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FORMALDEHYDE DERIVADA DE ASPARTAME DIETA se une a los

componentes del tejido IN VIVO

C. trocho, R. Pardo, I. Rafecas, J. Virgili, X. Remesar, JA Fernández-López y M. Alemany

Departament de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Biología, Universidad de

Barcelona, ​Barcelona, ​08028 España. (Recibido en forma finales 13 mayo de 1998) Resumen

ratas macho adultas se les dio una dosis oral de 10 mg / kg de aspartamo 14C marcado en el carbono metanol. A
intervalos de tiempo de hasta 6 horas, se investigó la radiactividad en plasma y varios órganos. La mayor parte de
la radiactividad encontrados (> 98% en el plasma,> 75% en el hígado) se une a las proteínas. Label presente en
el hígado, plasma y el riñón estaba en el intervalo de 1-2% de la radioactividad total administrada por g o ml,
cambiando poco con el tiempo. Otros órganos (tejidos adiposos marrón y blanco, músculo, cerebro, la córnea y la
retina) contenían niveles de etiqueta en el intervalo de 1/12 a 1 / 10a de la de hígado. En total, la rata retenida, 6
horas después de la administración de 5% de la etiqueta, la mitad de ella en el hígado. La radiactividad específica
de la proteína de tejido, ARN y ADN era bastante uniforme. La etiqueta de proteína se concentró en aminoácidos,
diferentes de la metionina, y en gran parte coincidente con el resultado de la exposición al formaldehído proteína
marcada. radiactividad DNA era esencialmente en una única base de diferente aducto, diferente de las bases
normales presentes en el ADN. La naturaleza del marcador de tejido acumulado era, por lo tanto, una
consecuencia directa de la unión a las estructuras de tejido formaldehído. La administración de aspartamo
marcado a un grupo de ratas cirróticas resultó en retención de etiquetas comparable por los componentes del
tejido, lo que sugiere que la función del hígado (o su defecto) tiene poco efecto sobre la formación de
formaldehído a partir de aspartamo y la unión a componentes biológicos. El tratamiento crónico de una serie de
ratas con 200 mg / kg de aspartamo no marcado durante 10 días dio lugar a la acumulación de aún más etiqueta
cuando se administra el bolo radiactivo, lo que sugiere que la cantidad de aductos de formaldehído procedente de
aspartamo en las proteínas del tejido y los ácidos nucleicos puede ser acumulativa. Se concluye que el consumo
de aspartamo puede constituir un peligro debido a su contribución a la formación de aductos de formaldehído.

El aspartamo es uno de los edulcorantes artificiales más utilizados. Su naturaleza Peptid: aspartil
fenilalanina metil-éster facilita su hidrólisis intestinal y la absorción (I -3) de aminoácidos inocuos junto
con pequeñas cantidades de metanol libre, muy lejos de los límites inferiores de toxicidad para que el
compuesto (4). El uso de grandes cantidades de aspartamo en la dieta, sin embargo, se ha pretendido
ser la causa de una serie de dolencias, como dolores de cabeza (5) y otros síntomas (6-7), que son
difíciles de explicar (8) de su composición conocida y la fácil
mezcla de sus componentes de construcción en el metabolismo del huésped en general. Un número de estudios han

relacionado aspartame con patologías neurológicas, pero la mayoría de los resultados dado correlaciones negativas o no

concluyente (9-16). La toxicidad aguda del aspartamo se cree que es bajo (I7), que ha promovido una amplia distribución

del producto como un potente hipocalórica y sustituto seguro de azúcar (I 8-19). El metanol se oxida principalmente en

varios tejidos a formaldehído y ácido fórmico (20-2 1), este último siendo considerado el principal metabolito responsable

de los efectos nocivos de intoxicación aguda por metanol en el hombre (22), pero también en animales de experimentación

