TEMA 1.

INTRODUCCIÓN A BIORREACTORES

1. Conceptos

Proceso Bioquímico: proceso que utiliza células vivas, enzimas inmovilizadas u otras biomoléculas
(enzimas inmovilizadas) para realizar una transformación química que resulte en la producción al
máximo y recuperación de productos valiosos a nivel comercial.

Pasos en el desarrollo de un proceso bioquímico

1. Identificación de la reacción o producto deseado, p.e. antibiótico (químico, bioquímico).

2. Identificación de enzimas o microorganismos clave, p.e. Penicillium (bioquímico o microbiólogo).

3. Desarrollo del proceso, p.e. adición de compuestos al cultivo y operación por fed-batch (químico,
bioquímico, microbiólogo, ingeniero químico).

4. Diseño del biorreactor y unidades de recuperación de producto, p.e. microporos de gaseo (ingeniero
químico) .

5. Ingeniería metabólica: aplicación de análisis ingenieril a rutas metabólicas dentro de microorganismos

para mejorar el rendimiento de producción, p.e. eliminación de retro-regulación negativa.

En el biorreactor se garantiza que el cultivo se mantenga puro, a una temperatura de crecimiento

óptima*, con el sustrato adecuado.

*En muchas ocasiones, cuando hay problemas con la expresión de proteínas, se cultiva a una
temperatura menor de la óptima de crecimiento para evitar una sobreexpresión, agregado y
precipitación de las mismas.

En un proceso bioquímico típico se acondicionan las materias primas, se esterilizan, se preparan los
cultivos y se llevan al reactor de fermentación. Una vez se tiene el producto se llevan a cabo una serie de
operaciones de separación, para separar las células y el resto de compuestos (filtración, centrifugación,
decantación, extracción, absorción y adsorción). Tras las operaciones de purificación (extracción L-L,
cromatografía de afinidad…) se obtiene el producto final y se tratan los residuos.

Fermentación: del latín “fervere” = “hervir” es cualquier proceso para la producción de un producto
mediante el cultivo de un microorganismo. Tiene su origen en la producción de CO2 por el metabolismo
de los MO empelados: como el causado por el catabolismo de levaduras sobre azúcares de fruta o malta
que termina en burbujas que llegan a la superficie por flotabilidad.

¡¡¡Solo se da si las condiciones de sustrato de azúcar son muy altas!!!

Microorganismos: grupo diverso de organismos microscópicos que existen como células de vida libre o
en grupos de células. Incluyen pequeños eucariotas de vida libre (algas, hongos) y procariotas (bacterias
y arqueas)

1. Para utilizar un microorganismo es importante que su metabolismo sea conocido, su genoma

anotado y se conozcan cuanto más detalles mejor para poder diseñar las estrategias de
producción en los biorreactores
2. Es importante también tener en cuenta la estructura celular.

Por ejemplo, las bacterias gram + son mejores para la exportación de proteínas que las gram -. Para
proteínas que necesitan modificaciones post-traduccionales se suelen utilizar células eucariotas.
  Microorganismos industriales: los grupos de microorganismos más relevantes son los hongos
(levaduras) y bacterias de los géneros Streptomyces (es un género de bacteria con un
metabolismo secundario muy rico, y es una de las principales fuentes de medicamentos en la
industria farmacológica) y Bacillus (se utiliza principalmente para producción de proteínas que
son excretadas al exterior porque es gram positiva lo que facilita la purificación).

¿Qué características tienen los MO con aplicación industrial?

- Producen esporas o pueden obtenerse inóculos con facilidad
- Se cultivan a gran escala porque tienen altas tasas de crecimiento para obtener productos
por transformaciones bioquímicas
- Crecen rápidamente a gran escala y en medios baratos
- Producen el producto deseado con rapidez
- No deben ser patógenos
- Deben poder manipularse genéticamente para por ejemplo diseñar nuevas rutas
metabólicas
- Se pueden usar métodos clásicos para seleccionar estirpes de alto rendimiento o
producción: se busca es conseguir la máxima cantidad del compuesto de interés utilizando
el menor número de células

2. Biorreactores

Son los recipientes adecuadamente acondicionados para llevar a cabo transformaciones mediadas por
sistemas biológicos.

Constituyen una de las herramientas más importantes de la Ingeniería de Procesos Biotecnológicos y de

la Biotecnología Industrial para obtener conocimiento, bienes y servicios.

