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UNIVERSIDAD NACIONAL MICAELA BASTIDAS DE APURIMAC

FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

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ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

TOLERANCIA DE LEVADURAS AL ETANOL Y ÁCIDO

ACÉTICO A CONDICIONES ANAERÓBICAS

ASIGNATURA: BIOTECNOLOGIA AGROINDUSTRIA

DOCENTE: ING. ÉDISON CHICCLLA KARI

ESTUDIANTES:

1. UNZUETA CONTRERAS JENIFER M.

2. TICA LEON RONY

3. CCONAYA PUGA TANIA

FECHA DE EJECUCIÓN: 18/06/18

FECHA DE ENTREGA: 24/06/18


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I. RESUMEN

En esta práctica de tolerancia de levaduras (Saccharomyces cerevisiae), en etanol a condiciones

anaeróbicas se realizó en el laboratorio de biotecnología agroindustrial de E.A.P.I.A, de la cual se

dividió en grupos para realizar la práctica.

Se trabajó con 10 ml de medio de fermentación que fue glucosa 20g/l, KH2PO4 g/l, (NH4)2SO4

2.0 g/, extracto de levadura 1.0 g/l. el medio de fermentación se ajustó a un pH 4.0 con HCL al 5%

, se colocó 10 ml de medio de fermentación a cada tubo de ensayo, seguidamente se colocaron los

tubos Durham en cada uno de ellos y se llevó a esterilización a 121°C por 20 minutos a 15

libras/pulg2. La cantidad de etanol a adicionar al medio esterilizado en los tubos de ensayo fueron

4.0% v/v, 6.0% v/v, 8.0% v/v, 10.0% v/v, 12.0% v/v, de las cuales los ensayos se llevaron a cabo

por duplicado, observándose la producción de CO2 bajo diferentes concentraciones de etanol, la

cepa de Saccharomyces cerevisiae se llevó a 30°C, durante 72 horas.

1.1. OBJETIVOS

 Evaluar y determinar la tolerancia exógena del etanol sobre Saccharomyces cerevisiae

y levaduras aisladas (Saccharomyces SP).

 Evaluar la tolerancia del ácido acético exógeno sobre Saccharomyces cerevisiae y

levaduras aisladas (Saccharomyces SP).

 Determinar los procesos de fermentación con fines tecnológicos


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II. INTRODUCCIÓN

Los primeros microorganismos utilizados como fuente de proteínas, fueron las levaduras,

principalmente la Saccharomyces cerevisiae, que aún hoy día es la principal fuente de proteína

unicelular (SCP), como también se conoce a la proteína obtenida de la biomasa microbiana, con

una producción de 200 000 t anuales en peso seco.

La levadura S. cerevisiae es probablemente el microorganismo más ampliamente utilizado por

el hombre a través del tiempo; aunque no se tuviera, en un principio, conciencia plena de la

participación del microorganismo en la elaboración de diversos alimentos como el pan o las

bebidas alcohólicas.

El alcohol o etanol es el producto de la fermentación alcohólica efectuada por microorganismos,

que tienen la capacidad de fermentar la glucosa.

El desarrollo tecnológico alcanzado en la producción de levadura de panificación a finales del

siglo XIX y principios del XX, permitió conocer a fondo los mecanismos biológicos de

multiplicación de esta levadura y contar con el equipamiento necesario para su producción.

Este trabajo se propone indagar sobre la producción de alcohol y levadura, así como las tendencias

actuales de su producción en Cuba y el mundo.

Levadura es un nombre genérico que agrupa a una variedad de organismos unicelulares,

incluyendo especies patógenas para plantas y animales, así como especies no solamente inocuas

sino de gran utilidad.


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III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

3.1.Levaduras generalidades

Levadura es un nombre genérico que agrupa a una variedad de organismos unicelulares,

incluyendo especies patógenas para plantas y animales, así como especies no solamente inocuas

sino de gran utilidad,

Las levaduras han sido utilizadas, desde la antigüedad, en la elaboración de cervezas, pan y

vino, pero los fundamentos científicos de su cultivo y uso en grandes cantidades fueron

descubiertos por el microbiólogo francés Louis Pasteur en el siglo XIX (Hernández, Maza, &

Lozano, 2003)

Se conocen cepas diferentes y específicas para cada labor (panificación, destilería, producción

de extractos de levadura y uso en animales).

