CORPORACIÓN CORPOGEN

Carrera 4 No 20-41
Bogotá, Colombia
Tels: 3124064841
Correo: servicios@corpogen.org

SERVICIO DE SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

SECUENCIA INDIVIDUAL TIPO SANGER

El servicio de secuenciación de DNA, tipo Sanger, se realiza por “Extensión del

iniciador” sobre productos de PCR o plásmidos usando iniciadores universales o
aquellos escogidos por el cliente.

La secuenciación es realizada por Macrogen Inc. en Corea del Sur. Para ello se
usa la química del kit “ABI PRISM® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing”,
electroforesis capilar y un secuenciador ABI PRISM® 3730XL Analyzer (96
capillary type).

Las muestras y los iniciadores respectivos deben cumplir con las siguientes
especificaciones:

MUESTRA CONCENTRACIÓN VOLUMEN

DNA plasmídico 100 ng/l 25 l /reacción

Fragmento de PCR
100 ng/l 20 l reacción
No purificado
Fragmento de PCR
50 ng/l 20 l /reacción
Purificado
Iniciadores* 10 pmol/l = 10 M 20 l /5 reacciones

*En ningún caso deben enviarse menos de 20 microlitros de los iniciadores.

Por cada fragmento de PCR o plásmido enviado a secuenciar, el cliente puede
escoger hacer la reacción de secuencia con el iniciador sentido (forward) o el
antisentido (reverse) o con ambos, en cuyo caso se trataría de dos reacciones.

Una reacción de secuencia bajo las mejores condiciones corre máximo hasta unas
600 a 800 bases y en general las primeras 50 a 60 bases del inicio se pierden.

Los fragmentos de PCR menores a 200 pb presentan en general dificultades en la

secuencia debido a que para este tamaño de fragmento la cantidad obtenida en
una PCR normal suele exceder la necesaria para el protocolo usado en
secuenciación y esto ocasiona sobreamplificación en la corrida. Por otra parte la
pérdida de las 50 a 60 bases en el inicio de la secuencia se vuelve significativo
para un fragmento de este tamaño. Si este es su caso, comuníquese previamente
para determinar la factibilidad del ensayo.

El DNA plasmídico debe estar purificado por medio de algún kit comercial
apropiado. El grado de purificación es esencial para la obtención de un buen
resultado de secuencia. No use tampón Tris-EDTA (TE) para diluir o resuspender
el DNA plasmídico pues el EDTA inhibe la reacción de la secuenciación. Use
tampón Tris-HCl 10 mM pH 8.0 o agua desionizada.

En caso de tratarse de fragmentos de PCR, el servicio incluye una purificación

previa a la reacción de secuenciación. Esta purificación se lleva a cabo por una
precipitación alcohólica que solo remueve moléculas pequeñas como iniciadores
sobrantes de la PCR, dNTPs, etc. por lo que es necesario que el producto de PCR
presente una sola banda en electroforesis y carezca de barridos. En caso
contrario, el producto de PCR debe ser purificado a partir de un gel de
electroforesis, servicio prestado también por CorpoGen con un costo extra al de
secuenciación. Si el cliente prefiere hacer esta purificación debe informar que las
muestras ya fueron purificadas.

Generalmente la concentración de un producto de PCR es adecuada, si al

sembrar 2 a 3 l del producto de PCR, da una banda visible en una electroforesis
en gel de agarosa. No use cuantificación por espectrofotometría ultravioleta para
cuantificar los fragmentos de PCR.

Los iniciadores deben estar diluidos en agua desionizada a una concentración de

10 pmol/l (10 M). Se deben enviar 20 l por cada cinco reacciones de secuencia
y nunca menos de este volumen.

Los iniciadores deben cumplir además con los siguientes parámetros:

 Alta pureza.
 Una longitud entre 18 y 25 bases.
 Un contenido de GC entre el 40% y el 60%.
 Un Tm entre 55°C y 60°C.
 Estar libres de sales, EDTA u otros contaminantes.
 Que no tengan otros sitios de unión, ni desapareamientos.
 No formar estructuras secundarias.

Enviar todos los datos, vía correo electrónico en el “Formato envío muestras
secuencia” adjunto, así como una foto de la electroforesis del producto de PCR.

Al marcar las muestras y los iniciadores tenga en cuenta las siguientes

precauciones:

 Use en lo posible nombres cortos, si puede usar números, mejor.

 Marque los tubos de manera clara, con un rotulo o un marcador adecuado que
no se borre o se pierda durante el envío y manejo de las muestras.
 Los nombres marcados en los tubos deben coincidir con los registrados en el
formato de envío.

