AUTOFAGOCITOSIS

O
AUTOFAGIA

Dra. María Isabel Colombo

Profesora Titular de Biología Celular y Molecular
FCM-U.N. CUYO

CRECIMIENTO CELULAR

SÍNTESIS DEGRADACIÓN

1
 DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS
INTRACELULARES

• Impide la acumulación de proteínas mal

sintetizadas o mal plegadas

• Participa en el control metabólico de la célula,

eliminando proteínas no necesarias o que ya
cumplieron su función (ej. ciclinas)

• Es la principal fuente de aminoácidos cuando

aumentan las necesidades metabólicas o
disminuye el aporte de nutrientes.

DEGRADACIÓN INTRACELULAR

NO LISOSOMAL LISOSOMAL

• Es llevada a cabo por el • Es llevada a cabo en el

proteosoma lisosoma

• Degradación de proteínas • Degradación de proteínas

de vida media larga
de vida media corta
• Involucra procesos como
• Involucra el sistema de
la endocitosis, fagocitosis
ubiquitinación y autofagocitosis

2
 AUTOFAGOCITOSIS

AUTOFAGOCITOSIS
• Permite la degradación de macromoléculas
citosólicas (ribosomas, RNA) y de comparti-
mientos membranosos: organelas envejecidas,
hipertrofiadas

• Participa en la remodelación celular durante la

diferenciación, metamorfosis, envejecimiento,
cáncer, enfermedades neurodegenerativas
(Alzheimer).

• Mantiene el suministro de aminoácidos en

ayunos prolongados mediante el secuestro
inespecífico de proteínas citosólicas.

3
MADURACIÓN DE LA VACUOLA AUTOFÁGICA
FAGOFORO

ENDOSOMAS LISOSOMAS

AUTOFAGOSOMA ANFISOMA AUTOFAGOLISOSOMA

Autofagosomas: microscopía electrónica

4
 Autofagosomas: microscopía electrónica

REGULACIÓN DE LA AUTOFAGIA

• HORMONAS:
- Insulina: inhibe la autofagocitosis
- Glucagón: estimula la autofagocitosis

• AMINOÁCIDOS: la autofagia aumenta

cuando disminuye la concentración de AA
en el líquido extracelular. Leu, Tyr, Phe, Gln,
Pro, Met, His y Trp

5
 REGULACION DE LA AUTOFAGIA

• La autofagia es estimulada por el ayuno

(falta de aminoácidos y suero) y es inhibida
en condiciones ricas en nutrientes.

• Una quinasa llamada Tor (Target of

rapamycin) es parte de la cascada de
traducción de señales involucrada en
sensar el ambiente nutricional.

+ aminoácidos - aminoácidos

TOR Wortmanina
3-metiladenina
Rapamicina

PI3K

Autofagia

6
 MATURATION OF THE AUTOPHAGIC VACUOLE
FAGOFORO
Ayuno ↑
Rapamicina ↑↑

ENDOSOMAS LISOSOMAS

LC3

AUTOFAGOSOMA ANFISOMA AUTOLISOSOMA

LC3 localiza en autofagosomas

después de ser procesada

AUTOFAGIA
LC3-I LC3-II
Citosol Asociada a membranas

7
 Visualización de autofagosomas
marcados con la proteína GFP-LC3
GFP LC3

Células CHO
GFP-
GFP-LC3

+ aminoácidos - aminoácidos
(ayuno)

Fusión de MVBs con autofagosomas

EGFP-Rab11wt (MVBs)
RFP-LC3 (autophagosomes)

8
 Monodansilcadaverina (MDC)

• compuesto autofluorescente
• marcador de autofagosomas

Vacuolas marcadas con MDC

Control Ayuno (- AA)

9
 + aminoácidos - aminoácidos

TOR Wortmanina
3-metiladenina
Rapamicina

PI3K

Autofagia

INHIBIDORES DE LA VÍA AUTOFÁGICA

FAGOFORO

WORTMANINA LISOSOMAS
3-METIL-ADENINA

AUTOFAGOSOMA ANFISOMA AUTOFAGOLISOSOMA

10
Wortmanina inhibe el procesamiento de LC3
y la formación de autofagosomas

Ayuno Ayuno + Wortmanina

Wortmanina: inhibidor de PI3K

INHIBIDORES DE LA VÍA AUTOFÁGICA

FAGOFORO

LISOSOMAS

VINBLASTINA

AUTOFAGOSOMA ANFISOMA AUTOFAGOLISOSOMA

11
 Vinblastina genera grandes vacuolas
autofágicas que se marcan con MDC

- Vbl

+ Vbl

AUTOFAGOCITOSIS o AUTOFAGIA
• Permite la degradación de macromoléculas
citosólicas (ribosomas, RNA) y de compartimientos
membranosos (organelas envejecidas,hipertrofiadas

• Participa en la remodelación celular durante la

diferenciación, envejecimiento, enfermedades
neurodegenerativas, cáncer.

