FACTORES IMPLICADOS EN LA TRANSCRIPCIÓN ESPECÍFICA POR ARN
HUMANO POLIMERASA II: ANÁLISIS MEDIANTE UN ENSAYO IN VITRO RÁPIDO
Y CUANTITATIVO
RESUMEN: Describimos un nuevo
sistema de ensayo que permite una
detección rápida, directa y purificados por la ARN polimerasa II in
cuantitativa de la transcripción in
vitro dependiente del promotor por la
ARN polimerasa II. La plantilla
utilizada es un plásmido híbrido que
contiene el promotor tardío principal
de adenovirus unido a un fragmento
de ADN sintético de 400 pares de
bases que carece de residuos de
citidina en la cadena transcrita, es
decir, genera una transcripción sin
residuos de guanosina. Las
transcripciones in vitro se llevan a
cabo en ausencia de GTP o, si las
reacciones contienen GTP, en
presencia de RNasa T1 y el
terminador de la cadena 3'-0-metil-
GTP. En estas condiciones, los
únicos ARN que pueden acumularse,
ya sea a partir de una plantilla de ADN
circular o linealizada, son los
transcritos resistentes a RNasa T1 de
400 nucleótidos que resultan de una
iniciación precisa en el promotor
tardío principal. Así, La transcripción
específica se puede controlar
directamente mediante métodos de
cuantificación de ARN
convencionales. Usando este ensayo
rápido, mostramos que tres factores
de transcripción básicos, TFIIB, TFIID
y TFIIE, son absolutamente
necesarios, además del ARN
polimerasa II, para el inicio específico
de la transcripción del adenovirus
promotor tardío principal. Se pueden
definir unidades de actividad para
cada uno de estos componentes
individuales. Se discute la
aplicabilidad de este tipo de ensayo a
otros sistemas.
Un avance importante para las
investigaciones de control
transcripcional eucariótico ha sido el
desarrollo de sistemas solubles de
células que median la iniciación de la
transcripción precisa en genes
vitro (1-3). Los fraccionamientos
cromatográficos iniciales revelaron un
requisito para varios factores proteicos
además de la ARN polimerasa (4-7). Si
bien es probable que algunos de estos
factores de transcripción sean comunes
a todos los promotores de clase II, la
expresión de algunos genes requiere
factores diferentes y / o adicionales (8-
10). Los estudios anteriores realizados
con extractos crudos o factores
semipurificados (11-15) han identificado
varios pasos en el proceso de iniciación.
Sin embargo, una mejor comprensión de
los mecanismos involucrados espera la
purificación total de los diferentes
factores de transcripción.
Una de las principales dificultades para
purificar estas proteínas ha sido la falta
de un ensayo rápido y cuantitativo. Los
productos de transcripción in vitro tienen
que ser analizados por electroforesis en
gel para distinguir aquellas
transcripciones que resultan de una
iniciación precisa en promotores
específicos de todas las otras especies
de ARN (resultantes, por ejemplo, de
una iniciación aleatoria, iniciación en los
extremos de las moléculas de ADN, o
iniciación en secuencias de tipo caja
"TATA" en el vector ADN). Tal ensayo
que requiere mucho tiempo también
requiere la congelación y
descongelación en etapas sucesivas
durante el procedimiento de
purificación, y esto a menudo es
perjudicial para las actividades
enzimáticas. Además, el ensayo no es
fácilmente susceptible de cuantificación
rigurosa. Para aliviar estos problemas,
recientemente construimos un plásmido
híbrido en el que las secuencias internas
de la unidad de transcripción tardía
principal del adenovirus (ML) se
reemplazaron por un fragmento de ADN
que carece de residuos de citidina en la
cadena transcrita. Con esta plantilla, las
transcripciones específicas iniciadas a
partir del promotor ML pueden
cuantificarse directamente: son las
únicas transcripciones largas
sintetizadas en ausencia de GTP, o si
hay GTP, las únicas transcripciones
largas resistentes a RNasa Tl. Aquí
mostramos cómo este ensayo rápido y
cuantitativo puede llevar a un enfoque
más enzimológico para el análisis del
inicio de la transcripción específica, y
mostramos claramente el requisito de
tres factores distintos (parcialmente
purificados) para la transcripción del
promotor ML del adenovirus.