Se dispone para la secuenciación de un set de iniciadores universales listados en

la tabla adjunta. En caso de que la secuencia vaya a ser realizada con alguno de
estos iniciadores universales, no es necesario que el cliente lo suministre.

De común acuerdo con los clientes las muestras se pueden recibir y secuenciar en
varios envíos, siempre y cuando el tiempo de ejecución del total no supere el año.

Los resultados son enviados en un archivo comprimido vía correo electrónico. De

cada reacción de secuencia se entregan cuatro archivos: .txt, .phd.1, .ab1 y .pdf.
en los cuales vienen las secuencias mismas, así como los electroforetogramas y
los parámetros de calidad correspondientes.

El cliente debe suministrar una dirección de correo electrónico para el envío de los
resultados.

Cuando las secuencias no den buenos parámetros de calidad y dependiendo de

su número, algunas de ellas son repetidas, sin costo adicional, para confirmar
especialmente que el problema no esté en la corrida misma de secuencia.. La
garantía no aplica para fragmentos de PCR menores a 200 pb, debido a los
problemas antes explicados para este tipo de muestra.

Para órdenes mayores a cincuenta (50) reacciones de secuencia, se le ofrece

la posibilidad al cliente de contratar una garantía de repetición del 10% de
las reacciones para aquellos casos en que la calidad no sea suficiente. Esta
garantía debe ser cotizada en cada caso.

Para casos en los cuales se procesen un número alto de muestras, se ofrece la

posibilidad de secuenciarlas en placas de 96 pozos. Solicitar la información
específica sobre este servicio a CorpoGen.
 COSTOS

SERVICIO DE SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

VALOR UNITARIO
SECUENCIA INDIVIDUAL TIPO (Por reacción)
SANGER
$ 37.000

 En este costo está incluido el impuesto del IVA del 19%.

 Según el numeral 1 del Artículo 476 de Estatuto Tributario se encuentran

excluidos del impuesto a las ventas "Los servicios médicos, odontológicos,
clínicos y de laboratorio, para la salud humana". Si el cliente puede
certificarnos por escrito que en su caso el servicio de secuencia está cobijado
por está clausula, se le excluirá del pago del IVA

 En caso de ser una entidad, la responsable por el pago del servicio, ésta debe
enviar vía correo electrónico o fax, la orden de servicio respectiva, condición
necesaria para iniciar el servicio.

 Forma de pago: 30 días fecha factura

La facturación se hace a la entrega de los resultados.

 En caso de ser una persona natural, la responsable por el pago del servicio, se
deberá cancelar por anticipado mínimo un 50% del valor. El saldo lo debe
cancelar a la entrega de los resultados. Los datos de la cuenta para hacer la
consignación respectiva son:

Cuenta de ahorros Bancolombia No 031-009610-07 a nombre de la

Corporación CorpoGen.

 Se debe entender que una reacción de secuencia corresponde a la secuencia

por un solo extremos del fragmento de PCR o del plásmido.

 Teniendo en cuenta que el servicio se hace fuera de Colombia, se asume que

el cliente posee el permiso correspondiente para sacar material genético del
país.
TIEMPO DE ENTREGA

 De ocho a diez días para grupos de al menos 20 secuencias, después de

recibir la orden de servicio y las muestras respectivas.

DIRECCIÓN DE ENVÍO DE LAS MUESTRAS

Corporación CorpoGen
Carrera 4 No 20-41
Bogotá 110311

DIRECCIÓN DE CORREO PARA EL ENVÍO DEL FORMATO Y LA FOTO

servicios@corpogen.org

Para mayor información contactar a:

Walter Ocampo Moure

Área de productos y servicios
Corporación CorpoGen

Tels: 3239868 - Ext. 3552

312-4064841

servicios@corpogen.org
 INICIADORES UNIVERSALES

INICIADOR SECUENCIA ( 5´- 3´) No bases

Bluescript SK CGCTCTAGAACTAGTGGATC 20

EBV-RP GTGGTTTGTCCAAACTCATC 20

KAN2-FP ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC 25

KAN2-RP GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAG 25

M13-FP TGTAAAACGACGGCCAGT 18

pBacPAC-RP GTCTGTAAATCAACAACGC 19

pBAD-FP ATGCCATAGCATTTTTATCC 20

pDONOR-FP TAACGCTAGCATGGATCTC 19

pEGFP_N CCGTCCAGCTCGACCAG 17

pEGFP-FP TTTAGTGAACCGTCAGATC 19

pEGFP-RP AACAGCTCCTCGCCCTTG 18

pESP-RP TCCAAAAGAAGTCGAGTGG 18

pET-24a GGGTTATGCTAGTTATTGCTCAG 23

pET-RP CTAGTTATTGCTCAGCGG 18

pMalE TCAGACTGTCGATGAAGC 18

pREP-fwd GCTCGATACAATAAACGCC 19

35S-A AAGGGTCTTGCGAAGGATAG 20

35S-B AGTGGAAAAGGAAGGTGGCT 20

AD Reverse AGATGGTGCACGATGCACAG 20
 INICIADOR SECUENCIA ( 5´- 3´) No bases

CYC1 Reverse GCGTGAATGTAAGCGTGAC 19

DsRed1-C AGCTGGACATCACCTCCCACAACG 24

DsRed1-N GTACTGGAACTGGGGGGACAG 21

EGFP-C CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTG 22

EGFP-N CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG 22

GAL1 Forward AATATACCTCTATACTTTAACGTC 24

U-19mer Primer GTTTTCCCAGTCACGACGT 19

T7 EEV ATGTCGTAATAACCCCGCCCCG 22

Bluescript KS TCGAGGTCGACGGTATC 17

pFastBac Forward GGATTATTCATACCGTCCCA 20

pFastBac Reverse CAAATGTGGTATGGCTGATT 20

AOX1 Forward GACTGGTTCCAATTGACAAGC 21

AOX1 Reverse GCAAATGGCATTCTGACATCC 21

a-Factor TACTATTGCCAGCATTGCTGC 21

STag 18mer Primer GAACGCCAGCACATGGAC 18

MT Forward CATCTCAGTGCAACTAAA 18

QE Promoter CCGAAAAGTGCCACCTG 17

pRH Forward CTGTCTCTATACTCCCCTATAG 22

pRH Reverse CAAAATTCAATAGTTACTATCGC 23

SV40-pArev CCTCTACAAATGTGGTATGG 20

SV40-Promoter GCCCCTAACTCCGCCCATCC 20
 INICIADOR SECUENCIA ( 5´- 3´) No bases

pTrcHis Forward GAGGTATATATTAATGTATCG 21

pJET1.2F CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC 23

pJET1.2R AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG 24

T7 AATACGACTCACTATAG 17

T7terminator GCTAGTTATTGCTCAGCGG 19

T7promoter TAATACGACTCACTATAGGG 20

T3 ATTAACCCTCACTAAAG 17

SP6 ATTTAGGTGACACTATAG 18

M13F-pUC GTTTTCCCAGTCACGAC 17

M13R-pUC CAGGAAACAGCTATGAC 17

M13F GTAAAACGACGGCCAGT 17

M13R GCGGATAACAATTTCACACAGG 22

pGEX5 GGCAAGCCACGTTTGGTG 18

pGEX3 GGAGCTGCATGTGTCAGAGG 20

27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 20

1492R TACGGYTACCTTGTTACGACTT 22

518F CCAGCAGCCGCGGTAATACG 20

800R TACCAGGGTATCTAATCC 18

785F GGATTAGATACCCTGGTA 28

907R CCGTCAATTCMTTTRAGTTT 20

337F GACTCCTACGGGAGGCWGCAG 21
 INICIADOR SECUENCIA ( 5´- 3´) No bases

1100R GGGTTGCGCTCGTTG 15

ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 19

ITS2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC 20

ITS3 GCATCGATGAAGAACGCAGC 20

ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 20

ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 22

BGH-R TAGAAGGCACAGTCGAGG 18

CMV-F CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG 21

RVprimer3 CTAGCAAAATAGGCTGTCCC 20

RVprimer4 GACGATAGTCATGCCCCGCG 20

GLprimer1 TGTATCTTATGGTACTGTAACTG 23

GLprimer2 CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCA 23

pQE-F CCCGAAAAGTGCCACCTG 18

pQE-R GTTCTGAGGTCATTACTGG 19

Gal4AD TACCACTACAATGGATG 17

pBAD-F ATGCCATAGCATTTTTATCCA 21

pBAD-R GATTTAATCTGTATCAGG 18

EGFP-CF AGCACCCAGTCCGCCCTGAGC 21

EGFP-CR CGTCCATGCCGAGAGTG 17

EGFP-NR CGTCGCCGTCCAGCTC 16

LCO1490 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 25
 INICIADOR SECUENCIA ( 5´- 3´) No bases

HCO2198 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 26

NS1 GTAGTCATATGCTTGTCTC 19

NS8 TCCGCAGGTTCACCTACGGA 20

LR0R ACCCGCTGAACTTAAGC 17

LR7 TACTACCACCAAGATCT 17