EFECTO PROBIÓTICO DE lactobacillus sp SOBRE EL CRECIMIENTO IN

VITRO DE Streptococcus mutans

PROBIOTIC EFFECT OF lactobacillus sp ON THE IN VITRO GROWTH OF

Streptococcus mutans

Asesor: Dr. William Guzmán

Gerardo Orihuela Iparraguirre1, Ángel Mena García1

RESUMEN
Objetivo: Determinar efecto probiótico del lactobacillus sp. en el crecimiento de
Streptococcus mutans Material y Métodos: El material fueron muestras de la
cavidad bucal, preparando placas con Agar mitis salivarius la cual se utiliza para
diferenciar entre especies de Streptococcus, aplicando técnica de estrías por
cuadrantes en incubación a 37°C por 48 horas. Independientemente se utilizó 1 ml
del producto pro-biótico procediendo con un sembrado por estrías en superficie de
agar MRS, en incubación por 7 días a 37º. Propagándolo después en un caldo de
cultivo. Para el tratamiento preparamos placas con Agra Müller hinton haciendo
siembra por diseminación y posteriormente realizando antibiogramas. Resultados:
Luego de 24 horas de incubación se observó la presencia de halos de inhibición de
10mm de diámetro. Conclusiones: Se demostró el efecto probiótico del
Lactobacillus sp. para la inhibición en Streptococcus mutans.
Palabras clave: Streptococcus mutans, lactobacillus sp, probiótico, Agar mitis
salivarius, Agar Müller hinton, antibiograma

ABSTRACT
Objective: To determine the probiotic effect of lactobacillus sp. in the growth of
Streptococcus mutans Material and Methods: The material was samples of the oral
cavity, preparing plates with Agar mitis salivarius which is used to differentiate
between Streptococcus species, applying stretch marks technique by quadrants in
incubation at 37 ° C by 48 hours. Independently 1 ml of the probiotic product was
used, proceeding with a seeded by stretch marks on the surface of MRS agar, in
incubation for 7 days at 37 °. Propagating it later in a broth. For the treatment we
prepare plates with Agra Müller hinton doing sowing by dissemination and later
performing antibiograms. Results: After 24 hours of incubation the presence of
inhibition halos 10mm in diameter was observed. Conclusions: The probiotic effect
of Lactobacillus sp. for inhibition in Streptococcus mutans.

Key words: Streptococcus mutans, lactobacillus sp, probiotic, Agar mitis

salivarius, Müller hinton agar, antibiogram
Introducción
En la prevención de la caries dental se han planteado diferentes estrategias: control
inmunológico, control microbiológico, educación específica, control de dieta,
detección previa de factores de riesgo, higiene bucodental, ingestión y aplicación
tópica de fluoruros, ingestión y aplicación de fármacos y aplicación de sellantes en
fisuras y fosetas. Las últimas siete estrategias se han estado realizando sin la
continuidad, profundidad, sistematización, vigilancia y control que se requiere para
que sean efectivas en un 100% de sus posibilidades. Las medidas por sí mismas
son efectivas, pero si quienes las implementan u organizan no lo hacen
adecuadamente, no se lograrán los resultados esperados. En pero las acciones
realizadas por diferentes entidades de salud no han logrado disminuir la caries
dental, que aún persiste en más del 90% de la población. Esta situación llama la
atención para seguir estudiando y revisando todas las técnicas o medidas de
prevención específicas contra la caries dental. El control microbiológico o terapia de
remplazo puede ser una alternativa con la cual se pueden controlar las especies
microbianas implicadas en la caries dental, sin producir ningún efecto negativo
sobre las otras especies que conforman la microbiota oral. (Herazo, 1993).

Bases teóricas
Mecanismos de acción
Se han propuesto varios mecanismos para el potencial efecto beneficiosos de los
probióticos. Estos se pueden separar en 4 líneas generales:

1. La producción de antimicrobianos (bacteriocinas) o ácidos que pueden inhibir la

proliferación de patógenos.

2. La competencia por sitios de adhesión celular (Inhibición competitiva o terapia de

reemplazo) con los patógenos y/o co-agregación al biofilm.

