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Sclerotium rolfsii
Contenido
Guillermo Castellanos, Experto en Investigación–2 Generalidades 8-2
Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación Procedimientos 8-3
Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto A. Recolección y transporte de las muestras 8-3
B. Preparación del medio de cultivo PDA 8-5
Fitopatología de Frijol
C. Aislamientos de S. rolfsii 8-6
1. En el medio de cultivo PDA 8-6
2. Aislamiento monomicelial 8-8
D. Incremento de S. rolfsii 8-10
E. Inoculación en el invernadero 8-12
F. Conservación de S. rolfsii para almacenamiento 8-15
G. Recuperación del hongo almacenado 8-15
Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
Generalidades
Foto 2
8-2
Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii
Enfermedad: Añublo sureño
Procedimientos
Materiales
– Toallas de papel
– Bolsas de papel
– Rótulos para identificar el material
– Prensa para muestras o un cuaderno corriente
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Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
Recomendaciones
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Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii
Enfermedad: Añublo sureño
• Paso 1
Tomar muestras de una raíz que presente síntomas
de la enfermedad.
• Paso 2
Envolver la muestra en una toalla de papel, colocarla
en una bolsa o sobre de papel y adherir a ésta el
rótulo que corresponda (ver A. Recolección y...)
• Paso 3
Enviar la muestra, tan pronto como sea posible, al
sitio o laboratorio donde se hará el aislamiento del
hongo patógeno. Nunca envíe las muestras dentro
de bolsas plásticas o envueltas en papel aluminio
(ver A. Recolección y...).
Materiales
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Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
Preparación
– Se pesan los ingredientes (Foto 3), se colocan en
un recipiente grande, que puede ser un vaso de
precipitado, y se les agrega el agua; esta solución se
envasa en dos frascos erlenmeyer (500 ml en cada
uno).
– Los frascos erlenmeyer con el medio de cultivo PDA
se esterilizan en el autoclave. Esta máquina, con
Foto 3 una presión de 20 libras y una temperatura de
121 °C, realiza el proceso total de esterilización en
40 minutos.
– El medio esterilizado se deja enfriar hasta que pueda
manipularse (Foto 4) y se vierte luego en cajas petri,
a razón de 25 ml por caja (Foto 5).
C. Aislamientos de S. rolfsii
Foto 4 Materiales
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Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii
Enfermedad: Añublo sureño
• Paso 1
Cortar varios trozos del tejido infectado de la
muestra utilizando una tijera estéril (Foto 6).
• Paso 2
Desinfectar, durante 3 minutos, los trozos de Foto 7
muestra en una caja petri de 60 mm que contenga
una solución de hipoclorito de sodio al 2.5%.
• Paso 3
Lavar tres veces con agua destilada estéril los trozos
desinfectados (Foto 7).
• Paso 4
Colocar los trozos lavados sobre toallas de papel
estériles durante 10 minutos para que se sequen
(Foto 8).
Foto 8
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Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
• Paso 5
Una vez que los trozos estén secos, tomar los
pedazos de tejido con una pinza estéril, ‘sembrarlos’
(tres por caja) en cajas petri que contengan el medio
de cultivo PDA (Foto 9). Incubar las cajas a 24 °C
durante 10 días, tiempo en que el hongo producirá
Foto 9 micelio blanco (Foto 10), del cual saldrán más tarde
esclerocios que pueden verse a simple vista como
puntos negros (Foto 11); con el tiempo, estos
esclerocios se tornarán de color café.
2. Aislamiento monomicelial
El objetivo de este procedimiento es obtener una
cepa del hongo genéticamente pura. Si el hongo se
aísla de tejido vegetal con síntomas, éstos pueden ser
producidos por varias cepas de un mismo hongo. Por
eso es necesario purificar el hongo obtenido en el primer
Foto 10 paso del aislamiento, empleando tejido de las puntas de
algunas hifas. El procedimiento comprende los pasos
siguientes:
• Paso 1
Con un sacabocado de aproximadamente 0.5 cm de
diámetro, transferir el hongo que ha crecido en el
medio de cultivo PDA (ver C., 1. En el medio…,
Paso 5) al centro de una caja petri que tenga el
medio de cultivo PDA. Incubar a 24 °C de 24 a
48 horas.
