DETERMINACION DE LA

PROTEINA
1.- INTRODUCCION
El contenido total de proteína en los alimentos está conformado por una mezcla compleja de
proteína. Estas existen en una combinación de carbohidratos o lípidos, que pueden ser físicas o
químicas .Actualmente todos los métodos para determinar el contenido proteico totales los
alimentos son de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento y pesado directo
de la proteína pero dicho método se utiliza solo a veces en investigaciones bioquímicas a que
es dificultoso y poco práctico.

En 1883 el investigador danés Johan kjeldahl desarrollo el método más usado en la actualidad
para el análisis de proteína (método kjeldahl) mediante la determinación del nitrógeno
orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros compuestos orgánicos de los
alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno total se
convierte mediante esta digestión en sulfato de amonio. La solución obtenida de la digestión se
hace alcalina y se destila arrastrándose con vapor para liberar el amoniaco que es atrapado en
una solución de ácido y es titulado.

El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteínas cruda del
alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no proteicos.

2.- OBJETIVOS
Objetivo general

 Determinar el porcentaje de proteína de una muestra de almendra.

Objetivo especifico

 Determinar la cantidad de nitrógeno total de la muestra de almendra, para luego

mediante un factor hallar la cantidad de proteína en la muestra analizada.
 Conocer y aplicar el método de kjeldahl en la práctica de laboratorio, siendo este un
método indirecto.

3-. FUNDAMENTO TEORICO

El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla
compleja de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos,
que puede ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el
contenido proteico total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método
absoluto es el aislamiento y pesado directo de la proteína pero dicho método se
utiliza sólo a veces en investigaciones bioquímicas debido a que es dificultoso y poco
práctico.

Las proteínas naturales puras poseen poco sabor. Durante el proceso de calentamiento
(ebullición, panificación, asado) las cadenas laterales de aminoácidos se degradan o
 interactúan con otros componentes de los alimentos (ejemplo, la lisina con los azúcares
reductores) para conferir sabores típicos. El calentamiento excesivo puede, por otro
lado, reducir el valor nutritivo.

MÉTODO KJELDAHL:

La materia orgánica es digerida por la acción del H2SO4 concentrado, convirtiéndose

en CO2 y H2O; además reduce el nitrógeno a amonio, el cual pasa a ser fijado por el
ácido como sulfato de amonio, una sal de gran estabilidad. La reducción del material
nitrogenado hasta amonio, se debe a que parte del H2SO4 es simultáneamente
reducido a SO2, que se comporta como un fuerte reductor.

La digestión de la muestra es la parte más difícil de la determinación, esta se acelera

mediante la adición de catalizadores como el mercurio metálico, el óxido rojo de
mercurio (HgO), el sulfato cúprico (CuSO4), el selenio, el permanganato de potasio
(KMO4) o una mezcla de estos. El sulfato de sodio o de potasio se adiciona a la mezcla
con la finalidad de aumentar el punto de ebullición y disminuir el tiempo de digestión.
Cuando la totalidad de la materia orgánica ha sido digerida, se libera el amoníaco por
descomposición del sulfato de amonio con un álcali fuerte (NaOH) y luego se separa
por destilación y recolección en un volumen de ácido bórico, como borato de amonio.
El amonio se determina por titulación con solución valorada de HCl 0.1 N en presencia
de un indicador mixto compuesto por una mezcla de rojo de metilo, el cual en medio
ácido se presenta de color morado y en medio alcalino de color verde.
El método Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utilizó
permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación (digestión), sin
embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se
descartó. En la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre pentahidratado
CuSO4.5H2O como catalizador.

MÉTODOS PARA CUANTIFICAR PROTEÍNAS

1.- ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA)

 Rango de concentración: 20-2000 ug/ml
 Características:
 Desarrollado en 1985
 Ensayo colorimétrico donde la absorbancia será proporcional a la
concentración de proteína presente en la muestra
 Reacción en dos pasos:
 Formación de complejos proteína-iones de cobre
 Formación de un quelato Cu-BCA que da lugar a una intensa
coloración púrpura que absorbe a 562nm
 Es un método recomendado en el caso de muestras que contengan >5%
de detergentes y/o agentes desnaturalizantes como urea o cloruro de guanidinio.
 Limitaciones:
 Las muestras que contengan sustancias que interaccionan con el cobre,
como por ejemplo el amoníaco, al igual que el EDTA, los azúcares reductores o los
lípidos, pueden interferir con este ensayo.