(23), a pesar de la marcada resistencia de la rata a formiato (24-25). Las enzimas implicadas en el metabolismo del

metanol son alcohol deshidrogenasa (CE 1. 1. 1. 1) y aldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.3), así como la vía microsomal

oxidasa (26). intoxicación aguda por metanol puede producir ceguera y la pérdida de la función hepática (27-28), puesto

que la retina, córnea y el hígado contienen la actividad de la alcohol deshidrogenasa más alto (29-30). Estos tejidos son,

por lo tanto, donde uno puede esperar que, con el tiempo, la mayor acumulación de sus subproductos: formaldehído y

formato, en caso de intoxicación. Se puede suponer que el fracaso funcional hepática debida a cirrosis podría resultar en

la pérdida de su función como barrera a metanol intestinal, y por lo tanto, los efectos de la intoxicación metanol en otros

tejidos (es decir, la retina) sería más marcada. La rata cirrótico puede, entonces, utilizarse como un modelo de toxicidad

metanol aguda o crónica. desde la retina, córnea y el hígado contienen la actividad de la deshidrogenasa de alcohol más

alto (29-30). Estos tejidos son, por lo tanto, donde uno puede esperar que, con el tiempo, la mayor acumulación de sus

subproductos: formaldehído y formato, en caso de intoxicación. Se puede suponer que el fracaso funcional hepática

debida a cirrosis podría resultar en la pérdida de su función como barrera a metanol intestinal, y por lo tanto, los efectos de

la intoxicación metanol en otros tejidos (es decir, la retina) sería más marcada. La rata cirrótico puede, entonces, utilizarse

como un modelo de toxicidad metanol aguda o crónica. desde la retina, córnea y el hígado contienen la actividad de la

deshidrogenasa de alcohol más alto (29-30). Estos tejidos son, por lo tanto, donde uno puede esperar que, con el tiempo, la mayor acumulación de su

El formaldehído es una pequeña molécula altamente reactiva que se une fuertemente a las proteínas (3
1) y ácidos nucleicos (32) aductos de conformación que son difíciles de eliminar a través de las vías de
metabolismo normal.

Como resultado, el formaldehído induce alteraciones severas funcionales (33), incluyendo el desarrollo del
cáncer (34). Las pequeñas cantidades de formaldehído que se pueden producir potencialmente de uso dietético
de aspartame han sido a menudo se pasa por alto en su potencial toxicidad precisamente a causa de la
cantidad limitada finalmente producido. Sin embargo, la administración de aspartamo marcado a los animales de
experimentación se traduce en la incorporación de una proporción significativa de la etiqueta a las proteínas
(35). La acumulación de etiqueta se ha postulado que es la consecuencia de la deriva etiqueta en aminoácidos
(esencialmente en el grupo metil metionina) a través de la piscina de un carbono (35). Este aspecto no ha sido,
sin embargo, ha demostrado ni mayor investigación.

Hemos previsto aquí para determinar el grado de conversión de metanol a formaldehído aspartame y su

eventual efecto sobre la función fisiológica general de la rata. Además, hemos sondeado si la presencia de

carbono metanol aspartamo en los componentes del tejido se debe a la eventual deriva de la etiqueta en

metionina y componentes de ácido nucleico a través de la piscina de un carbono, o es la consecuencia de una

reacción directa con la formación de formaldehído libre aductos estables. El aspartamo se convierte en

formaldehído in vivo en los cuerpos de las ratas de laboratorio.


El estudio realizado por C. trocho et al, a veces referido como el "Informe de Barcelona", o "el estudio de
Barcelona", ya que se llevó a cabo por el personal del Departamento de Biología de la Universidad de Barcelona, ​muestra
claramente que el aspartame que fue etiquetado con carbono 14 isótopos se transformó en formaldehído en los cuerpos de
los especímenes vivos y que cuando se examinaron más tarde, el etiquetado radiactivo formaldehído se extendió a lo largo
de los órganos vitales de su cuerpo. Esto demuestra de manera concluyente que el aspartame en efecto, convierte al
formaldehído en los cuerpos de los consumidores de aspartamo, y que muchos de los síntomas reportados por las víctimas
de la toxicidad del aspartamo son de hecho los asociados con los efectos tóxicos y acumulativos de formaldehído.