MATERIALES Y MÉTODOS
Reactivos. Los trifosfatos de
ribonucleósido purificados por HPLC se
adquirieron de ICN; 3'-O-metil-GTP, de
P-L Biochemicals; y nucleótidos
marcados, de New England Nuclear. El
polietilenglicol 8000 era de Sigma, y la
RNasa T1 era de P-L Biochemicals. La
albúmina de suero bovino Pentex (forma
cristalizada) se adquirió de Miles y se
purificó adicionalmente mediante el
paso a través de una columna de
fosfocelulosa.
Factores de transcripción y ARN
polimerasa II. Los factores de
transcripción de células HeLa IIB, IID y
HIE (TFIIB, TFIID y TFIIE) se purificaron
a partir del extracto nuclear (3) como se
describe (15-17) con las siguientes
modificaciones: se utilizaron gradientes
de sal, en lugar de pasos para eluir el
TFIIB de la columna de ADN-agarosa de
cadena única (Bethesda Research
Laboratories) (gradiente de KCl 0,1-0,6
M, volúmenes de 5 columnas) y el TFIID
de la columna de celulosa DEAE
(gradiente de KCl 0,1-0,3 M en
presencia de Tween 40 al 0,1%, 5
volúmenes de columna). Después de la
elución de DEAE-celulosa, TFIIE se
precipitó mediante la adición de 3
volúmenes de 3.8 sulfato de mamonio y
se cromatografió a través de una
columna de filtración en gel (Bio-Gel A-
1.5m, Bio-Rad) que se desarrolló con el
tampón estándar (20 Tris mM, pH 7,3, a
200ºC / EDTA 0,1 mM / glicerol al 20% /
2-mercaptoetanol 5 mM / fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 0,2 mM) que contiene
KCI 0,4M. Para cada factor, las
fracciones activas de la última columna
se agruparon y se dializaron para
disminuir la concentración de sal a KCl
0,1 M después de la adición de albúmina
de suero bovino (0,5 mg / ml). La ARN
polimerasa II del plasmocitoma de ratón
MOPC 21 tumores (18) se purificó hasta
homogeneidad mediante un
procedimiento similar al descrito por
Bitter (19). La preparación final se
estimó mediante análisis de NaDodSO4
/ gel principalmente en la forma IIA (18)
e incorporó -1.6 x 103 pmol de UMP / 20
min por gg de proteína en el ensayo
estándar con ADN de timo de ternera
desnaturalizado. Las concentraciones
de proteína se determinaron por el
método de Bradford (20).
Ensayos de transcripción in vitro.*
Las reacciones de transcripción (25 ul)
contenían 50-60 mM de KCl, 5-10 mM
(NH4) 2SO4, 12% de glicerol, 5% de
polietilenglicol, 7 mM de MgCl2, 0.6 mM
de ATP y UTP, 25 puM [ a-32P] CTP
(5000-10,000 cpm / pmol) y 0.4 ug de
ADN de plantilla. Cuando el GTP
contaminante estaba presente, las
reacciones también contenían RNasa
T1 (15 unidades) y 3'-O-metil-GTP (0,1
mM). Después de 45 min a 30 ° C, toda
la reacción se manchó en discos de
papel DEAE (Whatman DE81), que
luego se lavaron en fosfato sódico 0,5 M
para eliminar los nucleótidos no
incorporados (21). Alternativamente, las
reacciones se detectaron en discos de
papel Whatman 3 MM regular, que se
sumergieron durante 10 minutos en
ácido tricloroacético frío al 5% y luego se
procesaron como se describe (21).
RESULTADOS no específica. Entre los varios clones
construidos, se seleccionaron p (C2AT)
Los Plásmidos p (C2AT) y pML (C2AT).
