IDENTIFICACIÓN Y EXTRACCION DE ADN Y ELECTROFORESIS.

Karen cifuentes

FABIAN FRANCISCO FREYLE

SERVICIO NACIONAL DE PRENDIZAJE (SENA)

QUIMICA APICADA A LA INDUSTRIA
QUIMICA
 SOACHA, CUNDINAMARCA
10 ABRIL 2017

Contenido
INTRODUCCION .................................................................................................... 3
OBGETIVOS. ....................................................................................................... 4
MARCO TEORICO. ............................................................................................. 5
EXTRACCIÓN DEL ADN. ................................................................................... 5
ELECTROFORESIS ............................................................................................ 7
MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS. ............................................................. 8
EXTRACCION DE ADN EN VEGETALES. ......................................................... 8
MATERIALES Y EQUIPOS PARA ELECTROFORESIS. ................................... 9
PROCEDIMIENTO. ............................................................................................... 10
PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN. .................................... 10
PROCEDIMIENTO DE ELECTROFORESIS. .................................................... 13
RESULTADOS CONCLUCIONES Y ANALISIS. ......Error! Bookmark not defined.
CONCLUSIONES.....................................................Error! Bookmark not defined.
 INTRODUCCION.

El descubrimiento de los ácidos nucleicos se debe a Meischer (1869), el cual

trabajando con leucocitos y espermatozoides de salmón, obtuvo una sustancia rica
en carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y un porcentaje elevado de fósforo. A
esta sustancia ácida se le llamó en un principio nucleína, por encontrarse en el
núcleo de las células.
Los ácidos nucleicos son macromoléculas complejas de mucha importancia
biológica, portadoras de la información genética formadas por la unión
de nucleótidos mediante enlaces fosfodiester, formando largas cadenas que
pueden alcanzar tamaños muy grandes.
Determinando así que, tanto la molécula de ARN como la molécula de ADN tienen
una estructura de forma helicoidal. Y que la secuencia de estas moléculas a lo
largo de la cadena determina el código de cada ácido nucleico particular. A su vez,
este código indica a la célula cómo reproducir un duplicado de sí misma o las
proteínas que necesita para su supervivencia. Por lo tanto, se han identificado al
menos dos funciones fundamentales de los ácidos nucleicos: transmitir las
características hereditarias de una generación a la siguiente y dirigir la síntesis de
proteínas específicas. Esto constituye el dogma central de la biología, y se podría
representar así:
ADN --------> ARN ---------> PROTEINAS
Replicación --> transcripción --> traducción
El ADN dirige su propia replicación y su transcripción o síntesis a ARN, el cual a
su vez dirige su traducción a proteínas. La replicación y la transcripción difieren en
un aspecto muy importante, durante la replicación se copia el cromosoma de ADN
completo, pero la transcripción es selectiva, se puede regular. Se define como
transcripción al proceso a través del cual se forma el ARN a partir de la
información del ADN con la finalidad de sintetizar proteínas, es decir, realizar la
traducción.
Se podría decir que el ADN sería la copia de la información genética, que
permanece en reserva dentro del núcleo y que el ARN, en cambio, sería la copia
de trabajo de la información genética.
 OBGETIVOS.

 Realizar la extracción de ADN de tejidos vegetales (banano o fresa) con

sencillas técnicas.
 Observar la estructura fibrilar del ADN.
 Familiarizarse con métodos de separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en geles de agarosa.
 Determinación de los tamaños moleculares mediante electroforesis en gel
de agarosa, haciendo una recta patrón con fragmentos de DNA de peso
molecular conocido.
 MARCO TEORICO.

EXTRACCIÓN DEL ADN.