Como se ha dicho con claridad por el título del informe


"FORMALDEHYDE DERIVADA DE ASPARTAME DIETA se une a los componentes del tejido
in vivo"

Materiales y métodos

El aspartamo. Aspartame marcado ( "C) en el carbono metanol se encargo preparado por Amersham
(Amersham, Reino Unido). El producto tenía una actividad específica de 433 MBq / mmol, y una cromatografía de
pureza> 98%. La dosis estándar administrada por vía oral a las ratas fue de 4,5 MBq por kg de peso de rata,
siempre que complementa el aspartamo no marcada (Sigma, St Louis, MO EE.UU.) para dar una actividad
específica de 55 MBq / mmol.

La administración aguda y crónica de aspartame a ratas normales. Dieciséis ratas semanas de edad, adultos
sanos macho Wistar, con un peso inicialmente 380-460 g, fueron utilizados. Las ratas se alojaron en jaulas
colectivas en un ambiente controlado (21-22'C; 70-75% de humedad relativa; las luces en 8:00-20:00), y se
alimentaron con una comida estándar de pellets (B & K, dels Sant Vicent Horts, España) y ad libitum agua del
grifo.

Se seleccionaron dos grupos de ratas. El primer grupo NC (Normal-crónica, N = 5) recibió una sonda oral
diaria de 0,68 mmol por kg de peso de rata (200 mg por kg) de una suspensión de agua (2,5 ml / kg) de
aspartamo no radiactivo (Sigma) . Este tratamiento se continuó durante I 0 días. En el día i 1, las ratas se les
administró una alimentación forzada de 4,5 MBq por kg de peso de la rata de aspartamo marcado en 68 mol
de aspartamo frío por kg, en el mismo volumen de la sonda nasogástrica estándar. El segundo grupo de NA
(Normal-aguda, N = l2) se le dio una dosis única de 4,5 MBq por kg de peso de la rata de aspartamo
marcado en 68 mol de aspartamo frío por kg de peso de rata. Antes de la administración de la última (o
única) de la dosis, la sangre se extrajo de la vena de la cola y se utiliza para la medición de parámetros
bioquímicos usando una tira seca Spotchem sistema de análisis (Menarini, Milano, Italia) (panel 2 I y).

Las ratas tratadas crónicamente (grupo NC) se sacrificaron por decapitación 6 horas
después de la administración de la alimentación forzada aspartame etiquetado. Las ratas en el grupo de NA se
sacrificaron por decapitación a los 15 o 30 minutos y a 1, 2, 6 ó 24 horas después de la administración de la
carga aspartame marcado final. Todos los animales fueron disecados, y muestras de plasma sanguíneo
(heparinizada), hígado, riñones, cerebro, córnea, retina, músculo de la pierna trasera estriado, se cortaron las
almohadillas de grasa del epidídimo y el tejido adiposo marrón interescapular, se pesaron (borró cuando sea
necesario), y se congelaron en nitrógeno líquido. Las muestras se conservaron a - 20'C hasta su
transformación. Las muestras de tejido se homogeneizaron en agua: metanol (4: 1) a fin de limitar las pérdidas
de metanol libre, usando un homogeneizador de cristal Tenbroek. Las alícuotas de los homogenados se
contaron inmediatamente para determinar la radiactividad usando un cóctel de centelleo miscible en agua
(Ecolite, de ICN, Costa Mesa, CA, EE.UU..

En todos los casos, dos recuentos, además se realizaron 24 horas. En todos los casos se obtuvieron los mismos
conteos; no hubo muestras que muestran una pérdida significativa de radioactividad (supuestamente debido a la
eventual evaporación del metanol para el espacio de cabeza del vial). Por lo tanto se supuso que no hay cantidades
significativas de metanol marcadas se presente en los homogeneizados finales. Las alícuotas de los homogenados
se precipitaron con ácido trifluoroacético para eliminar la proteína de los sobrenadantes, y las dos fracciones se
contaron por separado. Se han usado administración aguda y crónica de aspartamo a ratas con el hígado dañado
Seis semanas de edad, adultos sanos ratas Wistar macho que pesaban inicialmente 100-120 g. Las ratas se
alojaron y alimentaron en las mismas condiciones descritas anteriormente para los controles. Las ratas se hicieron
cirrótico por medio de tres ip inyecciones por semana de tetracloruro de carbono se diluyeron 1: 1 con aceite de
maíz (36). Las ratas recibieron