Las levaduras son organismos eucariotas con gran diversidad respecto a su tamaño, forma y

color. Son consideradas hongos unicelulares y generalmente sus células son ovaladas, pero

también pueden encontrarse en forma esférica, cilíndrica o elíptica. Son mayores que las bacterias,

alcanzando un diámetro máximo de entre cuatro y cinco μm. Se reproducen por fisión binaria o

gemación y algunas pueden ser dimórficas o bifásicas y crecen como micelio bajo condiciones

ambientales especiales (Ochoa & Vázquez, 2004). Son resistentes a antibióticos, sulfamidas y

otros agentes antibacterianos de forma natural. Se conoce la secuencia completa de su genoma y

se mantiene en constante revisión, lo que ha permitido la manipulación genética de los casi 6600

genes que codifican el genoma de levadura.

Los constituyentes macromoleculares de las levaduras incluyen proteínas, glicoproteínas,

polisacáridos, polifosfatos, lípidos y ácidos nucleicos. Su pared celular comprende entre 15 y 25


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% de la masa seca de la célula y sus principales componentes son polisacáridos (80-90 %),

esencialmente glucanos y mananos, con una menor contribución de quitina, además de proteínas

y lípidos (Rojas, 1995)

El contenido de proteínas en las levaduras varía entre el 40 y el 50 % de su peso seco y tienen

una excelente calidad en función de su perfil de aminoácidos esenciales (Valinote, 20011).

La mayoría de las levaduras toleran un rango de pH entre 3 y 10, pero les resulta favorable un

medio ligeramente ácido con un pH entre 4,5 a 6,5. Son capaces de competir con la bacteria

Streptococcus bovis, el principal productor de ácido láctico en el rumen, por azúcares solubles.

Las levaduras más estudiadas en el mundo son cepas provenientes de las especies:

Saccharomyces cerevisiae (levadura panadera comercial), Kluyveromyces fragilis y Candida

utilis. Estas especies son consideradas como aptas para el consumo humano o GRAS (por las siglas

en inglés de Generally Recognized As Safe) (Anon, 2005).

3.1.1. Saccharomyces cerevisiae Características

Saccharomyces cerevisiae, es una levadura que constituye el grupo de microorganismos más

íntimamente asociado al progreso y bienestar de la humanidad; su nombre deriva del vocablo

Saccharo (azúcar), myces (hongo) y cerevisiae (cerveza) . Es una levadura heterótrofa, que obtiene

la energía a partir de la glucosa y tiene una elevada capacidad fermentativa, puede aislarse con

facilidad en plantas y tierra, así como del tracto gastrointestinal y genital humano (Leimer &

Finguerut, 2005)

El uso más extendido está enmarcado en la panificación y en las industrias de fabricación de

cerveza, vinos y alcohol. La levadura inactivada por temperatura se usa como fuente de
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nutrimentos en alimentación animal y humana, tanto en forma de levadura íntegra como a partir

de sus derivados.

Tabla 1. Composición de la levadura Saccharomyces

Componentes (Otero & (García, Suarez, (Otero & (Yamada,


Domenech,
(%) Almazán) Blanco, & Almazán) Alvim, &
Santiesteban,
Sgabieri, 2003)
2000)
polisacaridos 29,71 34,1 36 31,40

Trehalosa NR 5 NR NR

Ácidos nucleicos
10,65* 10,8 7,41* 9,00*
y nucleótidos

Fosfolípidos 1,18 4,5 2,63 0,5

Triglicéridos NR 2,5 NR NR

Esteroles NR 1 NR NR

Ceniza 8,32 3,1 7,34 4,60

Proteína 40,20 39 44,7 42,67

3.2.Recuperación de levadura

A lo largo del proceso de fermentación, la levadura se desarrolla prodigiosamente,

constituyendo un producto muy valioso, tanto al ser recuperada para su empleo como alimento

animal (en crema o seca) como para recircularla al proceso y reiniciar la fermentación (Estévez,

2010).
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Decisivo en la calidad de la levadura recuperable, es el modo de conducir el proceso

fermentativo, el esmero con que se realicen todas las operaciones y la preocupación constante para

evitar los errores (Estevéz, 2015).