19 y pML (C2AT) 19 para proporcionar
Para construir una plantilla modelo con
el fondo más bajo de transcripción no
la cual las transcripciones específicas
específica. La Fig. 1B muestra el
iniciadas a partir del promotor ML del
análisis por electroforesis en gel de las
adenovirus se distinguirían fácilmente
transcripciones sintetizadas in vitro a
de cualquier otra transcripción,
partir de estas dos plantillas. Con p
aprovechamos las siguientes
(C2AT) 19, se observaron transcritos de
observaciones: (i) el primer residuo de
alto peso molecular solo cuando los
guanosina en la transcripción ML es el
cuatro sustratos de rNTP estaban
nucleótido 11, y específico la iniciación
presentes (carril 3). Estas
in vitro puede ocurrir normalmente en
transcripciones, presumiblemente,
ausencia del sustrato GTP (15); y (ii) las
reflejan iniciaciones inespecíficas y / o
secuencias internas no forman parte de
iniciaciones en promotores fortuitos en
la mayoría de los promotores de clase II
el vector ADN. No hubo transcripción
(y el promotor ML en particular), aunque
detectable del plásmido de control en
las secuencias que rodean
ausencia de GTP (línea 1) o en
inmediatamente el sitio de la tapa
presencia de RNase T1 y el terminador
pueden desempeñar un papel en la
de la cadena 3'-Omethyl-GTP
determinación de la potencia del
(agregado para evitar la posible lectura
promotor (revisada en la ref. 22). Por lo
a través de la transcripción del casete
tanto, reemplazamos las secuencias de
libre de guanosina ) (carril 5). Cuando la
ADN ML aguas abajo del nucleótido +10
plantilla pML (C2AT) 19 se transcribió en
por un fragmento de ADN cuya
los mismos conjuntos de condiciones,
transcripción daría lugar a un ARN libre
se sintetizó un ARN de tamaño discreto
de guanosina y, por lo tanto, a ARNasa
(carriles 2 y 6, respectivamente). Este
resistente a Ti. Una representación
ARN tenía el tamaño esperado para una
esquemática de los plásmidos que
transcripción iniciada en la posición +1
construimos se muestra en la Fig. LA.
del promotor ML y alargada a través del
Los plásmidos p (C2AT) son derivados
casete libre de guanosina hasta el
de pUC13 que contienen un fragmento
primer residuo de citidina en el vector de
de ADN creado artificialmente, de
ADN. [Un pequeño porcentaje de
aproximadamente 400 pares de bases
transcripciones ligeramente más largas,
(pb), cuya secuencia aleatoria tiene la
que a veces se observaron en ausencia
composición promedio (C2, A, T) .- (G2,
de GTP agregado (carril 2), muy
T, A) ". Los plásmidos pML (C2AT) se
probablemente reflejaron un mayor
construyeron insertando las secuencias
alargamiento debido a cantidades traza
del promotor ML desde la posición -400
de GTP contaminante en uno o varios
a +10 frente al casete libre de
de los componentes de la reacción.] Los
guanosina. (Se publicará una
mismos resultados se obtuvieron
descripción más detallada de la
cuando las plantillas se linealizaron, en
construcción de estos plásmidos en otra
lugar de circular, se transcribieron (no se
parte).
muestra).
Transcripción in vitro de p (C2AT) y pML
En resumen, cuando la plantilla de pML
(C2AT). Excepto por las secuencias del
(C2AT) se transcribió ya sea en
promotor ML, los plásmidos p (C2AT)
ausencia de GTP o en presencia de
contienen las mismas secuencias que
RNasa T1 y 3'-O-metil-GTP, los únicos
los plásmidos pML (C2AT) homólogos;
ARN que se acumularon fueron los
Por lo tanto, proporcionan el control
transcritos de 400 nucleótidos que
ideal para monitorear la incorporación
resultaron de Iniciación precisa en el específica con la plantilla pSmaf de
promotor ML. Por lo tanto, con esta corte Sma I en ausencia de TFIIC.