0,4 inyecciones ml Durante las 2 primeras semanas, y luego 0,6 ml hasta la semana 6 y finalmente
0,8 ml hasta la semana 10, cuando se considera terminado el período de tratamiento, cuando las ratas
pesaban 340-380 g.

Se seleccionaron dos grupos de ratas con el hígado dañado. La primera CC grupo (cirróticos crónica, N
= 5) recibió una sonda oral diaria de aspartamo no radiactivo durante 10 días, y en el día II que
recibieron 4,5 MBq / kg de aspartamo etiquetado como en el grupo NC. El segundo grupo de CA
(Cirróticos-aguda, N = 1
1) se le dio una dosis única de 4,5 MBq / kg de aspartamo marcado en 68 mol de aspartamo frío por kg como en
el grupo NA. sangre vena de la cola se tomaron muestras de estos animales, y su plasma se almacenó
congelado; esto más adelante se utilizó para medir parámetros bioquímicos como en el grupo NA.

El CC ratas tratadas crónicamente murieron por decapitación -como en el de las series de control 6 horas después
de la administración del bolo oral de marcado de aspartamo, y aquellos en el grupo de CA se sacrificaron a las 15 o
30 minutos y a 1, 2, 6 o 24 horas después de recibir la carga aspartame etiquetados. Las muestras de plasma de la
sangre y los tejidos se pesaron, se congelaron y almacenaron a -20 'C hasta su procesamiento. Algunas muestras de
hígado se conservaron en formaldehído al 4% y después utilizarse para la
preparación de secciones de tejido teñidas con el fin de determinar el grado de alteración hepática (37). Las muestras
de sangre y de tejido se procesaron como se describe para las ratas normales.

La comparación estadística entre las medias se determinó con programas estándar ANOVA de dos vías,
así como con la prueba t de Student.

análisis ácidos nucleicos. Dos ratas adultas adicionales fueron tratados como en el grupo NC, pero recibieron
la sonda durante sólo tres días. El último medio de una sonda contenía 37 MBq de aspartame radiactivo.
Después de matar, se obtuvieron y se congelaron las muestras de plasma de la sangre y el hígado. se utilizó
tejido hepático para la extracción y purificación de ARN total y el ADN usando el Tripure (Boehringer
Mannheim, Alemania) sistema de reactivos de aislamiento. Estas preparaciones produjeron fracciones puras
de ADN, ARN y proteínas. contenido de ácidos nucleicos se determinó por absorción de luz UV a 260/280 nm
(38), y de la proteína con el método de Bradford (39). La radiactividad de estas fracciones se mide y se utiliza
para la estimación de su radiactividad específica. Las muestras reunidas de ADN de las dos ratas utilizadas
se hidrolizaron con ácido fórmico al 88% a 170'C en una ampolla de vidrio sellado (40), y las
correspondientes bases que constituyen separadas a través de cromatografía en capa fina sobre placas de
celulosa gruesas 0. I mm (5,716 Merck, Darmstadt, Alemania), ejecute contra estándares de marcado con
14C adenosina, guanina y timina (todos de ICN, Costa Mesa, CA, EE.UU.) que contiene sus homólogos en
frío (de Sigma, St Louis, MO EE.UU.). Las fases móviles utilizadas fueron isopropanol: hidróxido de amonio
25% (4: 1 en volumen) y butanol: ácido acético: agua (4: 1: 1 en volumen) (4 1). radiactividad punto se midió
por la exposición de los cromatogramas con el Bio-Rad Molecular Imaging Screen-BI (Bio-Rad, Hercules, CA,
EE.UU.) durante varios días. Las placas se leyeron después con un GS-525 contador array radiactividad
bidimensional Bio-Rad System Imager Molecular; este instrumento proporciona una "placa fotográfica"
impresa de la distribución bidimensional de la radiactividad en el cromatograma. Se utilizaron los estándares
marcados de bases de ADN para determinar si la muestra hidrolizada presenta cualquier radioactividad en
sus lugares. Citosina no se incluyó como estándar ya que ningún carbono de piscina IC participa en su
estructura a través de todo el proceso de síntesis de pirimidina.

