PROTOCOLO DE VALIDACIÓN DE Código:

METODOLOGIAS ANALÍTICAS PVAL-0082

VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA ANALÍTICA

PARA LA IDENTIFICACIÓN Y VALORACIÓN DE
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TRAZAS DE IMIPENEM EQUIPOS DESPUES DE SU
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Analista / Coordinador de Jefe de Estabilidades y

Gerente Control de Calidad
Estabilidades y validaciones validaciones

1. OBJETIVO

Establecer una evidencia documentada de que el método empleado para la determinación de

trazas de Imipenem en equipos de producción después de la limpieza proporciona resultados
reproducibles y confiables.

2. ALCANCE

El presente protocolo tiene como alcance la validación de la metodología analítica para la

determinación de trazas de Imipenem en equipos de producción después de la limpieza.

Los parámetros y criterios de aceptación a evaluar se seleccionan teniendo en cuenta la

finalidad de la validación de la metodología analítica en la clasificación establecida en Vitalis
S.A.C.I mediante el procedimiento para validación de metodologías analíticas V-CC-P-047.

3. REFERENCIAS
Tabla 1. Referencias
CÓDIGO TITULO
PROCEDIMIENTO PARA LA VALIDACION DE METODOLOGIAS
V-CC-P-047
ANALITICAS
ICH: VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES: TEXT AND
Q2(R1)
METHODOLOGY
USP Vigente <1225> VALIDACIÓN DE PROCEDIMIENTOS FARMACOPÉICOS

4. DESCRIPCIÓN

Se realiza la validación de la metodología analítica para la identificación y cuantificación de

trazas de Imipenem en equipos de producción después de la limpieza, mediante
cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC).

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4.1. CONDICIONES INSTRUMENTALES

Tabla 2. Condiciones Instrumentales

Requerimiento Descripción
Phenomenex Luna® 5 µm C18(2) 100 Å 250 mm x 4,6 mm
Columna
o su equivalente
Temperatura de la
35 °C
columna
Flujo 1,0 mL/minuto
Longitud de onda 300 nm
Volumen de inyección 10 µL
Fase Móvil Ver numeral 4.2.
Tiempo de Retención 3.7 minutos ± 0.5 minutos

4.2. FASE MÓVIL

Solución Buffer pH 6,8:

Preparar una solución de fosfato monobásico de potasio (KH2PO4) 0.135 g/L en agua y
ajustar a pH 6,8 ± 0,1 con Hidróxido de sodio concentrado.

Fase móvil:
Preparar una mezcla de Solución Buffer pH 6,8 y Acetonitrilo en proporción 95:5
respectivamente; mezclar, filtrar por membrana de 0,45 µm y desgasificar.

4.3. DILUENTE

Emplear solución amortiguadora ( ver numeral 4.2)

4.4. SOLUCIÓN ESTÁNDAR

Solución Estándar de Imipenem: Preparar una solución de concentración 25.88 µg/mL de

Imipenem Monohidrato USP. Disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por membrana
de 0,45 µm. (Concentración 24.18 µg/mL de Imipenem Base).

4.5. SOLUCIÓN BLANCO

Tomar un hisopo y lavarlo con solvente de muestreo (Agua), mínimo 2 veces, sacudiéndolo
cada vez para retirar el exceso de líquido. Adicionar en el vial 4 mL de solución
amortiguadora. Introducir la cabeza del hisopo en la boca del vial, cortando con tijeras el

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mango del hisopo, por encima de la cabeza y tapar. Agitar durante 60 segundos el vial,
evitando la pérdida de contenido. Filtrar por membrana de 0,45 µm.

5. PARAMETROS A EVALUAR

5.1. APTITUD DEL SISTEMA

5.1.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Solución Estándar de Imipenem: Preparar una solución de concentración 25.88 µg/mL de

Imipenem Monohidrato USP. Disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por membrana
de 0,45 µm. (Concentración 24.18 µg/mL de Imipenem Base).

5.1.2. PROCEDIMIENTO

Inyectar por sextuplicado, volúmenes iguales de solución estándar. Registrar los

cromatogramas.

5.1.3. CRITERIO DE ACEPTACIÓN

Tabla 3. Criterio de aceptación aptitud del sistema

PARÁMETRO ESPECIFICACIÓN
Asimetría ≤ 2,0
Coeficiente de variación (%) ≤ 2,0

5.2. SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD

5.2.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Solución Estándar de Imipenem: Preparar una solución de concentración 25.88 µg/mL de

Imipenem Monohidrato USP. Disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por membrana
de 0,45 µm. (Concentración 24.18 µg/mL de Imipenem Base).

