PRACTICA 3

CLONAJE DE GENES EN VECTORES DE EXPRESION BACTERIANA: SELECCION Y ANALISIS DE

CLONES RECOMBINANTES

Fundamento:
Los clones que contienen el vector se seleccionan en base a su resistencia a ampicilina.
El análisis estructural de plásmidos recombinantes tiene dos objetivos: 1) la
identificación de clones que contengan el vector con el inserto y 2) la orientación del
mismo. Todo ello se llevará a cabo mediante el aislamiento del DNA del plásmido y
análisis de restricción.

Procedimiento:
1) Crecimiento de clones bacterianos.
2) Extracción y purificación del DNA de plásmidos.
3) Análisis de restricción del plásmido:
a) Elección de las enzimas de restricción adecuadas: deducción del tamaño de los
fragmentos generados tras la digestión con distintas enzimas.
b) Digestión enzimática de DNA.
c) Separación de fragmentos por electroforesis en geles de agarosa
d) Análisis y discusión de los resultados.

Explicación detallada del procedimiento:

1.- Crecimiento de clones bacterianos.

Coger una colonia con un asa de cultivo e inocular un erlenmeyer con 5 ml de LB
conteniendo 100 µg/ml de ampicilina. Crecer a 37°C con agitación durante la noche.

Dia 1
2.- Extracción y purificación del DNA de plásmidos (Miniprep)
Preparación de plásmido a escala pequeña con el Kit Wizard ® Plus SV Minipreps
(basado en el método de lisis alcalina)
Información suministrada por el fabricante en: www.promega.com/tbs/tb225/tb225.pdf
- Poner 1.5 ml del cultivo crecido durante la noche en un tubo Eppendorf. Recoger las
células por centrifugación en minifuga 3 min. Tirar el sobrenadante.
- Resuspender en Vortex el sedimento celular en 250 l de solución R (50 mM Tris-HCl
pH 7.5, 10 mM EDTA, 100 g/ml RNasa A). QUE NO QUEDEN GRUMOS.
- Lisar las células con 250 l de solución L (0.2 M NaOH, 1% SDS), mezclar por
inversión. Observar el aumento de viscosidad. NO DEJARLO MAS DE 5 min.
- Degradar proteínas del lisado con 10 l de solución P (proteasa alcalina), mezclar por
inversión. NO DEJARLO MAS DE 5 min.

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- Neutralizar con 350 l de solución N (4.09 M hidrocloruro de guanidina, 0.759 M
acetato potásico, 2.12 M acido acético), mezclar por inversión.
- Centrifugar 10 min.
- Transferir por decantación el sobrenadante claro a un filtro adaptado a un tubo
Eppendorf, al que previamente habremos cortado la tapa. La tapa la guardaremos para
después de las centrifugaciones. QUE NO CAIGA MATERIAL VISCOSO NI
PRECIPITADO BLANCO. En caso de que esto ocurra, devolverlo al tubo y centrifugar
otra vez. Repetir el proceso.
- Centrifugar 1 min el material del filtro adaptado al Eppendorf. PREVIAMENTE DAR
DOS O TRES PULSOS (centrifugación muy corta). La fuerza centrífuga impide que se
salga el líquido.
- Vaciar el Eppendorf, lavar el filtro con 750 l de solución W (8.3 mM Tris-HCl, 0.04 mM
EDTA, 60 mM acetato potásico, 60% etanol), centrifugar 1 min.
- Repetir el proceso lavando con 250 l de solución W, centrifugar 2 min.
- Poner el filtro, asegurándose de que no tiene solución W, en un Eppendorf nuevo.
- Eluir el plásmido del filtro con 50 l de agua sin nucleasas (H). Dejar unos instantes
antes de centrifugar 1 min. PREVIAMENTE DAR DOS O TRES PULSOS.

Dia 2
3.- Análisis de restricción del plásmido.
a) Elección de las enzimas de restricción adecuadas
- Digestión con una enzima de corte único (Bam HI): Lineariza el plásmido, permitiendo,
según el tamaño, determinar la presencia o ausencia de inserto.
- Digestión con un enzima que flanquee el inserto (Eco RI). Esta digestión libera el
inserto y permite verificar su tamaño.
- Digestión con una enzima que tenga una diana de restricción asimétrica dentro del
inserto y otra en el vector (Kpn I). Esta digestión permite determinar la orientación del
inserto.
b) Digestión enzimática de DNA.
- Digerir 15 l del plásmido obtenido con Eco RI, Bam HI y Kpn I según el siguiente
protocolo:
DNA 15 µl
Tampón 10X 2 µl
Enzima 1 µl
H20 2 µl
Incubación al menos 1 h a 37ºC.
NOTA: Cada enzima requiere su propio tampón, recomendado por el fabricante.

c) Separación de fragmentos por electroforesis en geles de agarosa

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- Preparar un gel de agarosa de 70 ml al 0.7% (0.49 gr) en 1XTAE, utilizando el peine de
15 pocillos. Añadir a la agarosa fundida 1 l de GelRed.
- Añadir 4 µl de solución de carga a las muestras correspondientes a las digestiones
enzimáticas, y cargar todas las muestras en la electroforesis. Cargar en un extremo, 18
µl de marcadores de tamaño (3 µl DNA Molecular Weight Marker XVI, 250bp ladder + 3
µl de solución de carga.+ 12 µl H2O)
- Correr el gel a 100V, hasta que el Azul de Bromofenol esté a 1/3 del final del gel,
visualizarlo al ultravioleta.

d) Análisis y discusión de los resultados.

- Calcular, a partir de la posición de las bandas en el gel, el tamaño de los fragmentos
obtenidos tras la digestión con las distintas enzimas de restricción.
- Determinar la orientación del inserto.

CUESTIONES
1- Deducir el número y tamaño de los fragmentos obtenidos tras la digestión con Eco
RI, Bam HI y Kpn I. Determinar su movilidad electroforética respecto de los marcadores
de tamaño.
2- ¿Con qué otro/s enzimas podríamos determinar la orientación del inserto?
(ver Apéndice I)
3- Buscar la secuencia codificante del eIF-4E (primer ATG) (ver Apéndice I).
Determinar:
a) el nº de aminoácidos de la proteína.
b) la secuencia de los 5 aminoácidos N-terminales.
c) la secuencia de los 5 aminoácidos C-terminales.
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4- Diseña un primer para obtener por mutagénesis dirigida el cambio Arg -Ser.
5- Determinar si en el recombinante con la orientación correcta el gen de la proteína eIF-
4E está en fase con el de la -galactosidasa.
6- En caso negativo ¿Cuántos aminoácidos tendría la proteína de fusión resultante?
7- En caso negativo ¿Cómo se podrían poner en fase -galactosidasa y eIF-4E ?
8- Teóricamente el inserto se podría colocar en cualquier orientación, sin embargo en el
análisis de los recombinantes mayoritariamente se obtiene una. ¿Podrías proponer una
hipótesis para explicar este resultado?.
9- Diseña los primers para insertar de forma unidireccional (con dos enzimas distintos) el
cDNA de eIF-4E en el plásmido pBluescript IIKS, y detalla el procedimiento a seguir en
el clonaje. ¿Qué condiciones deben cumplir los enzimas seleccionados?.

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