El digesto de ADN del hígado de las ratas expuestas a aspartame marcado también se analizó mediante
HPLC, usando un UPLC montado en línea con un detector de red de diodos 440 (Kontron) y un detector
de centelleo eluato LB 507 A Kontron (Milano, Italia) (Beckman, Fullerton CA, EE.UU.). El instrumento se
realizó con el software Data System-450 MT2 / DAD (Kontron). Se utilizó una columna de intercambio
catiónico sexo (Kontron) (mm 250x4, 10 m), mantenida a 25ºC, y el flujo total fue de 0,8 mL / min. Se
utilizó un gradiente isocrático de tampón de fosfato de amonio 100% 10 mM pH 5,56. El detector de
centelleo utiliza un cóctel Ultima-Flo M (Packard, Meriden IL EE.UU.) con una relación de mezcla de 3: 1.
Una serie de estándares de adenina, timina y guanina se realizaron en las mismas condiciones. En todos
los casos se registró la radioactividad en las fracciones.
El análisis de proteínas. Las ratas utilizadas para el análisis de ácido nucleico proporcionada suficientes
muestras de plasma para el análisis de proteínas; Se seleccionaron las proteínas plasmáticas porque no podían
estar contaminados con los ácidos nucleicos. Las proteínas del plasma (0,100 ml alícuotas) se precipitaron con
ácido trifluoroacético al 10%. Las alícuotas de las proteínas precipitadas se hidrolizan entonces durante 48 horas a
110 ° C en HCl 6 N en tubos sellados de teflón con agitación ocasional (42). Los digeridos se filtraron para eliminar
los aductos de Maillard negro (que retienen parte de la radiactividad). Los aminoácidos en las digestiones se
derivatizan con dinitrofluorobenceno, y los ácidos DNP-aminoácidos se separaron por cromatografía en capa fina
bidimensional (43) en 0. 1 5 mm placas de silicagel gruesas (Polygram Sil G / UV254,

Mocherey-Nagel, Düren, Alemania). La presencia de la etiqueta en los puntos de aminoácidos se midió como en el caso

de ácidos nucleicos utilizando el Bio-Rad Molecular Imager. En ensayos separados, 14C_Iabelled metionina (NEN,

Boston, MA <EE.UU.) diluido con metionina fría (Sigma) se añadió a plasma de rata, se digirió, derivatizado y procesados

​como se indica anteriormente. Por lo tanto, se identificó el punto de DNP-metionina; en cualquier caso, se conoce la

posición de aminoácidos estándar en el cromatograma bidimensional (43). El método de derivatización usado prevenirse

la contaminación de las placas por materiales radiactivos diferentes a partir de aminoácidos, ya que sólo se recuperaron

los compuestos derivatizados-DNP. Una alícuota de 0,2 ml de albúmina de suero sanguíneo (Sigma) disuelto en agua

(100 g / L) se incubó durante 2 h a 37 ° C con 0,02 ml de una preparación de sustrato marcado, que contiene nmol I y 5

kBq de marcado con 14C: a) aspartame, b) formaldehído (Amersham), c) ácido fórmico (Sigma), o d) metanol (Amersham)

