UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

E.A.P. Microbiología y Parasitología

DESARROLLO DE INÓCULO DE PSEUDOMONAS SP A NIVEL DE

LABORATORIO

TRUJILLO- PERÚ
2017
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I. Introducción

La biotecnología es la ciencia que se ocupa de la utilización de procesos biológicos más o

menos espontáneos para obtener productos de interés industrial1.
En realidad, es un proceso que viene utilizándose, desde la antigüedad para elaborar una serie
de alimentos que como el pan, el vino, la cerveza, el vinagre, el yogur y el queso, forman parte de
nuestro acervo alimentario, desde hace miles de años. No es, pues la biotecnología una
metodología moderna. Si lo es, sin embargo, el hecho de utilizar esas mismas técnicas pero
modificadas según los avances aportados por la genética molecular2.
Dentro de los procesos realizados en la biotecnología encontramos a los procesos
prefermentativos, lo cual significa que son realizados antes de la fermentación; es decir, antes que
de poner al medio de cultivo en contacto con nuestro microorganismo de interés que va a
producir nuestro producto final2.
Los procesos prefermentativos involucra el desarrollo del inoculo, la preparación del medio
del cultivo y la esterilización. El inóculo del microorganismo esta en relación con su tamaño en
estos procesos; pues mientras más grande es, más rápido este llegará a la fase exponencial; por lo
tanto esto significa un ahorro en los costos para la empresa2.
Generalmente el inóculo se puede preparar en la propia industria o puede comprarse en
industrias especializadas, es lo que se conoce como cultivos iniciadores o starters. Este inóculo
debe cumplir con parámetros estandarizados: Pureza, estabilidad, actividad, rendimiento y
resistencia2.
En la pureza se evalúa que el inóculo esté libre de contaminantes, pues estos pueden alterar el
procedimiento. Cuando se habla de estabilidad, queremos decir que, el producto no debe sufrir
ninguna alteración durante el proceso a gran escala. Los parámetros de actividad y rendimiento
del producto final sean adecuados para la industria a gran escala; además debe ser resistente a
esas condiciones de crecimiento2.
Si el inoculo se realiza en la propia industria, se realiza el proceso llamado “Tren de
fermentación” el cual es un proceso controlado, en cual el microorganismo de interés en un inicio
se encuentra en un medio sólido; a este se lo inoculará en un medio líquido, en el cual se lo dejará
crecer para luego pasarlo a un medio de cultivo de mayor volumen y así sucesivamente hasta el
volumen final de trabajo. El tamaño de inoculo si se trabaja con bacterias es un 1% del volumen
final, en otro caso si el microrganismo es un hongo el tamaño del inoculo será del 10%: Esto se
debe a que el tiempo de generación de las bacterias es mayor que el de los hongos, aunque se
debe resaltar que cada proceso industrial es distinto2. En la práctica el proceso llamado “Tren de
fermentación” se hará siguiendo el modelo de trabajo propuesto por Monod.
Los modelos cinéticos de crecimiento celular comúnmente se basan en el modelo teórico
propuesto por Monod, el cual establece las constantes cinéticas que especifican el
comportamiento de dicho microorganismo, generalmente de tipo sigmoidal. No obstante, dicho
modelo es muy simple y no siempre permite obtener una buena representación de los datos de

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crecimiento del microorganismo. Con el propósito de alcanzar un mayor grado de ajuste a los
datos experimentales, autores como Zwietering et al. (1990) han propuesto otros modelos como
alternativa al de Monod3; los autores evaluaron diferentes funciones sigmoidales y encontraron
que estadísticamente la función de Gompertz y la función logística describen adecuadamente el
crecimiento de los microorganismos4. Sin embargo, el modelo de Baranyi es cada vez más
popular y diversos estudios lo postulan como el mejor5.

II. Objetivos

A. Objetivo general

 Preparar un inóculo de Pseudomonas sp a nivel de laboratorio.

B. Objetivos específicos
 Evaluar la viabilidad y la pureza del inoculo de Pseudomonas sp en cada paso del
proceso del desarrollo del inóculo.

III. Materiales

IV. Procedimiento

V. Resultados

Tabla N°1 Recuento de Pseudomonas sp en cámara de Neubauer a las 72 horas de

incubación desde que se pasó de la placa a al matraz de 100 ml.