5.2.2. PROCEDIMIENTO

Inyectar por duplicado Buffer fase móvil, el Acetonitrilo, el solvente de muestreo (agua), La
solucion de estandar, solucion de Cilastatina sal de amonio el Bactiwell 0,2%, el hipoclorito
de sodio 2% el TEGO 1%, Etanol 70% y el Divosan 0,5%. a condiciones normales de
análisis.

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5.2.3. CRITERIO DE ACEPTACIÓN

Tabla 4. Criterio de aceptación Selectividad

PARAMETRO ESPECIFICACIÓN
No debe existir interferencia entre la respuesta del detector
debida a la presencia de imipenem y la señal originada por
SELECTIVIDAD Y el Buffer fase móvil, el Acetonitrilo , el solvente de muestreo
ESPECIFICIDAD (agua), solucion de Cilastatina sal de amonio el Bactiwell
0,2%, el hipoclorito de sodio 2% el TEGO 1%, Etanol 70% y
el Divosan 0,5%.

5.3. PRECISIÓN DEL SISTEMA

5.3.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Solución Estándar de Imipenem: Preparar una solución de concentración 25.88 µg/mL de

Imipenem Monohidrato USP. Disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por membrana
de 0,45 µm. (Concentración 24.18 µg/mL de Imipenem Base).

5.3.2. PROCEDIMIENTO

La Precisión del sistema se debe establecer mediante seis inyecciones repetidas de una
solución del principio activo al 100%.

5.3.3. CRITERIO DE ACEPTACIÓN

Tabla 5. Criterio de aceptación Precisión del sistema

PARÁMETRO ESPECIFICACIÓN
Coeficiente de variación (%) ≤ 2,0

5.4. PRECISIÓN DEL MÉTODO

5.4.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Solución Estándar de Imipenem: Preparar una solución de concentración 25.88 µg/mL de

Imipenem Monohidrato USP. Disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por membrana
de 0,45 µm. (Concentración 24.18 µg/mL de Imipenem Base).

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Solución de siembra: Preparar una solución de concentración 103,53 µg/mL de Imipenem

Monohidrato USP. Disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por membrana de 0,45 µm.
(Concentración 96,7 µg/mL de Imipenem Base).

5.4.2. PROCEDIMIENTO

Tomar 6 placas de la superficie acero, 6 placas de la superficie de pintura epóxica, 6 placas

de la superficie de plástico y 6 placas de la superficie de vidrio; enriquecer cada una con 1,0
mL de la solución de siembra, adicionando gota a gota y repartiendo de la manera más
uniforme posible sobre la superficie. Cada placa queda enriquecida con 96,7 µg en 25 cm2
(3,9 µg/cm2) de Imipenem que corresponde a la cantidad máxima permitida. Dejar secar las
placas al ambiente.

Tomar un hisopo por cada placa y lavarlo con el solvente de muestreo (Agua) mínimo 2
veces, sacudiéndolo cada vez para retirar el exceso de líquido. Con el hisopo humedecido,
realizar el muestreo de la superficie según la estandarización de la técnica de muestreo.

Adicionar en el vial 4 mL de Agua. Introducir la cabeza del hisopo en la boca del vial,
cortando con tijeras el mango del hisopo, por encima de la cabeza y tapar. Agitar 60
segundos el vial, evitando la pérdida de contenido. Filtrar por membrana de 0,45 µm.

Preparar estándar de Imipenem 24,18 µg/mL, para cuantificar las muestras.

Se deben realizar 6 inyecciones de solución estándar y 3 inyecciones de cada placa

muestreada. Calcular el porcentaje de recuperación con base en la comparación entre las
concentraciones halladas con el estándar y las concentraciones adicionadas.

5.4.3. CRITERIO DE ACEPTACIÓN

Tabla 6. Criterio de aceptación Precisión del Método.

PARÁMETRO ESPECIFICACIÓN
Coeficiente de variación (%) ≤ 10,0

5.5. PRECISIÓN INTERMEDIA

5.5.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

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Solución Estándar de Imipenem: Preparar una solución de concentración 25.88 µg/mL de

Imipenem Monohidrato USP. Disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por membrana
de 0,45 µm. (Concentración 24.18 µg/mL de Imipenem Base).