@ Las muestras entonces se precipitaron, se lavó con ácido trifluoroacético al 10% y los precipitados recuento de

radiactividad. La proteína expuesta al formaldehído retiene una gran proporción de la radiactividad inicial añadió. En los

casos de aspartamo, ácido fórmico y metanol, sólo los valores de fondo se obtuvieron en los precipitados de proteínas

lavadas, mostrando que ninguno de estos procedimientos dio lugar a fijación de la etiqueta estable a las proteínas. Las

muestras de albúmina expuesto a la etiqueta formaldehído se procesaron en paralelo a la muestra de plasma (es decir, la

hidrólisis, la derivatización y cromatografía de capa fina). o d) metanol (Amersham) @ Las muestras entonces se

precipitaron, se lavó con ácido trifluoroacético al 10% y los precipitados recuento de radiactividad. La proteína expuesta al

formaldehído retiene una gran proporción de la radiactividad inicial añadió. En los casos de aspartamo, ácido fórmico y

metanol, sólo los valores de fondo se obtuvieron en los precipitados de proteínas lavadas, mostrando que ninguno de

estos procedimientos dio lugar a fijación de la etiqueta estable a las proteínas. Las muestras de albúmina expuesto a la

etiqueta formaldehído se procesaron en paralelo a la muestra de plasma (es decir, la hidrólisis, la derivatización y

cromatografía de capa fina). o d) metanol (Amersham) @ Las muestras entonces se precipitaron, se lavó con ácido trifluoroacético al 10% y los precipi
RESULTADOS

resultados

La Tabla 1 muestra la química de la sangre de las ratas utilizadas. administración aspartame, ya sea crónica o aguda (NC,
grupos de NA), no dio lugar a cambios significativos en la composición del plasma de las ratas. En las ratas con cirrosis, los
grupos CC y CA, la química del plasma estaba profundamente alterada. La citología hígado (datos no presentados), junto con
los niveles de transaminasas alteradas y química del plasma mostró que las ratas CC y CA se vieron afectados por la cirrosis
hepática. Las ratas con cirrosis mostraron urea inferior, albúmina y, especialmente, los niveles de triacilglicerol que los
controles. administración Aspartame no dio lugar a cambios en la química de plasma en ratas normales.

La Figura 1 muestra la radiactividad encontrados en varios tejidos de ratas que recibieron una dosis oral única de aspartame
etiquetado. Hígado, plasma sanguíneo y los riñones mostraron los niveles de radiactividad más elevados, en el intervalo de 0. 1 a
0,4% en cada gramo de tejido fresco de la dosis administrada. Dado que la dosis dada a cada rata fue de 10 mg, de los cuales un
10,5% correspondió a metanol (es decir, I mg), 1 / 1.000 de la dosis administrada fue sólo I mu g, lo que significa que 0. I% de la
dosis por gramo de tejido era equivalente a 1 μgof metanol / ácido / formaldehído fórmico (= 31 mnol = I ppm). Hígado, por lo tanto,
contenía entre 1 y 3,7 ppm de etiqueta, mientras que el plasma y los riñones mantienen niveles muy estables de aproximadamente
2 ppm, después de la administración de una dosis única. La administración crónica de aspartame (NC
grupo) dio lugar a un mayor rendimiento de etiqueta después de la última administración, como se observa al comparar los datos

durante 6 horas, que van desde 130-140% del valor obtenido en el grupo NA sola. Una estimación bastante conservadora puede indicar

que la incorporación diaria de carbono aspartame estaba en el intervalo entre 2 y 4 ppm de tejido hepático, es decir, después de 11

días la acumulación puede ser de hasta 30 ppm. En las ratas con cirrosis, el patrón de distribución de etiquetas era bastante similar a la

de las ratas sanas. En general, la cantidad de radiactividad en el hígado y el riñón fue menor, pero mayor en WAT que en las ratas de

hígado normal. El recuento de la radiactividad en plasma después de la precipitación con ácido de la proteína (que fijaría ácido libre

fórmico y metanol, pero no formaldehído) dio un rendimiento de menos ffim 2% de etiqueta total en el sobrenadante, es decir,

prácticamente toda la radiactividad en el plasma a las 6 horas se une a las proteínas. El mismo experimento realizado con el hígado dio

un rendimiento de 20-23% del marcador en el sobrenadante, el resto unido a proteínas y ácidos nucleicos. La forma de la evolución

temporal de la etiqueta presente en el hígado está de acuerdo con este hallazgo, ya que existe una cierta desintegración de la marca

presente en ese órgano con el tiempo desde un máximo a los 60 min. Este mismo patrón se puede encontrar en varios otros tejidos