plantilla, la transcripción específica se
El requisito de ATP para el inicio de la
puede cuantificar fácilmente mediante la
transcripción por la ARN polimerasa II
medición directa del ARN total
(11) también se observó con el
sintetizado.
procedimiento de ensayo rápido:
El ensayo rápido muestra los mismos cuando se usó el análogo no hidrolizable
requisitos básicos que el ensayo de adenil-5'-il imidodifosfato en lugar de
salida. Estudios previos han ATP, la síntesis de ARN se redujo casi
demostrado que cuatro componentes al nivel de fondo (Fig. 2). La adición de
proteicos diferentes, TFIIA, TFIIB, TFIIC dATP, que mostramos previamente
y TFIID, además de la ARN polimerasa puede cumplir in vitro el requerimiento
II, fueron necesarios para la de energía de la reacción (15), restauró
transcripción específica del promotor parcialmente la capacidad
ML del adenovirus (4). Mediante el uso transcripcional del sistema en presencia
de métodos detallados en otra parte de adenil-5'-il imidodifosfato como el
(16), la fracción de fosfocelulosa que sustrato de polimerasa.
contiene TFIIB se puede resolver en dos
Análisis cuantitativo de la reacción de
fracciones, TFIIB y TFIIE, ambas
transcripción específica. El ensayo
requeridas para el inicio preciso de la
rápido descrito anteriormente
transcripción. El nuevo ensayo se
proporciona un fácil acceso al análisis
comparó con el ensayo de escorrentía
cuantitativo. Por lo tanto, establecimos
bien estudiado (Fig. 2); para este
condiciones para valorar la actividad de
propósito, se utilizaron factores de
cada componente individual de la
transcripción purificados más
reacción. Para tal análisis, la velocidad
extensamente (ver Materiales y
de reacción debe ser lineal. La Fig. 3A
Métodos y el diagrama de flujo en la Fig.
muestra el curso temporal de la síntesis
2A). Estas fracciones no mostraron
de ARN en el sistema reconstituido: la
contaminación cruzada y estaban libres
reacción no mostró el retraso inicial
de actividad de la ARN polimerasa II
observado con fracciones menos
(Fig. 2B). Ambos ensayos indicaron que
purificadas (6) o extractos nucleares (3)
los factores TFIIB, TFIID y TFIIE, así
y fue lineal durante aproximadamente
como la ARN polimerasa II, eran
60 minutos con ambos circular y lineal
esenciales para la transcripción. La
plantillas. La Fig. 3B muestra la curva de
adición de TFIIA no tuvo efecto en
titulación para la plantilla circular pML
ninguno de los sistemas de ensayo (no
(C2AT) 19; el aumento de la plantilla de
se muestra), aunque TFIIA estimula la
ADN a concentraciones más altas que
transcripción con fracciones menos
las mostradas tuvo poco efecto en la
purificadas (fosfocelulosa)
transcripción (los mismos resultados se
aproximadamente 3 veces (4). TFIIC
obtuvieron con la plantilla pML lineal
[poli (ADP-ribosa) polimerasa], que se
(C2AT) 19). A un nivel de plantilla de
sabe que efectúa la transcripción
saturación (16 Ag / ml de ADN), la
específica in vitro solo de forma indirecta
valoración del cloruro de magnesio
al suprimir la iniciación aleatoria en
mostró un óptimo amplio de alrededor
muescas (17), no tuvo efecto en la
de 7 mM (no se muestra). Por lo tanto,
transcripción de la plantilla circular pML
se eligieron cloruro de magnesio 7 mM,
(C2AT). En contraste, se observó un
16 pug de plantilla por ml de ADN y un
aumento general en la transcripción no
tiempo de incubación de 45 minutos
específica y una disminución
como condiciones estándar para todos
concomitante en la transcripción
los experimentos posteriores.