Solución de siembra: Preparar una solución de concentración 103,53 µg/mL de Imipenem

Monohidrato USP. Disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por membrana de 0,45 µm.
(Concentración 96,7 µg/mL de Imipenem Base).

5.5.2. PROCEDIMIENTO

La precisión intermedia se debe determinar por 2 analistas. Se debe preparar una solución
estándar, sembrar 6 placas por cada superficie (acero, pintura epóxica, plástico y vidrio) por
cada analista.

Tomar 6 placas de la superficie acero, 6 placas de la superficie de pintura epóxica, 6 placas

de la superficie de plástico y 6 placas de la superficie de vidrio; enriquecer cada una con 1,0
mL de la solución de siembra, adicionando gota a gota y repartiendo de la manera más
uniforme posible sobre la superficie. Cada placa queda enriquecida con 96,7 µg en 25 cm2
(3,9 µg/cm2) de Imipenem que corresponde a la cantidad máxima permitida. Dejar secar las
placas al ambiente.

Tomar un hisopo por cada placa y lavarlo con el solvente de muestreo (Agua) mínimo 2
veces, sacudiéndolo cada vez para retirar el exceso de líquido. Con el hisopo humedecido,
realizar el muestreo de la superficie según la estandarización de la técnica de muestreo.

Adicionar en el vial 4 mL de Agua. Introducir la cabeza del hisopo en la boca del vial,
cortando con tijeras el mango del hisopo, por encima de la cabeza y tapar. Agitar 60
segundos el vial, evitando la pérdida de contenido. Filtrar por membrana de 0,45 µm.

Preparar estándar de Imipenem 24,18 µg/mL, para cuantificar las muestras.

Se deben realizar 6 inyecciones de solución estándar y 3 inyecciones de cada placa

muestreada. Calcular el porcentaje de recuperación con base en la comparación entre las
concentraciones halladas con el estándar y las concentraciones adicionadas.

5.5.3. CRITERIO DE ACEPTACIÓN

Tabla 7. Criterio de aceptación Precisión Intermedia

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PARÁMETRO ESPECIFICACIÓN
Coeficiente de variación (%) ≤ 15,0

5.6. LINEALIDAD DEL SISTEMA

5.6.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Solución madre de estándar: Preparar 100 mL una solución de Imipenem de concentración

241,8 µg/mL

La linealidad del sistema se debe determinar mediante la preparación de soluciones

independientes del principio activo en concentraciones del 60%, 80%, 100%, 120% y 140%,
una solución por cada nivel, según la Tabla 8.

Tabla 8. Niveles de concentración para Linealidad del Sistema.

CONCENTRACIÓN PREPARACIÓN
Tomar una alícuota de 7 mL de la solución madre de estándar y
140% (33,85 µg/mL) llevar a un balón de 50 mL, disolver y llevar a volumen con diluente.
Filtrar por membrana de 0,45 µm.
Tomar una alícuota de 6 mL de la solución madre de estándar y
120% (29,02 µg/mL) llevar a un balón de 50 mL, disolver y llevar a volumen con diluente.
Filtrar por membrana de 0,45 µm.
Tomar una alícuota de 5 mL de la solución madre de estándar y
100% (24,18 µg/mL) llevar a un balón de 50 mL, disolver y llevar a volumen con diluente.
Filtrar por membrana de 0,45 µm.
Tomar una alícuota de 4 mL de la solución madre de estándar y
80% (19,34 µg/mL) llevar a un balón de 50 mL, disolver y llevar a volumen con diluente.
Filtrar por membrana de 0,45 µm.
Tomar una alícuota de 3 mL de la solución madre de estándar y
60% (14,51, µg/mL) llevar a un balón de 50 mL, disolver y llevar a volumen con diluente.
Filtrar por membrana de 0,45 µm.

5.6.2. . PROCEDIMIENTO

Se debe realizar 3 réplicas de cada nivel de concentración e inyectar por triplicado.

5.6.3. CRITERIO DE ACEPTACIÓN

Tabla 9. Criterio de aceptación Linealidad del Sistema

PARÁMETRO ESPECIFICACIÓN
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r2 ≥ 0,998
Intercepto t exp < t tabla
Pendiente t exp > t tabla
Correlación (r) t exp > t tabla
Regresión F exp > F tabla
Linealidad F exp < F tabla

5.7. EXACTITUD (PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN)

5.7.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Solución Estándar de Imipenem: Preparar una solución de concentración 25.88 µg/mL de

Imipenem Monohidrato USP. Disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por membrana
de 0,45 µm. (Concentración 24.18 µg/mL de Imipenem Base).