La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas

En primer lugar tienen que romperse la membrana plasmática de la célula
eucariota para poder acceder al núcleo de la célula. En el caso de los vegetales
también habrá que romper la pared celular.
A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el
ADN.
Por último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para
aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.
Como el ADN se encuentra en todas las células de los seres vivos, incluyendo por
supuesto los vegetales, intentaremos extraer esta importante molécula a partir de
cualquier fruta.
El proceso de extracción de ADN desde una célula es el primer paso para muchos
procedimientos (protocolos) de los laboratorios de biotecnología.
Los científicos deben ser capaces de separar suavemente el ADN de sustancias
no deseadas que se encuentran en las células, evitando que el ADN se
desnaturalicé (que se rompa).
El material que se necesita para ello es fácil de encontrar y el procedimiento es
sencillo .Cada uno de los ingredientes tiene su propia función. La solución de sal y
jabón sirve para romper la membrana plasmática y nuclear e incluso la pared
celular. El líquido de lentillas elimina las proteínas que degradan el ADN. El
alcohol etílico sirve para precipitar el ADN
-EL ADN
El ADN constituye el material hereditario de un individuo. En él están escritas las
instrucciones que deben seguir las células para construir un organismo y
mantenerlo vivo. Todas las células que forman un individuo contienen una copia
idéntica de ADN. Cada una de ellas, sin embargo, lee una parte de estas
instrucciones y por eso hay células con diferentes formas y funciones.
Está formado por desoxiribonucleotidos (A, G, C, T). Que a su vez están formados
por un azúcar D desoxirribosa y un ion fosfato.
La proporción y secuencia de las bases nitrogenadas diferencia a los poli
nucleótidos.
El ADN presenta dos niveles de plegamiento que dan lugar a:
Estructura primaria:
Los poli nucleótidos se forman entre las bases nitrogenadas de adenina, guanina,
citosina y timina por enlaces covalentes de tipo fosfodiester. Así se forma un
esqueleto de polidesoxiribosa-fosfato, de forma que queda un extremo con -OH 3´
libre y un extremo 5´ con un grupo fosfato libre.
Estructura secundaria
Tiene un empaquetamiento espacial pero no se altera.
Dentro de la estructura secundaria hay 3 modelos:
El modelo de la estructura secundaria del ADN en forma de doble hélice dextrógira
(forma B). Las dos hebras son anti paralelas es decir si una presenta la dirección
5´->3´, la otra posee la dirección 3´->5´.
El conjunto se pliega sobre sí mismo obligado por los puentes de hidrógeno entre
diferentes regiones de la molécula, hasta adoptar la conformación más estable,
que es la de doble hélice. Este enrollamiento entre las 2 hebras de la doble hélice
es dextrógiro es decir gira a derechas y de tipo plectonémico, como si estuvieran
trenzadas.
Las secuencias de bases son complementarias, pues hay una correspondencia
entre las bases de ambas cadenas .La adenina sólo puede estar frente a la timina
y la guanina frente a la citosina. Así las bases púricas están enfrentadas a las
bases pirimidínicas y la unión se realiza por puentes de hidrógeno en los pares
A=T y tres en los pares G-C
La correspondencia entre las bases es la causa de que las dos cadenas de la
doble hélice de ADN posean secuencias complementarias.
Además los pares de bases están horizontales y el eje los atraviesa por el centro.
.Modelo hélice A: En este modelo los pares de bases nitrogenadas están
inclinados hacia el exterior pero la hélice al igual que la del ADN B es dextrógiro
. Modelo hélice z: En este modelo las cadenas de ADN no se enrollan en forma de
doble hélice sino en forma de zigzag.
ELECTROFORESIS

Fundamento teórico
La gran mayoría de las moléculas de origen biológico están cargadas
eléctricamente y esta característica les confiere la propiedad de moverse a través
de un campo eléctrico. El método por el cual estas moléculas, especialmente
proteínas y ácidos nucleicos migran en un campo eléctrico, se denomina
electroforesis.
La velocidad de migración o movilidad electroforética a través del campo depende
de la fuerza misma del campo, de la carga neta, del tamaño y la forma de la
molécula, así como de la fuerza iónica, la viscosidad y la temperatura del medio en
el cual migran las dichas moléculas (Freifelder, 1982).

Como una herramienta analítica, la electroforesis es una técnica simple, rápida y

altamente sensible. Se usa en el estudio de las propiedades de especies cargadas
y también como técnica de separación.

En el caso de las moléculas de DNA, están se hallan cargadas negativamente

debido a la presencia de los grupos fosfato. Para su separación electroforética con
base en el tamaño se usa una matriz de agarosa preparada a una concentración
definida en un tampón de pH alcalino, la cual permite migrar más rápidamente a
las moléculas pequeñas que a las grandes.

Al final de la electroforesis, las moléculas de DNA son reveladas con un

compuesto fluorescente, tal como SybrGreen, que se intercala en las bases
nitrogenadas y produce fluorescencia que permite visualizar las bandas con luz
ultravioleta.
 MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS.

EXTRACCION DE ADN EN VEGETALES.

• 2 vasos de precipitado • 1 gradilla

• 1 probeta • Centrifuga
• 1 Mortero • Alcohol etílico 96% frio (se
• 1 pipeta deja 15 minutos en el frezzer
• 1 Erlenmeyer antes de la prueba)
• 2 tubo de ensayo con rosca • Agua destilada
• 1 Agitador de vidrio • Detergente claro o tween 80
• 2 filtros de papel o toalla • 1 Banano- 3 fresas -1
absorbente cebolla cabezona (1
• 1 palillo muestra diferente por cada
• 1 embudo grupo) NaCl
• 1 tubo eppendorf
MATERIALES Y EQUIPOS PARA ELECTROFORESIS.