Después de la fermentación, las levaduras son separadas por centrifugación y lavadas. Se pasan

por filtros prensas o rotatorios para disminuir el contenido de agua, hasta obtener un producto de

68 o 70 % de humedad, conocido como levadura prensada, la cual se envasa en bloques o en

forma granulada en sobres de nylon. Esta levadura se almacena bajo refrigeración.

La levadura seca activa, es otra variante de la levadura panadera y se utiliza en caso de no

existir refrigeración o por requerirse períodos prolongados de almacenamiento. Consiste en secar

la levadura en secadores de lecho fluidizado de atomización o al vacío. Se obtiene una levadura

con 8 % de humedad que conserva su actividad biológica. El producto se envasa en recipientes

herméticos.

Tanto la producción de levadura como la de etanol son reacciones exotérmicas, por lo que es

necesario eliminar el calor desprendido en el transcurso de la fermentación y mantener la

temperatura cerca del valor óptimo (33 a 34 °C); de lo contrario la temperatura aumenta hasta 40

o 42 °C con sensibles pérdidas en el rendimiento. Se considera un índice apropiado de liberación

de calor el de 287 Kcal l-1 de etanol formado.

3.3.Factores a tener en cuenta para el crecimiento y desarrollo de la levadura

Presión osmótica: la nutrición de la levadura es un proceso puramente osmótico, es importante

evitar medios hipertónicos o hipotónicos para evitar la plasmoptisis y plasmólisis. El estrés

osmótico puede causar una disminución en el volumen celular, afecta además, la velocidad de

fermentación, así como la viabilidad celular (Seo, 2005).


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Temperatura: las altas temperaturas ocasionan una disminución de la biomasa, producto de un

descenso en el contenido de proteínas, RNA; DNA y aminoácidos libres e induce a la rigidez de

la membrana celular. Temperaturas muy bajas provocan un estado de latencia en la célula,

deteniendo su desarrollo (TomassO, 2004).

Desecación: es uno de los principales agentes que inhiben las actividades y desarrollo de los

microorganismos.

Luz: en general la luz es perjudicial para los microorganismos que carecen de clorofila, o

cualquier otro pigmento que les permita usar la energía de las radiaciones en el proceso de

fotosíntesis.

pH: el pH óptimo en el cual se desarrollan mejor los microorganismos, está entre 4 y 5. Las

levaduras tienen la ventaja de soportar, medios más ácidos, que otros microorganismos, lo que es

aprovechado en los procesos industriales para mantener el medio controlado de bacterias que

puedan competir por el sustrato (Beltran, y otros, 2002)

Alcohol: el efecto del etanol en la célula es una combinación de inhibición del crecimiento y

disminución de la viabilidad, puede actuar como inhibidor de la fermentación a partir de un 8 %.

(Riegel & Kent, 2003) afirma, que no es recomendable terminar la fermentación con un grado

alcohólico muy elevado.

3.4.Influencia de etanol sobre el metabolismo de levaduras

El etanol inhibe la viabilidad de las levaduras, la tasa específica de crecimiento y la tasa

específica de fermentación; además de esto, la composición del medio, concentración de azúcar,

pH y la temperatura afectan esta inhibición.1 Hay algunas teorías acerca de la inhibición del
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crecimiento y fermentación relacionadas a la producción de etanol, se produce un decrecimiento

del contenido de esteroles en la membrana celular y esto puede afectar el transporte de azúcares,

las enzimas del metabolismo de azúcares son inhibidas por los productos que se sintetizan durante

la fermentación, el etanol parece tener un efecto inhibitorio sobre la actividad de la hexoquinasa y

consecuentemente sobre el funcionamiento de la glucólisis.

Hoy en día es asumido que la tolerancia al etanol depende de la habilidad de las células de

levadura para exportar etanol al medio externo, un proceso que depende grandemente de la

composición de la membrana celular y de la fluidez.5 Además, la permeabilidad del etanol desde

afuera hacia adentro de la célula es muy baja, lo cual explica el hecho de que el etanol adherido al

medio es menos inhibitorio que el etanol producido por las células.