Solución de siembra 80%: Preparar una solución de concentración 82,83 µg/mL de

Imipenem Monohidrato USP. Disolver con solución amortiguadora, no más de 10 mL y llevar
a volumen con Metanol. Filtrar por membrana de 0,45 µm. (Concentración 77,36 µg/mL de
Imipenem Base).

Solución de siembra 100%: Preparar una solución de concentración 103,53 µg/mL de

Imipenem Monohidrato USP. Disolver con solución amortiguadora, no más de 10 mL y llevar
a volumen con Metanol. Filtrar por membrana de 0,45 µm. (Concentración 96,7 µg/mL de
Imipenem Base).

Solución de siembra 120%: Preparar una solución de concentración 124,24 µg/mL de

Imipenem Monohidrato USP. Disolver con solución amortiguadora, no más de 10 mL y llevar
a volumen con Metanol. Filtrar por membrana de 0,45 µm. (Concentración 116,04 µg/mL de
Imipenem Base).

Blanco: Tomar un hisopo y lavarlo con solvente de muestreo (Agua), mínimo 2 veces,
sacudiéndolo cada vez para retirar el exceso de líquido. Adicionar en el vial 4 mL de solución
amortiguadora. Introducir la cabeza del hisopo en la boca del vial, cortando con tijeras el
mango del hisopo, por encima de la cabeza y tapar. Agitar durante 60 segundos el vial,
evitando la pérdida de contenido. Filtrar por membrana de 0,45 µm.

5.7.2. PROCEDIMIENTO

Tomar 6 placas de la cada superficie y enriquecer cada una con 1,0 mL de la solución de
siembra al 80%, cada placa queda enriquecida con 77,36 µg de Imipenem. Tomar otras 6

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placas por cada superficie y enriquecer cada una con 1,0 mL de la solución de siembra al
100%, cada placa queda enriquecida con 94,7 µg de Imipenem. Tomar otras 6 placas por
cada superficie y enriquecer cada una con 1,0 mL de la solución de siembra al 120%, cada
placa queda enriquecida con 116,04 µg de Imipenem; adicionando gota a gota y repartiendo
de la manera más uniforme posible sobre la superficie. Dejar secar las placas al ambiente.

Tomar un hisopo por cada placa y lavarlo con el solvente de muestreo (Agua) mínimo 2
veces, sacudiéndolo cada vez para retirar el exceso de líquido. Con el hisopo humedecido,
realizar el muestreo de la superficie según la estandarización de la técnica de muestreo.

Adicionar en el vial 4 mL de solución amortiguadora, introducir la cabeza del hisopo en el vial,

cortar con tijeras el mango del hisopo, por encima de la cabeza y tapar. Agitar durante 60
segundos el vial, evitando la pérdida de contenido. Filtrar por membrana de 0,45 µm.

Se tendrén 6 placas de cada superficie , pintura epóxica, superficie de plástico, superficie de

acero y superficie vidrio.

Se debe realizar 6 inyecciones de solución estándar y 3 inyecciones de cada placa

muestreada. Calcular el porcentaje de recuperación con base en la comparación entre las
concentraciones halladas con el estándar y las concentraciones adicionadas.

5.7.3. CRITERIO DE ACEPTACIÓN

Tabla 10. Criterio de aceptación Exáctitud

PARÁMETRO ESPECIFICACIÓN
Recuperación promedio (%) ≤ 70

5.8. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN Y LÍMITE DE DETECCIÓN

5.8.1. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Solución Estándar de Imipenem: Preparar una solución de concentración 25.88 µg/mL de

Imipenem Monohidrato USP. Disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por membrana
de 0,45 µm. (Concentración 24.18 µg/mL de Imipenem Base).

Solución madre de estándar: Preparar 100 mL una solución de Imipenem de concentración

241,8 µg/mL

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Blanco: Tomar un hisopo y lavarlo con solvente de muestreo (Agua), mínimo 2 veces,
sacudiéndolo cada vez para retirar el exceso de líquido. Adicionar en el vial 4 mL de solución
amortiguadora. Introducir la cabeza del hisopo en la boca del vial, cortando con tijeras el
mango del hisopo, por encima de la cabeza y tapar. Agitar durante 60 segundos el vial,
evitando la pérdida de contenido. Filtrar por membrana de 0,45 µm.