- La mayoría de los procesos de fermentación son aeróbicos, por ello los biorreactores llevan un
sistema de aireación (airlift: se necesitan recipientes que sean muy grandes, la relación
diametro altura es de 1/5)
- Paletas de agitación y difusores proporcionan oxígeno al cultivo
- Su tamaño varía entre 1 y 500.000 litros: en ocasione el producto de interés no puede
acumularse por ejemplo por su toxicidad en el total de la biomasa y por ello es necesario
utilizar recipientes de mayor tamaño.
- Los grandes biorreactores son casi siempre de acero inoxidable.

Por ejemplo: En el proceso de producción de cerveza las levaduras entran en un tubo de ensayo con el medio
de cultivo que llega a una DO adecuada luego pasa a un matraz que igual se hacen posteriores escalados a
diferentes reactores cada vez más grandes hasta cargar el reactor al que siguen sistemas de filtración.

 Controlador es un sistema automatizado que abre y cierra las válvulas pertinentes. Todas las
bombas van asociadas al controlador, con un sensor para medir las variables (pH, oxígeno
disuelto…). Estos sensores tienen que estar adecuadamente calibrados.
 Camisa térmica: permite controlar la temperatura con un sistema de circulación de agua para
regularla. para funcionar bien necesitan un generador de vapor (para dar calor y también usado
para esterilizar) y un sistema de enfriamiento (más lento normalmente).
 Bombas peristálticas que controlan el pH: en condiciones aeróbicas el medio se acidifica y se
añaden stocks de sosa que añaden una gota cada vez que el pH varía.
 Bombas peristálticas que controlan la espuma: Algunas células se lisan y muchos de los
compuestos internos son surfactantes (actúan como detergentes) y facilitan la producción de
 espuma, que afecta al proceso biológico y se corre el peligro de que se presurice el sistema y se
colapse la salida de gas
 Sistemas de inyección de gas: se puede necesitar inyectar oxígeno o realizar los procesos en
condiciones de anaerobiosis para lo que se necesita un proceso de inyección de nitrógeno.
3. Representación de los bioprocesos

Son diagramas de flujo que sirven para describir un proceso de producción mediante representaciones
simplificadas de los procesos con los datos y la información relevante del proceso, los equipos
necesarios, las líneas de corriente de entrada y de salida de los equipos…

Los diagramas de flujo utilizan símbolos estándar para transmitir la información. Facilitan el diagnóstico
y corrección de fallos.

Los bloques indican las operaciones y los flujos indican las corrientes principales.

En los diagramas de flujo más complejos se muestran también equipos auxiliares como tuberías,
válvulas, bombas…. Si se utilizan para realizar cálculos también se especifican condiciones de operación,
masas y concentraciones de materiales manejados.

Ej: en la producción de cerveza hay 3 productos de interés comercial: la cerveza, las células y C02 que
pasa a sistemas de absorción por tamaño que pueden separar N2, 02 y C02 que se comprime y licúa.

.
4. Ejemplos de bioprocesos microbianos

4.1 Producción de células microbianas: levaduras u otros MO a los que se les puede dar una fuente
de C muy barata, se liofilizan y se añaden a pellet de pienso para ganado, también levaduras
para industrias panaderas y cerveceras, biomasa para suplementos de alimentación humana o
de ganado
Hay que hacer un ESCALADO: de la placa de Petri se selecciona una colonia y cuando se alcance
una determinada DO se pasa a un matraz y al alcanzar otra DO deseada se pasa a un recipiente
de cultivo, a un fermentador intermedio y una vez se consigue el volumen deseado se pasa al
reactor grande del que se separará la biomasa del medio de cultivo.
a. Las levaduras para panadería o cultivadas con propósitos nutricionales se crecen en
fermentadores aireados
- El principal ingrediente del medio de cultivo son las malezas. Han de añadirse poco a poco para
evitar metabolismo fermentativo (se puede controlar la producción de biomasa a través del
efecto Crabtree, en función de la disponibilidad de glucosa
- El medio contiene también ácido fosfórico y sulfato amónico.
- Las células se recuperan por centrifugación y se comprimen/deshidratan según el uso:
comprimidas, secas o lisadas.
 b. La espirulina para suplemento alimenticio se cultiva al aire libre en estanques con paletas
agitadoras.
- Son cianobacterias fotosintéticas que requieren alto pH y altas concentraciones de carbono.
- La espirulina seca contiene 50-70% de proteína. Es cara.
- Contiene altas cantidades de vitamina B12