Con respecto a la eficiencia de la en el mismo vector y se valoraran de
transcripción, los 2 pmol de CMP manera similar.
incorporados en el ARN específico a
Las curvas de dosis-respuesta para
una concentración de pML (C2AT) 19 de
cada factor de transcripción individual y
16 jig / ml correspondieron a 0,07
la ARN polimerasa se muestran en la
transcripciones por gen. Investigamos la
Fig. 4. A bajas concentraciones, cada
posibilidad de aumentar la proporción
componente provocó una respuesta
de transcripción por gen al disminuir la
lineal. Por lo tanto, es posible definir
cantidad de plantilla en la reacción
unidades de actividad para los
mientras se mantiene una
diferentes componentes involucrados
concentración global constante de ADN
en el inicio de la transcripción
mediante la adición de ADN plásmido
específica. Con una unidad de actividad
pUC13. Curiosamente, en estas
definida como la cantidad de factor que,
condiciones, la transcripción se redujo
en el rango lineal, permite la
en mayor medida que cuando la
incorporación de 1 pmol de CTP en un
concentración de la plantilla disminuyó
ARN específico en 45 minutos a 30 ° C,
en ausencia de ADN portador (Fig. 3B).
calculamos actividades específicas para
Esto implica que el ADN del vector
cada componente del conjunto
(probablemente debido a la presencia
particular de fracciones utilizado en el
de secuencias de pseudoTATA-box)
experimento (ver la leyenda para la Fig.
compite con el promotor ML para
4). Curiosamente, este cálculo mostró
algunos de los componentes de la
que el punto en el que la curva de
transcripción. Para un vector dado, la
titulación para un factor particular dejó
extensión de esta competencia debe
de ser lineal correspondía precisamente
reflejar la fuerza del promotor específico
al punto en que otro componente de la
que se está titulando. Como se muestra
reacción se volvió limitante. Verificamos
en la Fig. 3C, un gráfico recíproco doble
que cuando la concentración de este
de síntesis de ARN específica frente a la
segundo componente disminuía, el
concentración del promotor muestra una
punto de ruptura disminuía
relación lineal. Esta representación
proporcionalmente; sin embargo, debajo
permite una extrapolación del nivel de
de ese punto, las curvas eran idénticas
transcripción que habría tenido lugar a
(datos no mostrados). Por lo tanto, la
una concentración de promotor infinita,
actividad medida para cualquier factor
es decir, cuando las secuencias de
dado es independiente de las
vectores no competirían más. Este valor
concentraciones de los otros
de "Vmas" dependía de las
componentes siempre que la medición
concentraciones de los factores de
se realice en el rango lineal.
transcripción utilizados (Fig. 3C; vea la
leyenda para varias concentraciones de DISCUSIÓN
factores). Sin embargo, la aparente "K".
que podría derivarse de las mismas Hemos construido una plantilla en la que
curvas (es decir, la concentración del el promotor ML del adenovirus dirige la
promotor que permite una síntesis de síntesis de transcripciones que se
ARN igual a la mitad de la Vm) fue pueden cuantificar directamente in vitro
independiente de las concentraciones en virtud de su composición de base
de los factores de transcripción. Aunque especial. Además de su facilidad y
aún no se ha probado, este análisis de rapidez, este nuevo ensayo tiene la
Km podría proporcionar una manera de ventaja de que la plantilla de ADN no
comparar las fortalezas de otros necesita ser linealizada antes de la
promotores eucarióticos si se clonaran transcripción, como es el caso en el
procedimiento de ensayo de escorrentía
(1). Esto evita los artefactos introducidos
por la presencia de extremos de ADN,
que pueden secuestrar proteínas
específicas (incluidas las ARN
polimerasas), y la presencia de mellas
que a menudo se introducen en el ADN
durante la digestión con endonucleasas
de restricción. Estas muescas (y
posiblemente los extremos del ADN)
probablemente explican el hecho de que
hay una mayor dependencia de TFIIC
(17) en el ensayo de escorrentía que en
el ensayo rápido con las plantillas
circulares (ver Fig. 2). Además, en
algunos casos, las plantillas de ADN
circular versus lineal exhiben diferentes
propiedades transcripcionales in vitro
(ref. 23; observaciones no publicadas).
