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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA

ESCUELA DE QUÍMICA

PROGRAMA DE QUÍMICA INDUSTRIAL

LABORATORIO DE BIOQUÍMICA.

SESIÓN # 2:

FLUJO DE MASA A TRAVÉS DE LAS CÉLULAS.

OBJETIVOS:

1. Verificar el flujo de masa que se da a través de un cultivo celular.


2. Cuantificar el consumo de nutrientes y la liberación de productos por parte de las células
de cultivo.

MARCO CONCEPTUAL:

Los seres vivos son sistemas termodinámicos alejados del equilibrio y para mantener esta distancia
se hace necesario invertir una gran cantidad de energía, que se usa en la generación y
sostenimiento de un sistema de estructuras capaz de exportar entropía al medio.

La energía necesaria para la vida puede obtenerse a partir de sustancias que los seres vivos
ingresan a sus células, donde sufren transformaciones degradativas y oxidativas con miras a
obtener energía (catabolismo) y transformaciones condensativas y reductivas para la síntesis de
componentes celulares (anabolismo). Estos procesos generan a su vez sustancias de “desecho”
que deben de expulsarse al medio, dando como resultado general un transporte de masa a través
de las células y una liberación de energía que es en parte utilizada por la célula y en parte hacia el
entorno en forma de calor.

MATERIALES:

 Frasco de 0,5 L de capacidad con tapón de caucho con dos orificios.


 Dos mangueras.
 Compresor de pecera (opcional).
 Plancha de calentamiento.
 Beaker de 500 mL.
 Pipetas volumétricas.
 Baño maría.
 Centrífuga.
 Balones volumétricos.
 Espectrofotómetro.
 Tubos de ensayo.
 Balanza analítica.
 Agitadores de vidrio.
 Vidrio de reloj.

REACTIVOS:

 HCl 0,10 M.
 Reactivo DNS.
 Levadura seca y fresca (liofilizada).
 Glucosa al 4%
 Glicina (Sólida para la curva de calibración)
 Ninhidrina 1,0%
 Ninhidrina (Sólida para la curva de calibración)
 NaOH 0,5 M.
 Glicina 0,3%
 Fenolftaleína.
 Agua desionizada.
 Agua destilada.

PROCEDIMIENTO:

Active 10 g de levadura seca y fresca en 200 mL de agua, llevándola al baño maría a 35°C por 20
minutos y luego a 45°C por 20 minutos. Agite la solución constantemente. ¿Qué observa?

Mezcle la suspensión resultante con 150 mL de glucosa al 4% y 150 mL de glicina al 0,3%. Airee
neumáticamente el medio haciendo burbujear los gases de salida a través de 50 mL de NaOH 0,50
M (ver esquema).

Muestree inmediatamente y cada 30 minutos por espacio de 120 minutos 2,0 mL del medio
alimenticio, centrifugue por dos minutos a 2000 r.p.m y diluya 1,0 mL de sobrenadante con 4,0 mL
de agua desionizada. Cuantifique glucosa y glicina.

Muestree inmediatamente y cada 30 minutos por espacio de 120 minutos 2,0 mL de solución de
NaOH y valórela con HCl 0,10 M.

Calibre los métodos analíticos para glucosa y glicina mientras se activa la levadura.
10 g Levadura activada 50 mL NaOH al 0,5%
+
150 mL Glucosa al 4%
+
150 mL Glicina al 0,3%

SUGERENCIAS:

Use un Beaker de 500 mL para activar la levadura.

Use un recipiente de 0,5 L para el medio alimenticio.

Las mangueras de entrada al medio alimenticio y a la solución de NaOH deben de llegar hasta el
fondo del recipiente (Evite que sean demasiado largas y demasiado anchas, ya que esto dificulta la
difusibilidad de los gases hacia el Beaker recolector para su posterior titulación).

Agite vigorosamente el medio alimenticio (varilla de vidrio) antes de cada muestreo.

Cuantifique glucosa y glicina inmediatamente después de diluir.

MÉTODO DNS PARA CUANTIFICACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES:

Se mezclan 250 µL de muestra con 50 µL de reactivo DNS; se calienta la mezcla en baño maría a
ebullición por 10 minutos y se le adicionan 2,0 mL de dHOH. Se lee Absorbancia a 540 nm.

Curva de calibración: 20 a 1500 ppm de glucosa.


Reactivo DNS:

Solución A: 0,25 g de ácido - 3,5 - dinitrosalisílico.

5,0 mL de NaOH 2M.

12,0 mL de agua destilada.

Solución B: 7,50 g de tartrato de sodio y potasio a 25 mL de agua.

Solución A + Solución B = Reactivo DNS.

Nota: Para 1 mL de solución de glucosa a 1600 p.p.m adicionar 0,2 mL de DNS.

MÉTODO DE LA NINHIDRINA PARA LA CUANTIFICACIÓN DE PÉPTIDOS Y AMINOÁCIDOS:

Se mezclan 1900 µL de muestra con 10 µL de Ninhidrina al 1%, se lleva a baño maría en ebullición
por 10 minutos y se lee Absorbancia a 570 nm.

Curva de calibración: 50 a 200 ppm de glicina.

INFORME:

 Grafique los datos de concentración de glucosa y glicina, así como la cantidad de CO2
liberado respecto del tiempo (elija la forma más conveniente para ello) y explique de
manera coherente los resultados, basándose en referencias bibliográficas.
 Explique en términos energéticos ¿qué es lo que sucede en el proceso de activación?.
 Mencione una ruta catabólica y una anabólica en la que intervenga la glicina. Explíquela.
 Mencione una ruta catabólica y una anabólica en la que intervenga la glucosa. Explíquela.
 ¿A qué velocidad se consumen glucosa y glicina por gramo de células?
 ¿Qué porcentaje de la glucosa tomada por las levaduras se ha transformado en CO2?
 ¿En qué reacciones químicas se basan los métodos de cuantificación usados en la
práctica? Explique claramente.
 Redacte al menos tres (3) conclusiones de la práctica.
REFERENCIAS BIBLIIOGRÁFICAS:

Lehninger. Bioquímica. 4ª edición. Editorial Omega.2009.

Brock, T. Microbiología. 7ª edición. Editorial Prentice-Hall. 2007

Lodish, H. Biología Celular y Molecular. 6ª edición. Editorial Panamericana. 2009.

CURVA DE CALIBRACIÓN PARA GLUCOSA (540 nm):

[ ] p.p.m A (540 nm)


1600 0,017
1400 0,015
1200 0,013
1000 0,011
800 0,009
600 0,006
400 0,004
200 0,002
100 0,001
20 0

CURVA DE CALIBRACIÓN PARA GLICINA (570 nm):

[ ] p.p.m A (570 nm)


200 0,830
160 0,752
120 0,706
80 0, 665
40 0,590
0 0

CÁLCULOS PARA LA PREPARACIÓN DE UNA SOLUCIÓN DE NINHIDRINA DE 40 p.p.m:

100 mL Glicina * (40 mg Glicina/1000 mL Glicina 40 p.p.m) * (1g Glicina/1000 mg Glicina) + 1 mL


Ninhidrina 1%.

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