3. La modulación de las funciones inmunitarias locales y sistémicas.

4. La degradación de toxinas
Los Lactobacillus se consideran parte normal de biofilm oral y comprenden
aproximadamente el 1%. Los Bifidobacterium se producen sólo en cantidades
diminutas en el biofilm oral. La atención se centra en esta especie porque se
produce en la industria láctea y rara vez está implicada en infecciones humanas. De
hecho, estas bacterias muestran una relación simbiótica con los seres humanos.
Estudios previos señalan que el efecto de cepas probióticas inhibe la colonización
de los patógenos responsables de la caries dental como el Streptococcus mutans,
previniendo la aparición de la caries dental. Se cree que los probióticos actúan a
través de una variedad de mecanismos, como la competencia con los posibles
agentes patógenos, degradación de toxinas, producción de sustancias
antimicrobianas e inmunomoduladores locales y sistémicos Estos mecanismos de
acción se han obtenido exclusivamente a partir de estudios gastrointestinales,
creando la necesidad de su aplicación en estudios relacionados con la salud oral.
La boca representa la primera parte del tracto gastrointestinal, por lo tanto, hay
razones para creer que al menos algunos mecanismos de los probióticos pueden
desempeñar un papel importante a nivel oral (Meurman & Stamatova, 2007)

El número de productos que contienen probióticos ha aumentado, aunque algunas

especies contenidas en estos se asocian a la progresión de caries dental como los
Lactobacillus sp., que a pesar de ser productoras de ácido láctico, la capacidad
amortiguadora de los productos lácteos que las contienen contrarresta la acidez
protegiendo la superficie dental e inhibiendo la adhesión del Streptococcus mutans
(Pérez-Luyo, 2008).

Al mismo tiempo los Lactobacillus han sido los de mayor interés en la investigación
dental por varias décadas, desarrollándose modernas técnicas moleculares en las
que estas bacterias se asocian más en las etapas tardías que al inicio del proceso
de las lesiones de caries dental (Twetman & Stecksén-Blicks, 2008).

Antecedentes internacionales
Rebolledo et al. (2013) (Concepción, Chile) Fue medir el efecto de las cepas
probióticas Lactobacillus casei variedad rhamnosus (LCR32) y Lactobacillus
johnsonii (LA1) sobre el crecimiento in vitro de Streptococcus mutans. Se midió el
efecto in vitro de las cepas de dos probióticos comercializados en Chile;
Lactobacillus casei variedad rhamnosus (LCR32) contenidas en Lactil y
Lactobacillus johnsonii (LA1) contenidas en Chamyto, sobre el crecimiento in vitro
de Streptococcus mutans.

Valdéz J. (2016) (Quito, Ecuador) Fue determinar si el Lactobacillus casei

(variedad rhamnosus) del yogurt Toni y de las cápsulas de Bacilos son efectivos
para inhibir el crecimiento in vitro de Streptococcus mutans.

Hasslöf et al. (2010) (Umeå, Suecia) Fue investigar la capacidad de una selección
de cepas de lactobacilos, usadas en productos probióticos comercialmente
disponibles, para inhibir el crecimiento de los estreptococos orales mutans y C.
albicans in vitro.

Antecedentes nacionales
Ríos et al. (2013) (Lima, Perú) Determino el efecto inhibitorio in vitro, de un
bioyogurt con cepas probióticas sobre el crecimiento de Streptococcus mutans.

Objetivo
Medir el efecto probiótico del lactobacillus a diferentes cantidades (50ul, 100ul)
sobre el crecimiento de Streptococcus mutans

Materiales y método
Obtención de la muestra
Se utilizó como muestra biológica (biofilm) obtenido del raspado de placa dental y
llevado a tinción gram para la identificación de streptococcus mutans y
consecuentemente se sembraron en agar Mitis salivarius por 24 - 48 horas a 37°C.
Una vez realizado el crecimiento bacteriano en la placa se ejecutó la tinción Gram
para su identificación observando un color azulado, agrupación de cadenas pares
de los cocos propio del género, como también pruebas bioquímicas en el cual nos
ayuda mejor a la identificación del microrganismo entre ellas se hicieron siembras
en agar sangre para la observación de hemolisis alfa propia del genero aislado;
como también siembras por puntura en agar TSI esperando observar el
metabolismo de la bacteria en el consumo de los azucares propias del medio.
Aislamiento y propagación del lactobacillus
Independientemente se utilizó 1 ml del producto lacteo procediendo con un
sembrado por estrías en superficie de agar MRS, en incubación por 7 días a 37º C.
Consiguiendo el crecimiento de colonias blanquecinas llevando esas muestras al
procedimiento de tinción Gram para su identificación esperando obtener bacterias
del genero lactobacillus para su aislamiento y propagación posterior.