(tejido adiposo marrón, músculos, el cerebro y los ojos), pero en el extremo, una parte significativa de la etiqueta puede ser asumido

para ser retenido unido a la proteína. La radiactividad específica de hígado ARN, ADN y proteínas en las ratas tratadas con muy alta

actividad específica aspartame marcado se presenta en la Tabla 2. A pesar de una considerable variabilidad en los datos individuales,

ARN mostró una actividad específica más baja que el ADN y la proteína tuvieron los valores más altos por mg. Los datos también se

expresan como una proporción de alterado frente unidad estructural total (nucleótidos / aminoácidos), es decir, unidades que incorporan

uno de los carbonos marcados derivados de aspartamo frente nucleótidos totales o aminoácidos. Esta relación se obtuvo dividiendo la

actividad específica que se encuentra por la del aspartamo en la sonda. Los coeficientes obtenidos muestran que la uniformidad entre

la proteína y el ADN fue mayor que cuando se expresa por unidad de peso. ratas cirróticas mostraron actividades específicas alta

hígado, en el mismo intervalo general como lo hicieron las ratas normales. Aproximadamente, el hígado contenía aproximadamente un

cuarto de su etiqueta en forma de "soluble", 2/3 en proteína y menos de 10% en los ácidos nucleicos, con una mayor proporción en el

ADN que en el ARN. Los datos también se expresan como una proporción de alterado frente unidad estructural total (nucleótidos /

aminoácidos), es decir, unidades que incorporan uno de los carbonos marcados derivados de aspartamo frente nucleótidos totales o

aminoácidos. Esta relación se obtuvo dividiendo la actividad específica que se encuentra por la del aspartamo en la sonda. Los

coeficientes obtenidos muestran que la uniformidad entre la proteína y el ADN fue mayor que cuando se expresa por unidad de peso.

ratas cirróticas mostraron actividades específicas alta hígado, en el mismo intervalo general como lo hicieron las ratas normales.

Aproximadamente, el hígado contenía aproximadamente un cuarto de su etiqueta en forma de "soluble", 2/3 en proteína y menos de

10% en los ácidos nucleicos, con una mayor proporción en el ADN que en el ARN. Los datos también se expresan como una proporción de alterado frente unidad e

La Figura 2 representa la distribución de la etiqueta en dos chromatograins capa fina, la primera que muestran la distribución
de etiquetas de hidrolizados de ADN, a partir de las ratas que recibieron alta aspartame actividad específica, y la segunda,
ejecute en las mismas condiciones, representa la ubicación de adenina marcada, guanina y los puntos de timina. En el
hidrolizado de ADN, la radiactividad presente en los lugares de adenina, guanina y timina era nula, puesto que la etiqueta
estaba presente en otro punto diferente y distinto, que se supone que corresponden a los productos de adición de carbono
meffimol derivados y bases constitutivas de ADN. Los valores de Rf para las bases y el aducto eran muy diferentes: aducto de
0,05 / 0,0 (primera marcha / segunda pista), guanina

0,10 / 0,22, adenina 0,40 / 0,43, timina 0,57 / 0,49.

La separación a través de HPLC de las fracciones marcadas en el hidrolizado de ADN dio como resultado tres picos
principales, que eluye a 7,65, 11,94 y 12,86 min. Timina eluye a 8,95 min, guanina en 9,42 min y adenina en 12,28
min en las mismas condiciones.
La Figura 3 muestra la distribución de la radiactividad en tres placas de cromatografía en capa fina. La primera placa muestra la
distribución de etiquetas obtenido después de procesar el producto de la hidrólisis de proteína del plasma de las ratas tratadas
con alta actividad específica aspartame etiquetado. La segunda placa muestra los resultados de una muestra de albúmina
expuestos al formaldehído marcado y corrió en paralelo con las otras muestras.