Los lípidos y esteroles de la membrana celular de levaduras son importantes porque ellos

afectan el transporte de soluto y la tolerancia al etanol. Al preparar un inóculo bajo condiciones

aeróbicas, incrementa el contenido de esteroles en la membrana celular y ayuda durante la

fermentación anaeróbica reteniendo la vitalidad celular, por esta razón ellos son conocidos como

factores de sobrevivencia.

Muchos experimentos mostraron que la incorporación de ácido linoleíco, ergosterol u otro ácido

graso insaturado y esterol en la membrana celular de la levadura, incrementa su permeabilidad al

etanol, y permite una alta tasa de transporte de etanol hacia fuera de la célula. Cuando no se

suplementa con ácidos grasos o esteroles al medio de cultivo, la célula podría sintetizarlos cuando

hay disponible oxígeno en el medio, pero no en la total ausencia de él. Esta es la razón del

mejoramiento a la tolerancia bajo condiciones micro-aeróbicas.


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Bajo condiciones anaeróbicas el contenido de esterol cae rápidamente y la actividad

fermentativa se retrasa, por esta razón, en la elaboración de vinos es necesario una aereación

intermitente de por lo menos de cinco minutos para inducir la síntesis de esteroles.

Ocasionalmente, durante la elaboración de vinos, y otras bebidas fermentadas se puede también

necesitar una aereación intermitente para animar el crecimiento de la levadura y así conducir sin

duda a la formación de ergosterol.

El crecimiento en la presencia de etanol conlleva a la adaptación de la célula al etanol y a una

elevada tolerancia al etanol, durante este proceso toma lugar cambios en la composición de ácidos

grasos, fosfolípidos y esteroles de la membrana citoplasmática.

El etanol y el ácido acético son bien conocidos como inhibidores del crecimiento y son usados

como agentes antimicrobianos. Por otro lado, estos compuestos son sub-productos o substratos de

fermentación, así el ácido acético es un sub-producto de la producción de etanol e inhibe la

fermentación a altas concentraciones, el mecanismo de su toxicidad envuelve la acidificación del

citoplasma y modificación de ciertas enzimas de la glucólisis, (Pampulha & Loureiro Días, 1990).

3.5.Tendencias actuales del uso de levadura S. cerevisiae

Las levaduras se emplean actualmente para la producción comercial de cantidades relevantes

de alcohol dehidrogenasa, gliceraldehído-3-hidrogenasa, hexoquinasa, lactato hidrogenasa,

glucosa6-fosfato hidrogenasa, así como Coenzima A, nucleótidos difosfopiridinos y mono, di y

tri-fosfatos de adenina, guanina, citidina y uridina, citado por (Otero & Almazán). La levadura

Saccharomyces cerevisiae es la fuente tradicional de invertasa, que tiene un apreciable significado


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comercial y se emplea en modo creciente en la producción de bebidas, en la industria repostera y

en la agricultura, así como para fines investigativos y tecnológicos.

Debido a la propiedad de las levaduras de acumular cantidades variables de los minerales

presentes en su medio de cultivo, el contenido de minerales de células de levadura, cultivadas en

un medio particular de propagación, puede ser ajustado para resultar de significación como

suplemento de salud o nutricional para animales y humanos.

IV. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO

4.1.MATERIALES

Levadura 10 g Pipetas de 0.1 ml, 2ml, 01c/u


Saccharomyces 5ml
cerevisiae
Glucosa 100g Vasos de precipitación de 01
250ml
(NH4)2SO4 5.0g Tubos de ensayo 10
Extracto de levadura - Tubos Durham 10
KH2PO4 4.0 g Bagetas 01
Glicerol - Espátulas -
Agua destilada --- Pizetas 01
HCl al 5% --- Algodón Rollo
Balanza analítica de 3 01 Rotulador 01
decimales
pH metro 01
Matraces Erlenmeyer de 1L 01 Espectrofotómetro ---

Matraces Erlenmeyer de 04
250ml
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4.2.PARTE EXPERIMENTAL

Preparación de inóculo

Preparar 100 ml de una solución que contenga: 0.5 % de extracto de levadura, 0.4%

de KH2PO4, luego de esterilizarlo a 121 ºC por 20 minutos a 15 libras/pulg2, agregar

asépticamente 5.0 g de levadura Saccharomyces cerevisiae y agitarlo.