Para la propagación del microorganismo se preparó un caldo de cultivo MRS en el

cual se inoculo nuestra muestra bacteriana en un periodo de 72 horas a temperatura
ambiente

Antibiograma
En el tratamiento a realizar en el cual utilizamos placas con agar Müller hinton
sembrando por sedimentación nuestra muestra bacteriana de Streptococcus
mutans, llevando a cabo después con material estéril la colocación de discos con
carga biológica proveniente del caldo de cultivo MRS. Se extrajo 5 ml de caldo con
carga bacteriana en 2 tubos de ensayo, se procedió a centrifugar con el propósito
de obtener la proteína que en este caso se encontró en el sobrenadante,
Identificándola con una prueba bioquímica usando reactivo de Biuret, tornando un
color purpura que nos indica un resultado positivo Realizando así el procedimiento
de antibiograma para observar la formación de halos de crecimiento y así constatar
el efecto del lactobacillus sobre el crecimiento del Streptococcus mutans conocida
cosmopolitamente como la causante de caries dental.
 Resultados

Fig.1 C1 antibiograma con Fig.2 C2 antibiograma con

discos en concentración de 50 discos en concentración de
ul 100 ul

Concentración y Contenido Diámetro del halo Susceptibilidad >9mm

volumen
C1 50ul de 10mm S
sobrenadante/caldo
MRS
C2 100ul de 11mm S
sobrenadante/caldo
MRS

Tabla 1. Resultados obtenidos del antibiograma.

Discusión
Con respecto al objetivo de este presente proyecto, el cual es determinar el efecto
inhibitorio del Lactobacillus mediante a diferentes volúmenes en el crecimiento de
streptococos mutans. Se tiene que los microorganismos estudiados fueron aislados
de la cavidad oral y productos lácteos, sembrados en medio selectivos para su
crecimiento, aplicando una proporción de caldo MRS a diferentes cantidades para
lo cual se utilizó la técnica del antibiograma.
Se midió el diámetro de los halos de inhibición a las diferentes volúmenes, con el
uso de una regla milimetrada; se consideró como susceptible un halo de inhibición
mayor a 9mm (es decir que presenta un efecto inhibitorio sobre el streptococcus
mutans). Según los resultados obtenidos en la Tabla 1, Figura 1 y Figura 2, quedó
demostrado que el lactobacillus tiene un efecto inhibitorio en el crecimiento de
streptococcus para los volúmenes dados es decir que presenta un efecto
antimicrobiano
Al comparar las distintas medidas de los halos de inhibición de los diferentes
tratamientos, podemos notar que el mayor halo de inhibición corresponde al mayor
volumen de sobrenadante colocado 100ul el segundo mayor halo de inhibición fue
de 50ul, lo cual demuestra que a mayor volumen de sobrenadante mayor es el halo
de inhibición, es decir presenta un mayor efecto antimicrobiano.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo confirman lo realizado por otras

investigaciones ´´In vitro´´ en los cuales se han verificado el efecto antimicrobiano
presente en el microorganismo lactobacillus sp. Así tenemos Rebolledo et al. (2013).
Fue medir el efecto de las cepas probióticas Lactobacillus casei variedad rhamnosus
(LCR32) y Lactobacillus johnsonii (LA1) sobre el crecimiento in vitro de
Streptococcus mutans. Valdéz J. (2016) determinó que el Lactobacillus casei
(variedad rhamnosus) del yogurt Toni y de las cápsulas de Bacilos son efectivos
para inhibir el crecimiento in vitro de Streptococcus mutans.

La propiedad antibacteriana del lactobacillus es atribuida principalmente a la

bacteriocina que forma parte de su composición proteica.

En conclusión el microorganismo probiótico tiene un efecto inhibitorio en el

crecimiento de streptococcus mutans
Referencias bibliográficas

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Bogotá, D.C. Colombia, 125 págs.

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LIEBANA J. 2002. Microbiología oral. Segunda edición. McGraw-Hill Interamericana.

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Veillonella alcalescens in mixed continuous cultures. Archives of Oral Biology

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Meurman, J. H. & Stamatova, I. Probióticos: contribuciones a salud bucal. Dis oral,

13(5):443-51, 2007.
Pérez-Luyo, A. Probióticos: ¿una nueva alternativa en la prevención de la caries
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Twetman, S. & Stecksén-Blicks, C.Probióticos y salud bucal. efectos en niños. En

t. J. Pediatr. Dent. 18(1):3-10, 2008.