El límite de cuantificación se debe determinar mediante la preparación de soluciones

extraídas individualmente, en concentraciones del 30%, 10%, 5%, 1% y 0.5% según indica la
Tabla 11.

Tabla 11. Niveles de Concentración para Límite de Cuantificación y Detección.

CONCENTRACIÓN PREPARACIÓN
Tomar una alícuota de 3 mL de la solución madre de estándar y llevar a
30% (7,25 µg/mL) un balón de 100 mL, disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por
membrana de 0,45 µm.
Tomar una alícuota de 1 mL de la solución madre de estándar y llevar a
10% (2,42 µg/mL) un balón de 100 mL, disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por
membrana de 0,45 µm.
Tomar una alícuota de 1 mL de la solución madre de estándar y llevar a
5% (1,21 µg/mL) un balón de 200 mL, disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por
membrana de 0,45 µm.
Tomar una alícuota de 1 mL de la solución madre de estándar y llevar a
un balón de 100 mL, disolver y llevar a volumen con diluente, luego,
1% (0,22 µg/mL) tomar una alícuota de 1 mL de la solución anterior y llevar a un balón
de 10 mL disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por
membrana de 0,45 µm.
Tomar una alícuota de 1 mL de la solución madre de estándar y llevar a
un balón de 200 mL, disolver y llevar a volumen con diluente, luego,
0.5% (0,12 µg/mL) tomar una alícuota de 1 mL de la solución anterior y llevar a un balón
de 10 mL disolver y llevar a volumen con diluente. Filtrar por
membrana de 0,45 µm.

5.8.2. PROCEDIMIENTO

Se debe realizar 6 inyecciones de solución estándar y 6 inyecciones de cada nivel de

concentración. Establecer la desviación de las respuestas para cada una de las diluciones y
calcular para cada punto la precisión y exactitud de las medidas para así establecer el límite
de cuantificación.

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Establecer las concentraciones correspondientes al límite de detección por medio del método
de la curva a concentraciones bajas, que se describe a continuación:

Preparar una serie de 5 concentraciones del estándar a concentraciones por debajo del
primer punto de la curva de calibración (30%, 10%, 5%, 1% y 0,5%).

Analizar y determinar las respuestas respectivas.

Determinar la curva de regresión de área vs concentración por el método de los mínimos

cuadrados, sobre los puntos individuales sin promediar y sin forzar la recta por el origen.

Tener en cuenta la curva de calibración establecida en el rango de concentraciones

apropiado (curva 1: Linealidad del sistema).

Establecer la curva de regresión lineal con las concentraciones bajas, determinar el valor del
intercepto, la pendiente y el coeficiente de correlación para esta curva. (Curva 2: Rango entre
1% y 50%).

Determinar la desviación estándar correspondiente (Sn-1) a cada concentración empleada.

Hacer una gráfica de desviación estándar vs concentración (Curva 3: Rango entre 1% y 50%)

Calcular el límite de detección de acuerdo con la siguiente fórmula:

Yb1   3 * Sb1
LD 
b*  n
Donde:
Yb1 = Estimado de respuesta del blanco de la curva 2 (intercepto)
Sb1 = Intercepto en la curva 3
n = Número de medidas
b = pendiente de la curva 1

5.8.3. CRITERIO DE ACEPTACIÓN

Los límites de detección y cuantificación deben cumplir con los parámetros presentados en la
Tabla 12.

Tabla 12. Criterio de aceptación para Límite de Cuantificación y Detección.

PARÁMETRO ESPECIFICACIÓN

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Se considera para el límite de detección la concentración más baja del

analito que puede ser diferenciada de la respuesta del blanco, pero no
Límite de
necesariamente cuantificarse como un valor exacto. Para el caso
detección
particular, se tomará el límite de detección como la concentración
obtenida por medio del método de la curva a concentraciones bajas.
Se considera para el nivel de cuantificación la concentración más baja del
Límite de analito que puede ser cuantificado cumpliendo con los parámetros de
cuantificación exactitud (97%-103%) y precisión (coeficiente de variación menor a
3,0%).

6. CONTROL DE CAMBIOS

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