0.4% KH2 PO4 Preparación del inóculo PH: 3.8 ajustado


0.5% de extracto de
levadura
Esterilizar a 121 °C x 20 min a
Esterilizar
15 libras/ pulg2
Inocular

Siembra y Incubar 24 horas a 48ºC

cultivar 28

A.- Medio de fermentación para ensayos de tolerancia a etanol y ácido acético

Colocar en tubos de ensayo (20 tubos), 10 ml de medio de fermentación con la

siguiente composición: Glucosa 20 g/L, KH2PO4 5.0 g/L, (NH4)2SO4 2.0 g/L, extracto

de levadura 1.0 g/L. El medio de fermentación se ajusta a pH 4.0 con HCl al 5% y se

esteriliza a 121 ºC por 20 minutos a 15 libras/pulg2, antes de adicionar los volúmenes

correspondientes de etanol y ácido acético.

PROCEDIMIENTO

Tolerancia al etanol por Saccharomyces cerevisiae a condiciones anaeróbicas


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Se colocan 10 ml de medio de fermentación A en cada tubo de ensayo, seguidamente

se colocan los tubos Durham en cada uno de ellos y se esterilizan a 121 ºC por 20 minutos

a 15 libras/pulg2 .Los ensayos se llevan a cabo por duplicado, se observa la producción

de CO2 bajo diferentes concentraciones de etanol, la cepa de Saccharomyces

cerevisiae se ensaya a 28 ºC, durante 72 horas. La cantidad de etanol a adicionar al

medio esterilizado en los tubos de ensayo es la siguiente: 4.0 % v/v, 6.0 % v/v, 8.0 %

v/v, 10.0 % v/v y 12.0 % v/v.

Tolerancia al ácido acético por Saccharomyces cerevisiae a condiciones anaeróbicas

Se colocan 10 ml de medio de fermentación A en cada tubo de ensayo, seguidamente

se colocan los tubos Durham en cada uno de ellos y se esterilizan a 121 ºC por 20 minutos

a 15 libras/pulg2 .Los ensayos se llevan a cabo por duplicado, se observa la producción

de CO2 bajo diferentes concentraciones de etanol, la cepa de Saccharomyces

cerevisiae se ensaya a 28 oC, durante 72 horas. La cantidad de ácido acético a adicionar

al medio esterilizado en los tubos de ensayo es la siguiente: 0.1 % v/v, 0.2 % v/v, 0.5 %

v/v, 1.0 % v/v y 2.0 % v/v.

 Mediciones:

1. Observación de la producción de CO2 a las 72 h en los tubos de ensayo por Saccharomyces

cerevisiae en los ensayos de tolerancia a etanol y ácido acético. Tomar como referencia lo

siguientes parámetros:

Donde:
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- = Nulo + = Débil ++ = Moderado +++ = Intenso

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES

5.1.RESULTADOS

Tabla 01: Evaluación de la tolerancia al etanol exógeno por Saccharomyces


cerevisiae

Reacciones %
durante la ETANOL
Tiempo
fermentación 4% 6% 8% 10% 12 %
1° 2° 1° 2° 1° 2° 1° 2° 1° 2°
Formación de - +++ ++ +++ + +++ +++ +++ + +
CO2
Formación de +++ + +++ ++ ++ + + + +++ +++
Film
Precipitación ++ +++ +++ ++ + +++ +++ +++ ++ ++
Formación de + +
espuma +++ ++ ++ +++ ++ + + +
Formación de - +++ - +++ -- +++ +++ +++ - -
CO2
Formación de ++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ +++ ++ +++
Film
Precipitación +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++
++++
Formación de ++ +
espuma +++ - +++ + +++ - - +
Fuente: elaboración propia
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5.2.DISCUSIONES.

Concentraciones crecientes de etanol hacen disminuir la T° máxima de crecimiento, fenómeno

ya observado por van Uden y da Cruz Duarte (1981). Esto se debe a una activación de la muerte

por etanol (leao y van Uden, 1975).

