Extracción, visualización de ADN y amplificación de gen (por el método de

PCR) en células animales

---------------------------------------------------------- 1 ----------------------------------------------------------
I. OBJETIVO:

- Conocer la metodología para la extracción, purificación y precipitación de ADN en células

animales por medio de muestras de sangre y saliva.
- Conocer el método de PCR para la amplificación de un Gen en células animales.
- Conocer el método de visualización de ADN por medio de la electroforesis.

II. MATERIALES Y MÉTODOS:

Extracción, purificación y precipitación:

CASO 1: Muestras de sangre. *VIDEO*

1. Extraer 500 µL de sangre de un tubo EDTA y agregarlos a un Eppendorf.

2. Agregar 200 uL de TSNT (solución amortiguadora de lisis) al Eppendorf y agitar por
inversión.
3. Agregar 500 µL de fenol equilibrado al Eppendorf y agitar vigorosamente.
4. Agregar 100 µL de sevag al Eppendorf y agitar vigorosamente.
5. Agregar 200 µL de TE-1X al Eppendorf y mezclar.
6. Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos.
7. Separar cuidadosamente el sobrenadante (aproximadamente 650 µL) con la micropipeta y
agregarla a un nuevo Eppendorf.
8. A este nuevo Eppendorf, agregar 520 µL de isopropanol frío y mezclar con cuidado.
9. Agregar 120 µL de acetato de sodio 3M al Eppendorf y mezclar cuidadosamente hasta
observar una hebra blanca.
10. Incubar a -20°C por 15 minutos.
11. Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos.
12. Ubicar el botón del ADN y retirar el sobrenadante.
13. Agregar 500 µL de etanol al 70% frío y mezclar hasta desprender el botón del Eppendorf.
14. Centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos.
15. Ubicar el botón del ADN, decantar el sobrenadante y dejar evaporar por 5 minutos.
16. Resuspender añadiendo 65 µL de TE-1X y disolver a 55°C por 10 minutos.
17. Almacenar a 4°C hasta su uso.
---------------------------------------------------------- 2 ----------------------------------------------------------
CASO 2: Células bucales. *VIDEO*

1. Para colectar la muestra de tu boca, frota el cepillo en el interior de tus mejillas. Coloca el
cepillo en un Eppendorf (1.5ml) y córtalo de modo que puedas cerrarlo.
2. Agregar 300 µL de solución de buffer de lisis y mezclarlo dando golpecitos al Eppendorf un
par de veces.
3. Agregar 6 µL de Proteinasa K (por hidrólisis rompe enlaces peptídicos) y mezclar dando
golpecitos al Eppendorf un par de veces.
4. Colocar el tubo en la incubadora por una hora y media a 64°C.
5. Colocar el tubo en el vórtex por 30 segundos. Sacar el cepillo y desechar.
6. Agregar 600 µL de cloroformo. Hacerlo en la campana de extracción y asegurarse de usar
guantes.
7. Colocar el tubo en el vórtex por 30 segundos.
8. Centrifugar el tubo a 14000 rpm por 15min. Retirar el tubo sin agitarlo. Se notara que el
líquido se ha dividido en 3 fases: la parte superior (fase acuosa) que contiene el material
genético, la parte media blanquecina que son las proteínas; y la parte inferior que contiene
resto celular.
9. Tomar delicadamente 250 µL de la fase acuosa (sin mezclar las fases) y verter en un nuevo
Eppendorf.
10. Agregar 1ml de ETOH 100%, se precipitará el ADN y se verán hebras blancas.
11. Cerrar bien el tubo y mezclarlo delicadamente por inversión.
12. Centrifugar el tubo a 14000 rpm por 15min.
13. Se apreciará un punto blanco en la parte inferior del Eppendorf. Desechar el sobrenadante.
14. Agregar 30 0µL de ETOH 70%.
15. Centrifugar el tubo a 14000 rpm por 5 min.
16. Desechar el sobrenadante y dejar secar el pelet en la incubadora (-1hr).
17. Disolver el pelet en 20 µL de TE 1X, esto permitirá conservar la muestra.
18. Almacenar a 4°C hasta su uso.

---------------------------------------------------------- 3 ----------------------------------------------------------
Amplificación: Técnica PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, según sus siglas en inglés) es una técnica usada
para amplificar varias copias de la región diana de ADN para poder ser analizada o usada
posteriormente. Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR (amplicones) puede ser enviado para
secuenciar, visualizado por geles de electroforesis o por técnicas de hibridación, o ser clonado
en un plásmido para realizar otros experimentos.
La técnica de PCR puede llevarse a cabo utilizando ADN de diferentes fuentes como tejidos y
microorganismos, incluyendo sangre periférica, piel, pelo, saliva y bacterias. Solamente se
necesitan trazas de ADN para generar copias suficientes para ser analizadas usando los
métodos de laboratorio convencionales. Por esta razón, la técnica de PCR es muy sensible, así
que es extremadamente importante mantener buenas prácticas de laboratorio, especialmente
en lo referente a higiene, orden y seguridad en cualquiera de las fases de la técnica (extracción
de ácidos nucleicos, preparación de las reacciones y detección del material amplificado), con el
fin de evitar posibles contaminaciones que pueden afectar al resultado del test.
*VIDEO*