• Mantiene el suministro de aminoácidos en ayunos

prolongados mediante el secuestro inespecífico
de proteínas citosólicas. Supervivencia celular.

12
 La autofagia es un mecanismo de
supervivencia celular
pero el exceso puede llevar a la
muerte celular
(Muerte celular programada Tipo II)

Papel de la autofagia en la salud y la enfermedad

Enfermedad Efectos beneficiosos Efectos dañinos

Supresor de tumores Supervivencia de células cancerosas
Cáncer MCP Tipo II en células cancerosas en el ambiente pobre en nutrientes
remoción de organelas dañadas del tumor evitando la muerte celular

Enfermedades Permitiría le remoción de Puede inducir MCP en las neuronas

neuronales agregados proteicos que acumulan agregados proteicos:
Huntington, Parkinson, Alzheimer

Infección con Defensa contra la invasión Utilización de la vía autofágica por

patógenos de bacterias y virus ciertos patógenos para establecer
la vacuola replicativa

Enfermedades Aumento de la autofagia Aumento de la autofagia llevaría a MCP

lisosomales compensaría ciertos defectos o defectos en esta vía causarían la
lisosomales acumulación de autofagosomas
no funcionales.

13
 AUTOFAGIA Y CANCER

• La proteína Beclina 1 forma parte del complejo con PI3kinasa

tipo III y es requerida para la formación de autofagosomas.

• Beclina 1 está ausente en uno de los alelos en varios tipos de

carcinomas de mama, ovario y próstata.

• Ratones deficientes para Beclina 1 sufren de una alta incidencia

de tumores espontáneos.

La autofagia favorece la supresión de tumores induciendo la

muerte de la célula tumoral o limitando su proliferación.

AUTOFAGIA Y CANCER

Ciertos productos farmaceuticos usados para tratar

el cáncer actuarían a través de la autofagia.
Por ejemplo Tamoxifeno, droga usada para tratar
ciertos tipos de cáncer de mama funcionaría
aumentando los niveles endógenos de la proteína
Beclina 1, activando la autofagia.
Otros compuestos que estimulan la autofagia como
la rapamicina están siendo probados actualmente en
pacientes con tumores malignos.

14
Papel de la autofagia en la salud y la enfermedad

Enfermedad Efectos beneficiosos Efectos dañinos

Supresor de tumores Supervivencia de células cancerosas
Cáncer MCP Tipo II en células cancerosas en el ambiente pobre en nutrientes
remoción de organelas dañadas del tumor evitando la muerte celular

Enfermedades Permitiría le remoción de Puede inducir MCP en las neuronas

neuronales agregados proteicos que acumulan agregados proteicos:
Huntington, Parkinson, Alzheimer

Infección con Defensa contra la invasión Utilización de la vía autofágica por

patógenos de bacterias y virus ciertos patógenos para establecer
la vacuola replicativa

Enfermedades Aumento de la autofagia Aumento de la autofagia llevaría a MCP

lisosomales compensaría ciertos defectos o defectos en esta vía causarían la
lisosomales acumulación de autofagosomas
no funcionales.

ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

PRINCIPALES ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS:

• Enfermedad de Parkinson
• Enfermedad de Huntington
• Enfermedad de Alzheimer
• Enfermedad de los Priones

Se caracterizan por la acumulación de agregados proteicos

que causan muerte neuronal

ENFERMEDAD PROTEÍNA MUTADA o alterada

• Parkinson α-sinucleína (Cuerpos de Lewy)
• Huntington huntintina con extra Poli Q en el amino
• Alzheimer β-amieloide
• Priones priones

15
 DEGRADACIÓN INTRACELULAR

NO LISOSOMAL LISOSOMAL

• Es llevada a cabo por el • Es llevada a cabo en el

proteosoma lisosoma

• Degradación de proteínas • Degradación de proteínas

de vida media larga
de vida media corta
• Involucra procesos como
• Involucra el sistema de
la endocitosis, fagocitosis
ubiquitinación y autofagocitosis

AUTOFAGIA Y ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

En estadios iniciales el sistema ubiquitina-proteosoma intenta

remover las proteínas mal plegadas.