2.- ABSORCIÓN ULTRAVIOLETA (UV)

 Rango de concentración: 0,1-100 ug/ml
 Características:
 Este método, mediante la medición de la absorción característica que
presentan el triptófano y la tirosina a 280nm, estima la cantidad de proteína presente
en la muestra.
 Limitaciones:
 Es incompatible con los métodos de extracción de proteínas que
emplean detergentes y/o agentes desnaturalizantes.
 No es un método específico para proteínas, ya que otros compuestos que
podría haber en la muestra también absorben a 280nm (como alcoholes o ácidos
nucleicos, entre otros)

3.- ENSAYO DE BRADFORD O AZUL COOMASIE

 Rango de concentración: 20-2000 ug/ml
 Características:
 Método descrito en 1976
 Se caracteriza por ser un método rápido, sencillo y compatible con los
agentes reductores utilizados para estabilizar las proteínas en solución.
 La tinción azul Coomasie cargada negativamente, se une a proteínas con
carga positiva.
 Se une principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina,
histidina y fenilalanina.
 La tinción en solución es de color rojo y absorbe a 465nm, mientras que
al unirse a los aminoácidos básicos de una proteína se vuelve azul y absorbe a 595nm.
 La medición de la absorbancia se compara con los valores de una curva
estándar para determinar la concentración de proteína de la muestra.
 Limitaciones:
 No es válido para detectar proteínas de <3kDa
 Es incompatible con detergentes como el SDS o el Triton X-100

4.- ENSAYO DE LOWRY

 Rango de concentración: 10-1000 ug/ml
 Características:
 Uno de los métodos para cuantificar proteínas más utilizado, fue
desarrollado en 1951
 Es un ensayo muy sensible y preciso
 Al igual que el ensayo BCA, se da una reacción en dos pasos:
 Formación de complejos Cu-N (presente en la proteína)
 Los complejos de tirosina y triptófano reaccionan con el reactivo
Folin-Ciocalteau, dando lugar a un color azul verdoso que absorbe entre 650 y 750nm.
 La medición de la absorbancia se compara con los valores de una curva
estándar para determinar la concentración de proteína de la muestra.
 Limitaciones:
 Es incompatible con determinados reactivos químicos de uso común
como el Tris, EDTA, DDT, 2-mercaptoetanol, carbohidratos, etc.

4-. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

4.1-.materiales, reactivos y equipos

Materiales

 Pizeta
 Espátula
 Pipeta graduada
 Pipeta volumétrica
 Pera (propipeta)
 Bureta
 Papel (para las pesadas )
 Balón de kjeldahl
 Matraz Erlenmeyer
 Soporte universal
 Vaso precipitado

Reactivos:

 Muestra de almendra 0,2049 g

 Ácido sulfúrico concentrado 0,0997N
 Hidróxido de sodio0,1078 N
 Sulfato de cobre
 Sulfato de sodio
 Rojo de metilo
 Agua destilada y NaOH al 34%
Equipos:

 Destilador de kjeldahl
 Balanza analítica
 Scrubber (trampa para gases )
 Placa calefactora
 Micro digestor kjeldahl
 Balanza técnica

4.2 PROCEDIMIENTO:
Digestión:
 Se pesó la muestra de almendra 0,2049 g en una balanza analítica sobre un
trozo de papel y se colocó en un balón kjeldahl .
 Se pesó 0,2 g de CuSO4 (catalizador) en una balanza técnica y 5g de Na2SO4
anhidro para elevar el punto de ebullición del H2SO4, se añade todo lo anterior
al mismo balón.
 Se añade al mismo balón 10ml de H2SO4( concentrado)bajo campana
 Se añade todo lo anterior menos la muestra en otro balón es para que nos sirva
de blanco.
 Se procede con la digestión hasta una solución clara de nuestra muestra
almendra. Se colocó todos los balones en un digestor kjeldahl con scrubber o
neutralizador.(trampa para gases tóxicos ).
 Durante la digestión se desprende gases de los balones y una vez completa la
digestión se ve una coloración verde en el balón.
 Al terminar la digestión se apagó el equipo y se dejó enfriar un poco los balones
 REACCION :
CuSO 4
MUESTRA de almendra +H2SO4 (NH4)2SO4+CO2↑+H2O+…………
Na 2 SO 4

Destilación:

 Se realizó la destilación en un sistema cerrado, diluyendo con agua destilada dejando

caer poco a poco sobre las paredes del balón.
 Antes de destilar se preparó el matraz para recibir el destilado
 Se neutralizo con NaOH concentrado al 34% hasta que cambio verde claro a una
coloración de café oscuro.
 Se procedió con la destilación durante 7 minutos en un sistema cerrado por arrastre
de vapor de agua para no perder muestra.

