos en el medio de cultivo.
ii) levaduras cultivadas con ácidos grasos en el medio de cultivo.
c) ¿Cuál será la ventaja (valor adaptativo) de que el promotor 2 sea inducible por ácidos grasos?
d) Para cada una de las dos condiciones de cultivo de la pregunta b, indique el o los destinos celulares de la
actividad de carnitina acetiltransferasa para las siguientes mutaciones del gen (suponga en todos los casos que las
mutaciones se encuentran en homocigosis):
i) Deleción de la secuencia que codifica para MTS.
ii) Deleción de la secuencia que codifica para AKL.
iii) Deleción de las secuencias que codifican para MTS y AKL.
iv) Inserción de una secuencia codificante para un péptido señal start transfer, que incluye el sitio de
reconocimiento para la peptidasa de la señal, en el exón 2, corriente abajo del ATG y en fase de traducción con
éste.
e) ¿Cuál es la causa molecular de que ninguna de las carnitina acetiltransferasas estudiadas (ni la enzima normal ni
las mutantes descriptas en la pregunta d) se almacene en los lisosomas?

4- La calreticulina es una proteína con actividad de chaperona, localizada normalmente en el lumen del retículo
endoplasmático rugoso. Su actividad consiste en plegar correctamente proteínas mal plegadas, a las cuales
reconoce sólo si están glicosiladas en asparragina con un oligosacárido que aún contenga la glucosa terminal. Se
obtuvo una línea celular de ratón donde se anularon (knockearon) los dos alelos del gen de la calreticulina (células
calret-). Si bien estas células son viables, pliegan mal algunas de sus proteínas, en particular a una glicoproteína de
secreción llamada fibronectina. Se transfectaron células calret- con distintos clones de cDNA de calreticulina (Figura
1) que la dirigen a diferentes compartimentos celulares. La construcción A corresponde a la calreticulina normal
(salvaje), en tanto que las construcciones B a E son variantes artificialmente creadas.

Al final de la transfección se midió la cantidad de fibronectina presente en el medio condicionado. Los resultados
(Figura 2) indican que sólo la transfección con la construcción revirtió el fenotipo de las células calret-, es decir,
permitió detectar niveles de fibronectina en el medio similares a los de las células normales.
Preguntas:
a) ¿Por qué las células calret- sin transfectar tienen niveles mucho más bajos de fibronectina que las células
normales? Justifique.
b) ¿A qué compartimentos celulares se dirigieron y en qué forma se acumularon (soluble o de membrana) las
calreticulinas codificadas por las construcciones A, B, C, D y E usadas para transfectar las células calret-? Justifique
su respuesta poniendo en evidencia sus conocimientos teóricos sobre los mecanismos de direccionamiento de
proteínas en las células eucariotas.
c) ¿Por qué las transfecciones con las construcciones B, C, D y E no recuperaron los niveles de fibronectina en el
medio? Justifique su respuesta para cada una de las construcciones indicando si en cada destino la chaperona
encontró o no a la fibronectina, y, en caso de haberla encontrado por qué no pudo plegarla correctamente.

5- Se desea estudiar la localización subcelular de 5 proteínas cuya función se desconoce. Para ello, se plantea
expresarlas como proteínas de fusión en cultivos celulares y analizar su distribución subcelular mediante
microscopía confocal. La siguiente tabla muestra las características estructurales de cada una de ellas.

Proteína PM (kDa) Estructura

5-2 28,9 Motivo coiled-coil (aa 127-155), región de aa básicos en C-terminal
7-2 36,8
9-2 20,5 2 dominios transmembrana predichos

a) ¿Qué localización subcelular esperaría para cada proteína en función de su estructura?

b) Describa cómo construiría plásmidos de expresión de las distintas proteínas fusionadas a la proteína verde
fluorescente (GFP, 238 aa, 27 kDa) en su extremo amino o carboxilo. No olvide indicar las señales necesarias para la
correcta expresión de la proteína en cada caso.
c) Ud. transfecta los distintos plásmidos en cultivos celulares, pero cuando quiere analizar la expresión de las
proteínas de fusión se rompe la lámpara del microscopio confocal. ¿Cómo haría para demostrar que las proteínas
se expresan en esas condiciones experimentales?
La siguiente figura muestra los resultados de la expresión de las proteínas P5-1, P7-2 y P9-2 fusionadas a GFP en su
extremo amino o carboxilo. Además, se marcaron distintas organelas o la membrana plasmática con proteínas
reporteras fusionadas al fluoróforo mCherry, de color rojo (Maroniche y col, Virology 430, 2012). Analice los
resultados obtenidos teniendo en cuenta la estructura de las proteínas en estudio y el efecto de la fusión a GFP en
cada caso.
6- En las plantas, las proteínas vacuolares son translocadas cotraduccionalmente al RE, donde adquieren su
plegamiento definitivo y desde donde migran hacia el complejo de Golgi en vesículas. En la red trans-Golgi y en el
compartimento prevacuolar, los receptores de direccionamiento vacuolar (VSR) cumplen un papel muy importante
en el transporte de las proteínas vacuolares hacia su destino definitivo. Usted cuenta con plantas transgénicas de
A.thaliana que expresan la proteína VSR1 fusionada a un epitope myc (AtVSR1:myc). En estas plantas, ha
demostrado que la proteína de fusión (de ~80 kDa) forma complejos de alto peso molecular (240 kDa).
a) Diseñe un experimento que le permita demostrar que los complejos observados corresponden a multímeros de
la proteína AtVSR1. Grafique los resultados esperados. No olvide incluir los controles necesarios.
Con el fin de determinar los dominios necesarios para la interacción homomérica de AtVSR1, se construyó una serie
de mutantes fusionadas al epitope HA en el C-terminal:

Mutantes de AtVSR1. Las barras blancas representan el dominio luminal, las barras negras corresponden al dominio
transmembrana (TMD) y las grises al extremo carboxilo. Las barras rayadas indican la sustitución del fragmento
correspondiente por una región homóloga de otra familia de receptores de tránsito vacuolar.

Estas construcciones se cotransformaron en protoplastos junto con AtVSR1:myc, y los extractos proteicos se
inmunoprecipitaron utilizando un anticuerpo anti-myc. Las proteínas inmunoprecipitadas se revelaron por WB:

Coinmunoprecipitación de mutantes de deleción y sustitución de AtVSR1. T: extracto proteico total sin

inmunoprecipitar (10% del volumen total); IB: inmunoblot; P, IP: inmunoprecipitación.

b) Interprete los resultados obtenidos.