La producción de CO₂, film, y la formación de espuma en 24 horas en las diferentes

concentraciones de alcohol fueron en su gran mayoría intensas y moderadas y a las 48 horas con

las mismas concentraciones hubo un cambio, observándose con mayor visibilidad con

características como intensas.

Se ha investigado la base genética que hace de saccharomyces un organismo adaptado al etanol,

capaz de fermentar y crecer en medios con concentraciones de etanol muy superiores a las que

toleran las bacterias y otros organismos. Previamente se observó que el nivel de ploidia no afecta

en S. cerevisiae ni el grado de inhibición por etanol de µ ni a las tolerancias al crecimiento y la

fermentación (TomassO, M., 2004)

Concentraciones crecientes de sacarosa en el medio hacen de la tasa de crecimiento de las

células se inhiba siguiendo una curva sigmoidal, y que su temperatura máxima de crecimiento

disminuya. A concentraciones de sacarosa del 30% p/v las células producen la concentración

máxima de etanol. A concentraciones de sacarosa inferiores, la fermentación se detiene por efecto

exclusivo del etanol producido; a concentraciones superiores, por efecto conjunto de este y la

sacarosa del medio.


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VI. CONCLUSIONES

Se puede concluir y determinar que los tratamientos que se realizaron con etanol mostraron

variaciones en cuanto y tanto a formación de CO₂, film, precipitación y formación de espuma con

las diferentes cantidades de alcohol que se trabajó en dicha práctica.

No se logró evaluar la tolerancia del ácido acético exógeno sobre Saccharomyces cerevisiae y

levaduras aisladas (Saccharomyces Sp) debido a la falta del ácido acético.


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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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VIII. CUESTIONARIO.

8.1.¿Explique el fenómeno de tolerancia e inhibición de la fermentación por etanol y ácido

acético. Qué levaduras son altas productoras de ácido acético?

La presencia del ácido acético ha sido mencionada como una causa de reducción de la capacidad

de saccharomyces para el transporte y la retención de la tiamina [33] Así, una causa probable de

las fermentaciones lentas que se presentan en los mostos no inoculados es la reducción de la

tiamina por parte de las levaduras salvajes con la producción del ácido acético que inhiben el

trasporte de las vitaminas residuales en saccharomyces.

Otra de las principales causas de las paradas de fermentación es la toxicidad del etanol [14, 18,

34, 77, 78]. El etanol parece afectar la fluidez de la membrana plasmática de una manera completa.

8.2.Qué implicancia tiene el sulfito en la producción de etanol y glicerol en

Saccharomyces cerevisiae?

Su actividad fermentativa no es inhibida a concentraciones de hasta 200 mg/L de sulfito de

sodio en el medio. Además, produce etanol hasta 6.88±0,1% v/v. La agitación del medio de cultivo

incrementa la producción de alcoholes superiores (843.7 mg/L) y por el contrario disminuye la

producción de glicerol (0.18±0.2g/L) y ácido acético (56.0±8.5 mg/L).

8.3.¿Qué soluciones plantearía Usted si un proceso de fermentación se detendría

y no se llegaría a la conversión total del azúcar en etanol?

Se ha mostrado diversos factores que provocan fermentaciones enólogas lentas o incompletas.

Aunque las causas precisas de las fermentaciones lentas o detenidas pueden ser difíciles de

determinar, conocer la tipología de parada puede ser bastante útil para limitar el número de

posibilidades. Prestar atención al número de células viables de saccharomyces, el uso razonado del
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enfriamiento y del mantenimiento de la temperatura junto con un uso prudente de los suplementos

nutritivos debería reducir de forma importante la incidencia de las fermentaciones lentas o

incompletas.
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FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

IX. ANEXOS

Figura 01. Ajuste de pH Figura 02. Esterilización de los

de medio de fermentación. medios de inoculo y fermentación.

Figura 03. Añadiendo 10 ml del medio Figura 04. Introducción de

de fermentación a los tubos de ensayo. Durham a los tubos de ensayo.

Figura 05. Tubos de ensayo con

diferentes volúmenes de alcohol.

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