Foto 11
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Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii
Enfermedad: Añublo sureño
• Paso 2
Observar, durante este tiempo, el crecimiento del
micelio bajo el estereoscopio en la cámara de flujo
laminar. Enfocar los bordes de la colonia para
identificar las puntas de las hifas.
• Paso 3
Cortar, con un alfiler flameado, un pedacito de agar
que contenga la punta de una sola hifa, ejecutando
luego las siguientes operaciones:
• Paso 4
Destapar, durante 3 días para que se sequen, las
cajas petri que contienen estos esclerocios maduros
(obtenidos partiendo del aislamiento monomicelial).
Una vez secados, cosechar los esclerocios y
almacenarlos a –20 °C, ya sea en sobres de papel
mantequilla o en tubos de vidrio cerrados.
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Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
D. Incremento de S. rolfsii
En el laboratorio de Patología de Frijol se halló que
la producción de esclerocios de S. rolfsii se favorecía
cuando se suplementaba el medio de cultivo de agar
con harina de frijol.
Materiales
– Agar granulado 15 g
– Agua destilada 1 litro
– Harina de frijol esterilizada 50 g
– Frascos erlenmeyer de 1 litro 4
• Paso 1
Moler semillas de frijol que tengan una humedad
menor que 14%, utilizando un molino o un mortero;
el producto debe quedar molido, pero no muy
finamente. Colocar luego esta harina en un recipiente
cerrado y esterilizarlo en autoclave dos veces. Una
vez esterilizada la harina, proceder con la preparación
del medio AHF.
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Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii
Enfermedad: Añublo sureño
• Paso 2
– Mezclar muy bien el agar y la harina de frijol.
– Adicionar 1 litro de agua destilada a esa mezcla.
– Verter, en los frascos erlenmeyer de 1 litro,
volúmenes de 250 ml de la mezcla líquida anterior.
– Colocar en la boca de cada frasco erlenmeyer un
capuchón de gasa y ajustarlo con una banda de
caucho; colocar papel aluminio sobre la gasa.
– Esterilizar los frascos erlenmeyer tapados en un
autoclave.
– Cuando se enfríe la mezcla, vaciarla en cajas petri.
• Paso 3
Transferir un esclerocio almacenado (ver
C., 2. Aislamiento monomicelial…, Paso 4) empleando
un alfiler flameado que lleve un pedacito de agar en la
punta, y sembrarlo en el medio AHF contenido en una
caja petri. Repetir este paso en varias cajas.
• Paso 4
Pasado este tiempo, destapar las cajas durante
3 días para que se sequen los esclerocios. Una vez
secos, cosecharlos y almacenarlos en sobres de
papel mantequilla o en tubos de vidrio, a –20 °C.
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Guías Prácticas de Laboratorio para el
Manejo de Patógenos del Frijol
E. Inoculación en el invernadero
Materiales
– Suelo
– Harina de frijol
– Agua destilada
– Bandejas autoclavables para preparar inóculo
– Papel aluminio y papel de envolver
– Esclerocios de S. rolfsii
• Paso 1
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Guía Práctica 8: Sclerotium rolfsii
Enfermedad: Añublo sureño
• Paso 2
Dejar enfriar esta mezcla de suelo en la bandeja,
una vez esterilizada en el autoclave. Pesar los
esclerocios antes cosechados y almacenados (ver
D. Incremento de..., Paso 4) y esparcirlos
uniformemente sobre la superficie del suelo de cada
bandeja, a razón de 0.2 g de esclerocios (200 mg)
por kilogramo de suelo.
• Paso 3
Colocar las bandejas en el laboratorio a temperatura
ambiente, y revisarlas semanalmente para
comprobar que no se haya contaminado ese suelo
inoculado. Pasados de 15 a 17 días, el hongo habrá
crecido lo suficiente para colonizar con micelio el
suelo y producir esclerocios. Este suelo (Foto 13) se Foto 13
empleará como inóculo en las pruebas de
invernadero.
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Inoculación
Foto 16
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Enfermedad: Añublo sureño
Foto 17
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