4.2 Producción de enzimas microbianas: amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas

- Las enzimas son útiles como catalizadores industriales
- Son específicas a la hora de catalizar una reacción bioquímica concreta y tienen una
especificidad - por substrato muy alta
- Producen un único esteroisómero
- Se pueden inmovilizar para aumentar su estabilidad y facilitar recuperación del producto
- La mayoría se obtienen de hongos y bacterias.
- Algunas son exoenzimas como las producidas por hongos y bacterias gram + producidas en
enormes cantidades y excretadas al medio de cultivo. Al ser extracelulares pueden digerir
polímeros insolubles como la celulosa, almidón y proteínas
Son muy estables y robustas: la amilasa tiene rangos de temperatura y pH muy amplios en las
que no se desnaturaliza. Por ello, amilasas y glucoamilasas tienen importancia comercial en la
producción de jarabe de fructosa (high-fructose syrup).

4.3 Producción de metabolitos microbianos: ácido cítrico, etanol, vitaminas y antibióticos

Los metabolitos primarios se producen en fase exponencial de crecimiento, como el etanol. Son
centrales en el metabolismo.

- La formación de metabolitos primarios depende de las condiciones de cultivo.

Los metabolitos secundarios hasta que las células no llegan a la fase estacionaria o a finales de la
fase exponencial o incluso durante la esporulación ya que no son esenciales para el crecimiento, el
metabolito de interés no comienza a producirse y a acumularse. Por lo que su producción y
acumulación supone más tiempo.

- Son moléculas orgánicas de gran tamaño que requiere un gran número de pasos enzimáticos y
específicos para su síntesis, por ejemplo la síntesis de derivados del colesterol, como cortisona
a partir de acetil-CoA.
- Utiliza sustratos del metabolismo primario para conseguir productos diferentes. Producción de
proteínas recombinantes: insulina, factores de crecimiento…
- La formación de metabolitos secundarios depende de las condiciones de cultivo. Se producen
como un grupo de compuestos biosintéticamente relacionados a partir de importantes
compuestos biosintéticos primarios.
- Para que se de el metabolismo secundario se necesita el isopreno que participa en vías
metabólicas como en la síntesis de esteroles

BIOTRANSFORMACIÓN DE ESTEROIDES

Alteración de colesterol para dar esteroides: Los esteroides son derivados de esteroles, son
hormonas animales importantes y tienen uso en medicina.

EJ : Los corticoesteroides reducen inflamaciones, ayudan a controlar alergias, inflamaciones, artritis…

Los estrógenos y andrógenos son importantes en fertilidad y pueden estimular la producción de masa
muscular. La producción de esteroides puede ser muy costosa y se usan microbios para reducir estos
costes (biotransformación).
 Se realiza en reactores enzimáticos donde el enzima pura está adherido a una matriz y por una
cromatografía en la que se aporta el sustrato ocurre la catálisis enzimática .La fase móvil de la
cromatografía es no polar (aceites orgánicos) ya que si fuese agua podría precipitar el sustrato.

En un tubo de ensayo al que se da el sustrato a a un pool con los enzimas, tras el tiempo necesario
apra que ocurra la reacción enzimática se pueden separar cromatográficamente por polaridad (fase
normal o fase reversa)

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES

Por ingeniería genética se lleva a cabo la clonación y expresión de genes eucariotas en procariotas

 La insulina fue la primera proteína humana producida comercialmente mediante ingeniería

genética.
 La hormona del crecimiento (somatotropina) se clona como cDNA a partir de su mRNA (para
evitar intrones.
 La somatotropina bovina recombinante (rBST) se usa en industria lechera porque estimula la
producción de leche en vacas.

Problemas de la síntesis de proteínas en células recombinantes:

- Degradación por proteasas intracelulares: en E.Coli las proteasas pueden afectar a la expresión
heteróloga una proteína concreta
- La cepa BL21 ….
- Toxicidad en el hospedador bacteriano que para de crecer: en la familia de proteínas SAM
radical protein se intenta modular una síntesis lo más baja posible pero el problema a la hora
de purificar es que se acaba con un gran número de células (biomasa) con baja cantidad de la
proteína que queremos
- Formación de cuerpos de inclusión cuando la proteína expresada precipita y no hay forma de
recuperar las enzimas ya que cuando se desnaturaliza 1 unidad de proteína van todas detrás:
para esto hay que ir al promotor y trabajar con bajas cantidades de IPTG o lactosa para
minimizar la expresión o en E.coli hay cepas desarrolladas para trabajar a bajas temperaturas
por lo que el metabolismo es más bajo. También la aireación detiene la síntesis de proteínas
heterólogas ya que es fundamental mayor inyección de oxígeno para que los cultivos sean más
vigorosos.
-