En muchas enfermedades neurodegenerativas se ha visto la

acumulación masiva de vacuolas autofágicas.

El tratamiento de las células con el inductor de la autofagia

rapamicina (inhibidor de TOR) promueve la degradación de
las proteínas agregadas.

La autofagia puede proteger a las células en contra de los

efectos tóxicos de los agregados proteicos, pero exceso de
autofagia podrtía causar muerte neuronal .

16
 AUTOFAGIA Y NEURODEGENERACIÓN

Neurodegeneración
Inducción de la
autofagia por Agregados
drogas (Rapa) proteicos

Degradación de
proteínas
agregadas

Reducción de agregados
proteicos y de la toxicidad
celular

Protección en varios modelos de

enfermedades neurodegenerativas

Papel de la autofagia en la salud y la enfermedad

Enfermedad Efectos beneficiosos Efectos dañinos

Supresor de tumores Supervivencia de células cancerosas
Cáncer MCP Tipo II en células cancerosas en el ambiente pobre en nutrientes
remoción de organelas dañadas del tumor evitando la muerte celular

Enfermedades Permitiría le remoción de Puede inducir MCP en las neuronas

neuronales agregados proteicos que acumulan agregados proteicos:
Huntington, Parkinson, Alzheimer

Utilización de la vía autofágica por

Infección con Defensa contra la invasión
ciertos patógenos para establecer
patógenos de bacterias y virus la vacuola replicativa

Enfermedades Aumento de la autofagia Aumento de la autofagia llevaría a MCP

lisosomales compensaría ciertos defectos o defectos en esta vía causarían la
lisosomales acumulación de autofagosomas
no funcionales.

17
Microorganismos y la vía autofágica

Se benefician Son destruidos

Porphyromonas gingivalis Listeria monocytogenes

Brucella abortus ( cell type?)
Legionella pneumophila
Chlamydia trachomatis
Coxiella burnetii
Staphylococcus aureus
Mycobacterium tuberculosis
Group A Streptococcus
Shigella flexneri
Salmonella entérica (20%)

Trypanosoma cruzi
Herpes virus
Poliovirus
MHV

Las vacuolas replicativas de Coxiella

son decoradas por GFP-LC3

CRV
CV CRV
CV CRV
CV

N N N

Berón et al; Infect. Imm. 70: 5816-5821(2002)

Gutierrez et al., Cell. Microb. 7: 981-993 (2005)

18
 La inducción de la autofagia favorece
el desarrollo de la vacuola con Coxiella

** **
**
70 70

% ce lls with v acuole s

% ce lls with v acuole s

60 60
50
40
** 50
40
30 30
20 20
10 10
0 0

Ctrl 2h 6h 24h Ctrl Rap Wm 3-MA

Full Starvation Full Starvation

Gutierrez et al., Cell. Microb. 7: 981-993 (2005)

Conclusiones

• La inducción de la autofagia aumenta el % de

células infectadas y favorece la generación y
maduración de las vacuolas con Coxiella.

• La vacuola con Coxiella colocaliza con

proteínas de la vía autofágica.

•Sobreexpresión de proteínas autofágicas

favorece el desarrollo de la vacuola
replicativa.

19
 Mycobacterium tuberculosis inhibe la
maduración del fagosoma

• Reside en compartimientos que son

modificados para evitar la fusión con los
lisosomas y la adquisición de enzimas
hidrolíticas.

• Bloquea la maduración del fagosoma en un

punto entre el endosoma temprano y el tardío.

• Los fagosomas que contienen Mycobacterium

restringen la adquisición de la bomba de
protones previniendo la acidificación.