Campo microscópico Número de bacterias

Campo N° 1 2
Campo N° 2 2
Campo N° 3 5
Campo N° 4 4
Campo N° 5 6
Campo N° 6 4
Σ 23
3,83

  Número de células por campo (T)

T= Promedio de células* 16

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= 3,83 * 16
= 61,3 células por campo
 Número de células por mililitro (N°cél/ml)

N°cél/ml= T* 25* 104 * Inverso de la dilución

1
= 61,3* 25* 104 *
10−3
=1,53 ×1010 células por mililitro

 Calcular la tasa especifica de crecimiento

 Calcular el número de células inicial en el matraz de 100 ml

 El inoculo inicial fue de 4 ml proporcional a la concentración del tubo

número 6 de Mcfarland ( 1,8 ×109 células )

C1 ×V 1=C 2 × V 2

9
4 ml ×1,8 ×10 =100 ×C 2

7
C2 =7,2× 10 cel/ml

 Usando la fórmula para hallar la tasa especifica de crecimiento:

xf
ln ⁡( )=µ× t
xi

10
1,53 ×10
ln ⁡( )=µ × 72h
7,2× 107

µ=0.074 h-1

 Integrando datos del recuento

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Tabla N°2. Datos integrados de los recuentos en cámara de Neubauer de

Pseudomonas a las 72 y 96 horas

Tiempo Recuento Volumen

(h) (Cel/ml) (ml)
0 7,2× 107 100 (en matraz)
72 1,53 × 109 100 (en biorreactor)
96 1,44 × 1010 1000

Tabla N°3. Datos corregidos del recuento de Pseudomonas sp

N X Y logY X2 XlogY Yc AntilogYc

(Yc=mx+b)
1 0 7,2*107 7.857 0 0 7,79 2,4.103
2 72 1,53*109 9.185 5184 661.298 9,374 1,2.104
3 96 1,44*101O 10,158 9216 975.168 9,902 2.104
Total: 3 168 27.199 14400 1636.466

 Hallando la pendiente

n ( XlogY ) − ƩX ( ƩlogY )
m=
n ( Ʃ x 2 )−( Ʃx )2
3 (1636.466 )−168 ( 27,199 )
m=
3 ( 14400 )− (168 )2
m=0.0227
 Hallando la tasa especifica de crecimiento por el factor de corrección

µ=m× 2,303
µ=0.0227 ×2,303
−1
¿ 0.0522 h

 Hallando la tasa especifica de crecimiento a través de la fórmula

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xf
ln ⁡( )=µ× t
xi

1.44 × 1010
ln ( 7.2× 107) =µ× 96

µ=0.055 h-1
 Hallando el intercepto

ƩlogY ( Ʃ x2 ) − Ʃx ( ƩxlogY )
b= 2
n ( Ʃ x2 ) −( Ʃx )

27,199 ( 14400 )−168 ( 27,199 )

b=
3 (14400 )−( 168 )2

b=7,79

VI. Comentario

El parámetro de la tasa específica de crecimiento nos indica el incremento en el número de

células (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En la práctica a las 72 horas se obtuvo un µ de
0,074h-1 y a las 96 horas un valor de 0,055h-1; esto nos indica que las bacterias se adaptaron
perfectamente a su medio y que se reproducen con mayor rapidez. Tomando como dato el último
resultado obtenido en la tasa de crecimiento podemos decir que cada 0,055 horas la cantidad de
biomasa de Pseudomonas se duplica.

Tomando en cuenta la tabla N°2, podemos ver que la Pseudomonas incrementa su crecimiento
a pesar de estar en el mismo volumen, es decir 100 ml. Este incremento en la tasa específica de
crecimiento se debe a que en su primer medio la bacteria estuvo creciendo en un medio matraz, el
cual no le brinda todas los requerimientos que necesita para su óptimo crecimiento como le
brindaría un biorreactor.

En los tiempos de 72 a 96 horas vemos que Pseudomonas pudo adaptarse y crecer en el

medio de 1000 ml; por lo que nuestro sistema de tren de fermentación para la obtención un
inóculo hasta las 96 horas va por buen camino. Esto se demuestra en la gráfica N°2 donde se
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tomaron a los datos corregidos de la tabla N° 3 y vemos un óptimo desarrollo en el crecimiento

de Pseudomonas, lo cual concuerda con los datos obtenidos en la práctica.

VII. Conclusiones

 D
 D
VIII. Referencias bibliográficas

1. Mauro RLA, Mc Comark WP, Calabró A, Rodriguez TJ. Conocimiento Didáctico del
Contenido (CDC) en la enseñanza universitaria de Biotecnología. El caso de la velocidad
específica de crecimiento microbiano (μ). Rev. Eureka sobre Enseñanza y Divulgación de
las Ciencias. 2012; 9 (3): 353−360

2. Sanchez M. Procesos prefermentativos: Inóculo y Medios de Cultivo. Madrid:

Universidad Miguel Hernandez de Elche, Producción vejetal y microbiología; 2013.

3. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., y Van, K. Modeling of the

Bacterial Growth Curve. Rev Applied and Environmental Microbiologgy. 1990; 56(6),
1875 – 1881

4. Vanegas DM, Ramírez ME. Correlación del Crecimiento de Pseudomonas fluorescens en

la Producción de Polihidroxialcanoatos de Cadena Media (PHAMCL) mediante Modelos
Primarios de Gompertz, Logístico y Baranyi. Rev. Información tecnológica. 2015; 27 (2):
87-96.

5. Carrillo, M.L.; Zavala, D.; Alvarado, B. Modelado del Efecto de la Temperatura,

Actividad de agua y pH sobre el crecimiento de Rhizopus oryzae. Información
Tecnológica. 2007; 18(4), 57–62

IX. Anexos

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