El nuevo procedimiento de ensayo será
extremadamente conveniente para tales
análisis ya que, hasta ahora, los
productos de transcripción de plantillas
circulares solo podrían analizarse
indirectamente mediante el mapeo de
nucleasa S1 o los procedimientos de
extensión de cebadores. El número real
de factores de transcripción requeridos
para la iniciación en el promotor ML del
adenovirus sigue siendo una pregunta
abierta. Con extractos crudos o
fracciones semipurificadas, la presencia
de sustancias integradoras puede crear
requisitos artificiales que no estarán
presentes cuando los componentes
puros estén disponibles. Como se
mencionó anteriormente, este es
probablemente el caso para el requisito
de TFIIC. En este artículo mostramos un
requisito absoluto para los factores
designados TFIIB, TFIID y TFIIE
además de la ARN polimerasa II. Con
estos factores más ampliamente
purificados, la fracción TFIIA (4) descrita
anteriormente es totalmente
prescindible, lo que aumenta la
posibilidad de que TFIIA no sea un
factor de iniciación de la transcripción de
buena fe. Aunque sabemos que parte
del efecto estimulante observado con
las fracciones de TFIIA en bruto se debe
a la presencia de una actividad
inhibidora de la ARNasa (observación
no publicada), también puede ser que el
TFIIA sea un factor requerido y que
cumpla con (y se enriquezca con
respeto). a) uno o varios de los otros
componentes. Alternativamente, TFIIA
podría jugar un papel importante en la
iniciación o el alargamiento (por
ejemplo, por fosforilación o cualquier
otra modificación de los factores
básicos) sin estar directamente
involucrado en el proceso de iniciación
de la transcripción. Recientemente, Egly
et al. informaron que el TFIIA purificado
contiene actina (24), y otros hallazgos
recientes indican que la actina nuclear
podría estar involucrada en eventos
transcripcionales in vivo (25).
El nuevo procedimiento de ensayo
proporciona acceso inmediato al
análisis cuantitativo de reacciones de
transcripción específicas in vitro. Hemos
demostrado que la concentración de los
componentes básicos necesarios para
la iniciación en el promotor ML del
adenovirus se puede cuantificar
fácilmente. El mismo enfoque debería
ser generalmente aplicable para análisis
similares de otros genes. En los casos
en que los residuos de guanosina
internos no se pueden eliminar (como en
el caso de los genes de la clase III,
donde el promotor es interno), la
presencia de GTP en la reacción podría
aumentar el trasfondo de los transcritos
resistentes a RNasa Ti resultantes de
iniciaciones inespecíficas corriente
arriba de la libre de guanosina. casete.
Sin embargo, debería ser posible reducir
este fondo controlando las iniciaciones
aleatorias en nicks (17), compitiendo
con plantillas adicionales no específicas
(como homopolímeros sintéticos), o
impidiendo la lectura de la transcripción
interponiendo un terminador o un sitio
de represión (bacteriano) ( 26).
Obviamente, también son posibles otras
construcciones basadas en el principio
establecido aquí. El método debería
demostrar ser generalmente útil al
permitir una rápida selección de las
condiciones del ensayo o buscar
componentes reguladores. También
será extremadamente útil en la
purificación de los factores de
transcripción, ya que la cuantificación
precisa de las actividades y los
rendimientos específicos es esencial
para establecer procedimientos
cromatográficos eficientes.
Agradecemos a D. K. Hawley y W. E.
Jack por la lectura crítica del manuscrito.
Este trabajo fue apoyado por las Becas
de Investigación del Servicio de Salud
Pública CA34223 y CA34891 del
Instituto Nacional del Cáncer, por la
Subvención CD 203 C de la Sociedad
Americana del Cáncer a R.G.R., y por el
Proyecto de los Institutos Nacionales de
la Salud del Proyecto CA18213 a la
Universidad Rockefeller.