REACCION:

(NH4)2SO4+2 NaOH →2 NH4OH +Na2SO4

2 NH4OH +H2SO4 → (NH4)2SO4+2H20

Titulación (retro valoración):

 Se añadió en el matraz con el destilado 8 gotas del indicador (rojo de metilo).

 Posteriormente se procedió con la titulación de NaOH 0,1067N hasta obtener una
coloración amarilla.
 Se anotó el volumen gastado durante la titulación.

REACCION:

H2SO4 + 2Na2SO4 + 2 H20

5 -, DATOS:

N° Muestra V (ml)
NaOH
3 -.muestra de 0,20 49 43,2
almendran
Blanco -------- 46,3

NaOH = 0,1078
H2SO4 =0,0997 N

6 CALCULOS:

(VNaOH blanco−NaOH muestra )∗NNaOH∗1,4

N (%)=
PESO DE MUESTRA

( 46,3−43,2 )∗0,1078 N∗1,4

N (%) = 0,2049

N (%) =2,2833 nitrógeno

N (%)=2,2833*6,25

N (%)=14,27 % de proteína un aproximado

7-. RESULTADOS
Por lo tanto la proteína aproximada de la almendra es:

N (%)=14,27 % de proteína un aproximado

Por lo que podemos decir que hay un 14,27 % lo que significa 15,50 g de
proteína por 100g de muestra de almendra se podría decirse que la
almendra es un alimento nutritivo.
8-.OBSERVACIONES
 Comparado los datos de la práctica que nos salió 14, 27 % con los
datos teóricos de la proteína de la almendra que es 17,43 % de
proteína de la tabla, se podría decir que afecto un poco el hecho de
pesar menos muestra, para no tardar las 3 a 4 horas en el proceso
de la digestión.
 Si bien el factor común que se utiliza para la determinación de
proteína es 6,25se han realizado estudios para tener factores más
exactos para cada tipo de alimento, pero para nuestro caso aún no
se realizó la determinación del factor correcto, pero de todas formas
el factor oscila entre los valores de 5,55 a 6,68,donde podemos
decir que no hay diferencia. Lo recomendable seria utilizar un factor
propio de cada alimento.

8.1- las conclusiones de la práctica son:

 Se determinó la cantidad de nitrógeno total en la muestra de almendra por la
técnica de kjeldahl, multiplicando por un factor común se pudo obtener la
cantidad aproximada de proteína que tiene la almendra lo cual es un alimento
rico en proteína.
 El método de kjeldahl está basado en la combustión húmeda de la muestra,
calentando con ácido sulfúrico concentrado en presencia de catalizado por
 Na2SO4 Y CuSO4 para efectuar la reducción del nitrógeno orgánico de la
muestra a amoniaco, el cual es retenido en solución como sulfato de amonio.
la solución de digestión se hace alcalina y se destila o se arrastra con vapor
para liberar el amonio que está atrapado y titulado.

9-. CUESTIONARIO:
1- además del método de kjendahl, que otros métodos son recomendado para el
análisis en proteínas?

Método de Dumas

Fundamento

Se caracteriza por pirolisis completa de la muestra y medición del contenido de

nitrógeno de los gases de combustión. El nitrógeno puede ser medido con manómetro
después de absorber el dióxido de carbono en una solución alcalina o por
conductividad térmica en métodos automatizados.

Ventaja

Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el método de Kjeldahl en

análisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con valores levemente mayores.

Desventajas

Incluye nitrógeno inorgánico.

Requiere pequeñas cantidades de muestra 5-50 mg, finamente dividida y homogénea

para minimizar el error de muestreo. Este método no puede aplicarse a material
húmedo por lo que debe efectuarse un secado previo.

Métodos radioquímicas

Se han descrito dos métodos:

a) Activación neutrónica

Fundamento Se irradia una cantidad pesada de muestra con neutrones lo que produce
el paso de l4N a 13N. Este positrón tiene una vida media de 10 minutos y emite
radiaciones gamma las que se registran en un contador de centelleo . Las cuentas se
relacionan con el contenido de nitrógeno de la muestra.

Ventajas

Simple; rápido.
Sin problemas de contaminación.
Los valores encontrados presentan
buena correlación con el método de
Kjeldahl.
Desventaja

El costo de infraestructura es muy elevado.

b) Activación protónica

Fundamento

Similar al anterior con la variante de que la muestra se irradia con protones y se

efectúa la conversión de 14N a 14O, un isótopo que decae con la emisión de un protón y
de radiaciones gamma las que son registradas y relacionadas con el contenido de
nitrógeno de la muestra.