La inducción de la autofagia favorece la

maduración de los fagosomas con Mtb

Cath D Mycobac
Control 60

50 ***
% colocalization

***
40

30
***
20

10
Ayuno
0
tion

tion

tion

n
ol
ol

ol
ol

tio
ntr
n tr

nt r
n tr
rv a

rv a

rv a

rv a
Co
Co

Co
Co
S ta

Sta

S ta

S ta

CathD LBPA LAMP-1 VoATPase

Gutierrez et al., Cell 119:753-766 (2004)

20
La inducción de la autofagia disminuye
la supervivencia de Micobacterium

100 † †

80
***
% survival

60

40 ***
20

m
50
l
tion
ntro

v+3M

v+W
ycin
rva
Co

Star
Star
pam
Sta
Ra

Gutierrez et al., Cell 119:753-766 (2004)

Autofagia y microorganismos
Coxiella burnetii M. tuberculosis
Mycobacterium
Coxiella

phagosome

lysosome lysosome

autophagosome
Mycobacterium degradation

Coxiella replication ER

21
LA AUTOFAGIA COMO MECANISMO DE DEFENSA

Levine, Cell 2005

LA AUTOFAGIA COMO MECANISMO DE DEFENSA

CONTRA PATÓGENOS QUE ESCAPAN
AL CITOPLASMA

Shigella- GAS
Shigella- GAS
Vázquez, Lerena and Colombo, Cell Micro 2009

22
 Camuflage de Shigella para evitar ser
reconocida por la autofagia

Ogawa and Sasakawa, Cellular Micro. 2006

CONCLUSION

LA MODIFICACIÓN FARMACOLÓGICA DE LA AUTOFAGIA

PERMITIRÁ LA ELIMINACIÓN DE CIERTOS PATÓGENOS
INTRACELULARES PERO PUEDE RESULTAR BENEFICIOSA
PARA OTROS.

23
Papel de la autofagia en la salud y la enfermedad

Enfermedad Efectos beneficiosos Efectos dañinos

Supresor de tumores Supervivencia de células cancerosas
Cáncer MCP Tipo II en células cancerosas en el ambiente pobre en nutrientes
remoción de organelas dañadas del tumor evitando la muerte celular

Enfermedades Permitiría le remoción de Puede inducir MCP en las neuronas

neuronales agregados proteicos que acumulan agregados proteicos:
Huntington, Parkinson, Alzheimer

Infección con Defensa contra la invasión Utilización de la vía autofágica por

patógenos de bacterias y virus ciertos patógenos para establecer
la vacuola replicativa

Enfermedades Aumento de la autofagia Aumento de la autofagia llevaría a MCP

compensaría ciertos defectos o defectos en esta vía causarían la
lisosomales acumulación de autofagosomas
lisosomales
no funcionales.

Papel de la autofagia en la patogénesis

de enfermedades lisosomales

24
 MIOPATÍAS LISOSOMALES

Enfermedad de Danon Enfermedad de Pompe

Acumulación de glucógeno

ENFERMEDAD DE DANON

Enfermedad poco frecuente ligada al cromosoma X

caracterizada por:
• cardiomiopatía hipertrófica
• Miopatía de músculos esqueléticos
• retardo mental variable

Tratamiento
• Trasplante cardíaco

25
 ENFERMEDAD DE DANON
Causada por mutaciones en el gen que codifica a la proteína
LAMP-2 (Lysosomal Associated Membrane Protein-2)

Proteína mayoritaria de la membrana lisosomal con un único

dominio transmembrana, un gran dominio intraluminal
(altamente glicosilado) y una cola citosólica corta.

Principales alteraciones celulares

en la Enfermedad de Danon
Diagnóstico
Carencia de proteínas LAMP-2 en músculo,
leucocitos, y fibroblastos esqueléticos y del
miocardio

• Acumulación de vacuolas autofágicas con

características de sarcolema en varios tejidos:
hígado, riñón, músculo cardíaco y esquelético

• Estas vacuolas contienen enzimas lisosomales,

marcadores autofágicos (LC3) y además proteínas
del sarcolema como distrofina y acetilcolinesterasa

26
 Acumulación de vacuolas autofágicas
con características de sarcolema

Malicdan et al., 2008

Por qué se acumulan los autofagosomas?

• Se debe a fallas en la maduración de los
autofagosomas (bloqueo en la fusión con lisosomas)
y no a un aumento en la producción de dichos
autofagosomas.

• Estudios demostraron que la proteína LAMP es

requerida para la fusión de fagosomas y
autofagosomas con los lisosomas y para el
transporte vía microtúbulos.

√ La Enfermedad de Danon es un trastorno de la

autofagia debido a alteraciones en la fusión y/o
motilidad de organelas

27
ENFERMEDADES LISOSOMALES CON AUTOFAGIA DISFUNCIONAL

Resaltar la importancia de la AUTOFAGIA

como un nuevo blanco para el desarrollo de
nuevos medicamentos para el tratamiento
de distintas enfermedades

28