• Buffer 10X TBE/TAE • Tubos de PCR o papel no

• Agarosa absorbente limpio (Parafilm)
• Agua grado molecular • Erlenmeyer
• Sybr Green – Dilución • Probeta de 100ml
1:100.000 en TAE • Micro pipetas y puntas
• Tampón de carga de amarillas
electroforesis – 6X (Rojo • Balanza
cresol) • Cámaras de electroforesis
• Marcadores de peso molecular • Horno microondas
– 100 – 1500pb • GelDoc luz UV.
 PROCEDIMIENTO.

PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DE ADN.

1. En un mortero macerar media banana y 3 fresas.

Colocar la muestra en un vaso de precipitado e ir agregando agua destilada
(100ml). Mezclar bien.

2. En un vaso de precipitado diferente, preparar una solución

consistente con 20g de detergente y 10g de sal. Agregar 20 ml de
agua destilada. Disolver la sal y el detergente revolviendo lentamente
evitando formar espuma.
 3. A la solución preparada en el paso 2, agregar la mitad de la mezcla
de banana/fresas o cebolla del paso 1.

4. Mezclar la solución por 5-10 minutos.

5. colocar el papel filtro o absorbente en el embudo y dentro de un

Erlenmeyer. Filtrar la mezcla vertiéndola dentro del filtro y dejar que la
solución drene por algunos minutos hasta obtener 5 ml
aproximadamente de filtrado.

1
Filtrado de 2 banano macerado. Filtrado de 3 fresas maceradas.

6. Colocar 15ml de alcohol frio en un tubo de ensayo.

7. Adicionar al tubo de ensayo donde se encuentran los 15mL de
alcohol, 5 ml de la solución filtrante del paso 6 lentamente. El ADN no
es soluble en alcohol. Cuando la mezcla se le agrega al alcohol, los
componentes, excepto el ADN, permanecen en la solución mientras el
ADN precipita en la capa de alcohol.

8. Dejar la solución reposar por 5 minutos sin mover. Es importante no

batir el tubo de ensayo. Se puede observar el ADN blanco el cual
precipita en la capa de alcohol. El ADN tiene la apariencia de mucus
blanco y fibroso.

9. Tomar con un palillo el ADN, adicionarlo a un tubo eppendorf y

centrifugar a 12.000rpm por 10 minutos.
PROCEDIMIENTO DE ELECTROFORESIS.

1. Pesar en la balanza 0.8 gramos de agarosa que es la cantidad

requerida para preparar un gel con una concentración del 0.8% (p/v)
para los DNAs aislados.

2. Disolver en un buffer TBE/TAE y calentar en horno microondas hasta

completa disolución.
Preparación del buffer a una concentración 1X, partiendo del buffer
10X: Verificar cuanta cantidad de gel vamos a preparar, es decir,
adicionar agua en la cubeta pequeña y mirar cuanto le cabe hasta
que cubra los peines. Pero podríamos preparar 100ml de buffer, así,
tomando 10ml de buffer y 90ml de agua grado molecular.

3. Llevar a calentar en plancha de calentamiento por 1 min aprox. hasta

su completa disolución (Tener cuidado de que no se evapore).
4. Dejar enfriar hasta 50 °C aprox.

5. Agregar 4 µl de Sybr Green por cada 10 ml de gel.

6. Mientras la agarosa se enfría, preparar el casete de montaje del gel.

7. Servir la agarosa y dejar gelificar.

8. Transferir el gel a la cubeta de electroforesis, la cual debe contener

buffer TAE 1 X en cantidad suficiente para cubrir el gel, aprox. 5mm
arriba.

9. ¿Cuánta muestra adicionaremos a los pozos generados por los

peines?

a. Para el caso en que tengamos una baja concentración de ADN: Tomar

10 µl de ADN extraído + 6 µl de rojo cresol en un tubo de PCR (o papel
Parafilm) y agitar con pipeteo, para mezclar bien.
b. Para el caso en que tengamos una alta concentración de ADN: Tomar
3 µl – 5 µl de ADN extraído + 2 µl de rojo cresol en un tubo de PCR (o
papel Parafilm) y agitar con pipeteo.

10. Tomar toda la muestra del tubo de PCR y adicionar en el pozo del gel.
También adicionar patrones de tamaño molecular.
11. Correr la electroforesis a 80 voltios durante 50 minutos, hasta que
alcance aprox. la mitad del gel.

12. Llevar el gel al GelDoc de luz ultravioleta para visualizar las bandas.
Tomar registro fotográfico.