Método de Biuret

Principio químico

La reacción se caracteriza por una coloración púrpura cuando los iones cúpricos son
compleja dos por los enlaces peptídicos a pH alcalino. El matiz del color depende del
tipo de proteína y su intensidad depende del contenido de proteína presente.

Reactivo utilizado

Solución alcalina conteniendo iones cúpricos compleja dos con tartrato de sodio y
potasio.

Lectura

550 nm, a 263 nm se aumenta la sensibilidad en 10 veces.

Desventaja

Se ha encontrado poca aplicación en análisis de alimentos debido a la presencia de

interferentes como azúcares reductores que reducen el ion cúprico en medio alcalino
produciendo resultados insatisfactorios. Ejemplo: leche.

Método "dye-binding"

Principio químico

Se caracteriza por la formación de un coágulo de proteína, coloreado e insoluble

producto de la reacción de la proteína con una solución coloreada de ácido sulfónico a
pH 2. El anión coloreado se une por asociaciones electrostáticas a los sitios básicos
de la proteína, por ejemplo a los grupos M-amino de lisina, guanidina de arginina,
imidazol de histidina y aminos terminales. Además se producen atracciones
intermoleculares por interacciones hidrofóbicas entre la proteína y la mitad no iónica
del anión y entre el anión unido a proteína y la mitad no iónica del anión en solución.

El coágulo se separa por filtración y se mide colorimétricamente el exceso de tintura

en el sobrenadante. Esta medida se relaciona con el contenido de proteína.

Lectura
A595nm

Consideraciones

El método es empírico por lo que se debe buscar la concentración de tintura ideal que
sature la proteína y forme el coágulo pero que no pierda sensibilidad.

Ventajas

Útil en análisis de rutina de muestras similares.

Económico y rápido.
Preciso como el método de Kjeldhal.
Usado como método de referencia.

Desventajas

Dificultad en encontrar tinturas puras.

Des uniformidad en la calidad de las tinturas de un lote de fabricación a otro, por lo

que se requiere la calibración del método con cada lote.

No es aplicable a alimentos que varíen su contenido en grupos aminos (proteólisis,

pardea miento).

c) Método de destilación alcalina

Fundamento

La hidrólisis de las amidas en medio alcalino fuerte da origen a amoníaco el cual es

destilado y su valor es relacionado con el contenido de proteína.

Se ha encontrado que el rendimiento de amonio es altamente reproducible para una

proteína dada.

Método de Lowry

Reactivo

Ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico

Fundamento

Cuando se agrega reactivo de Folin a una proteína, ésta se reduce a un complejo azul
de molibdeno por la oxidación de los aminoácidos tirosina, triptófano, cistina, cisterna e
histidina.

Lectura

A750 nm

Ventajas

Alta sensibilidad y simple de operar.

Desventajas

La respuesta del color varía de acuerdo al tipo de proteína.

La intensidad del color no es estrictamente proporcional a la concentración de
proteína.
Los iones potasio, magnesio, EDTA e hidratos de carbono interfieren en la reacción.

Espectroscopia infrarroja

Fundamento

Se aprovecha la absorción del grupo amida del enlace peptídico a 6,46 Tm.

Ventajas

Rápido, análisis de multicomponentes No destructivo.

Desventajas

Interferido por agua.

Proceso de calibración complejo.

2-. Se puede utilizar el método de kjeldahl para todo tipo de alimentos?

E l método de kjeldahl es el más usado para determinar el porcentaje de proteína

en los alimentos cualquier alimento que contenga proteína se puede analizar por
el método de kjeldahl por más mínimo que tenga de proteína aunque este método
es indirecto porque estamos calculando la cantidad de nitrógeno totales de la
muestra de un alimento y multiplicando por un factor para saber el porcentaje de
proteína. En conclusión este método puede determinar el porcentaje de proteína
de cualquier alimento que tenga proteína y que no tenga compuestos
nitrogenados no proteicos que dificulta su cálculo para la obtención de proteína
tal es el caso del café o él te o la Coca-Cola que tienen cafeína. Aunque sería
mejor utilizar la siguiente relación que se puede calcular mediante el método de
kjeldahl estos productos que tiene cafeína con la siguiente ecuación.

%N *3,464=cafeína anhidra

Donde después calculando la proteína se descuenta la cantidad de cafeína y asi se tiene

la cantidad exacta de proteína.

Desventajas del método de Kjeldhal

Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.

Uso de catalizadores tóxicos o caros.
Elección del factor de conversión.