1. Extraer las muestras de ADN del congelador y descongelar.

2. Homogeneizar las muestras de ADN y centrifugarlas brevemente.
3. Homogeneizar los reactivos de PCR y centrifugarlos brevemente.
4. Coger los Eppendorf necesarios y marcarlos. Incluir uno para el blanco.
5. Preparar el volumen de premezcla necesario en función del número de tubos a amplificar.
---------------------------------------------------------- 4 ----------------------------------------------------------
6. Añadir el volumen necesario de PCR Mix.
- Cloruro de Magnesio: Cofactor esencial de la polimerasa.
- Deoxinucleotidos trifosfato (dNTPs): ladrillos de construcción usados para la
construcción de una nueva hebra de ADN.
- PCR Buffer: Crea un ambiente óptimo para la actividad de ADN polimerasa, debido a
que trabaja con una enzima y se debe proporcionar un medio óptimo para sus
funciones.
7. Añadir el volumen necesario de Primers.
- Primers: Pequeñas hebras monocatenarias de ADN que se unirán a la región de
interés para ser reconocidos por la polimerasa. Se usan dos: el primer forward y el
reverse, estos delimitan la región de interés.
8. Añadir el volumen necesario de Taq.
- ADN Polimerasa: cataliza creación de una hebra monocatenaria de ADN. La más
famosa es la taq polimerasa, conocida por su termo estabilidad.
9. Mezclar bien.
10. Repartir el volumen necesario de premezcla en cada Eppendorf.
11. Añadir el ADN a cada Eppendorf. Añadir agua al blanco.
12. Mezclar bien y centrifugar brevemente.
13. Introducir los Eppendorf en el termociclador (realiza ciclos de temperaturas específicas) y
lanzar el programa de PCR.
13.1. Desnaturalización inicial: Para evitar la amplificación no específica de la
polimerasa a bajas temperaturas y separar el anticuerpo acoplado de las
polimerasas comerciales, se lleva la reacción a 94°C de 1 a 5 minutos.

13.2. Desnaturalización: A 94°C de 30 a 60 segundos, las muestras de ADN se ven

desnaturalizadas en el medio.
 13.3. Alienación: A 62°C de 30 a 60 segundos, los primers reconocen sus respectivas
zonas y forman enlaces de hidrógeno con las muestras de ADN.

13.4. Extensión: A 72°C de 30 a 60 segundos, la polimerasa comienza a tomar los

dNTPs del medio y los empareja dependiendo de la hebra que esté fncionando
como molde. Aquí se forman los amplicones.

Los pasos 13.2, 13.3 y 13.4 son un ciclo, y el termociclador los repite varias veces para
generar más amplicones. Conforme van pasando los ciclos, las cadenas de ADN se
generan en cadena exponencial.
Visualización de ADN (Electroforesis horizontal):

Se define como el movimiento o dispersión de partículas al ser sometidas a un campo eléctrico.

Generalmente se realiza en una matriz o gel y suele utilizarse para separar moléculas con base
en su tamaño. En el caso del ADN se tiene el grupo fosfato que le otorga una carga negativa a
la molécula; dado que por cada base nitrogenada se tiene un grupo fosfato, la relación masa-
carga se conservará siempre, por lo que la movilidad electroforética será siempre la misma, por
lo tanto, se pueden separar las cadenas en una matriz que disminuya la movilidad en función
de sus tamaños; entonces, cuando se aplica un campo eléctrico el ADN se desplaza desde el
polo negativo al polo positivo.
---------------------------------------------------------- 5 ----------------------------------------------------------
Existen diversas técnicas que permiten la separación de fragmentos de ADN, pero para muchas
de las aplicaciones, la separación por gel de agarosa es la más empleada. Sus ventajas son:
- Es rápida y sencilla.
- Permite determinar mediante tinción con bajas concentraciones de colorante el tamaño
de los fragmentos separados.
*VIDEO*
1. Pesar agarosa y disolverla en el volumen apropiado de tampón TBE, de forma que el gel
tenga la concentración adecuada en función del tamaño de fragmentos que se pretenda
separar.
2. Calentar la mezcla en un microondas hasta hacerla hervir.
3. Verter la solución en el porta-geles (moldes), para formar los depósitos donde se colocará
la muestra, se coloca un peine.
4. Preparar las muestras para cargarlas en el gel, a cada muestra agregar el tampón de
carga.
Funciones del tampón de carga:
- Aumentar la densidad de la muestra, de forma que esta permanezca en el depósito
una vez depositada (debido a la sacarosa que incluye el tampón).
- Permite ver el frente de avance del gel gracias al colorante azul que tiene; esto
ayuda a determinar el momento en el que se puede detener la corriente y finalizar
el proceso de separación.
5. Una vez solidificado el gel, retirar el peine e introducir en la cubeta de electroforesis.
Dentro de la cubeta, el gel debe quedar cubierto por tampón TBE, cuyas sales permitirán
el establecimiento de la corriente.
6. Cuidadosamente colocar cada muestra en cada depósito formado por el gel.
7. Establecer la corriente en la cubeta de electroforesis, de manera que el ADN se
desplazará del polo negativo al positivo. El voltaje empleado para llevar a cabo la
separación depende fundamentalmente del tamaño del gel.
Factores que afectan a la velocidad con que el ADN migra en el gel:
- Tamaño de la molécula.
- Concentración de agarosa.
- Conformación del ADN.
8. Una vez completa la separación, teñir el gel con colorante que se una al ADN de manera
que se puedan visualizar los fragmentos separados. Una de las posibles sustancias a
usar es el bromuro de etidio, este es un agente intercalante y por ello es un agente
mutagénico, de manera que se tiene que usar con precaución y siempre con guantes
9. Tras teñir de 15 a 20 minutos, iluminar el gel con luz UV para que el bromuro de etidio
emita fluorescencia y sea posible detectar los fragmentos de ADN separados.
10. Ver la imagen en un monitor o soporte informático a través de la cámara fotográfica.
11. Analizar resultados por comparación de tamaños de fragmentos separados en el gel con
un patrón de tamaños conocidos.