La tercera placa contiene el punto de DNP-metionina. Los valores de Rf para las manchas radioactivas fueron: in vivo
marcado de proteínas plasmáticas 0,24 / 0,86 (primera marcha / segunda pista), in vitro marcado con albúmina: tres puntos, A
0.02 / 0.0, B 0.38 / 0.0 y C 0,38 / 0,88, DNP metionina 0,44 / 0,51. Las placas se cargaron considerablemente con la muestra
a fin de obtener una grabación mínima radioactividad. Esto dio lugar a "colas" largas y manchas borrosas. en cualquier caso,
no fue una coincidencia justo en uno de los lugares de in vitro albúmina marcada (C) con la observada en las proteínas del
plasma marcadas in vivo. El punto de metionina era bastante diferente de éste. Además, el punto radiactiva de proteína de
rata expuesto (y los de las proteínas plasmáticas de formaldehído-marcado) no eran coincidentes con cualquiera de los
aminoácidos de proteínas convencionales
TABLA II

La actividad específica de ARN de hígado, ADN y proteínas en las ratas que recibieron alimentación forzada
alta actividad específica de la proteína marcada.

FIGURA 2
Discusión

La incorporación inferior de la etiqueta de metanol en la mayoría de los tejidos de las ratas con cirrosis, en comparación con los
controles, puede ser la consecuencia de la captación hepática reducida de sustratos, pero también el resultado de una actividad
metabólica global reducida en el hígado dañado de las ratas (44). Estos efectos se reflejan claramente por su retraso en el
crecimiento y la alta tasa de mortalidad durante el proceso de intoxicación, de aproximadamente 50% de las ratas (36). La
insignificancia relativa de las diferencias entre los grupos normales y cirróticos indica que el hígado no es esencial en el proceso de
transferencia de carbono aspartame a las proteínas del tejido, es decir, que no hay una relación directa entre la capacidad de
procesar alcoholes y la retención de metanol de carbono, unido a los componentes del tejido.

La presencia de alta etiqueta en el plasma y el hígado está de acuerdo con el carro de la etiqueta desde el intestino al hígado por la

vena portal. Los altos niveles de la etiqueta en el riñón y, en menor medida, en el tejido adiposo marrón y el cerebro son probablemente

una consecuencia de sus flujos de sangre (45). Incluso en el tejido adiposo blanco, los niveles de radiactividad encontrados 6 horas

después de la administración oral fueron 1 / 25a los de hígado. Córnea y retina, ambos tejidos conocidos para metabolizar activamente

metanol (21,28) mostró niveles bajos de etiqueta retenida. En cualquier caso, la unión de carbono metanol derivado a proteínas del

tejido fue generalizada, que afecta a todos los sistemas, alcanzando plenamente los objetivos incluso sensibles, tales como el cerebro y

la retina. En todos los grupos estudiados, el marcador unido encuentra en el plasma y los tejidos se corresponde con que se inyecta con

aspartamo, ya que no hay otra fuente de radiactividad disponible. La falta de cambios en la radiactividad en plasma del 1 al 24 h sugiere

que la vida media de este carbono recién añadido era bastante largo, impidiendo así la posibilidad de que la etiqueta detectada

simplemente corresponden a metanol sin ataduras. El marcador unido a las proteínas plasmáticas no era aspartame, puesto que la

última es una especie molecular no reactivos completamente hidrolizado en el intestino (1-2); el péptido nunca llegó a estar en contacto

con los tejidos de rata o de sus componentes. No fuimos capaces de reproducir cualquier marcaje directo de proteína expuesta ya sea

al aspartamo, metanol ni el ácido fórmico. lo que evita la posibilidad de que la etiqueta detectada simplemente corresponden a metanol

sin ataduras. El marcador unido a las proteínas plasmáticas no era aspartame, puesto que la última es una especie molecular no

reactivos completamente hidrolizado en el intestino (1-2); el péptido nunca llegó a estar en contacto con los tejidos de rata o de sus

componentes. No fuimos capaces de reproducir cualquier marcaje directo de proteína expuesta ya sea al aspartamo, metanol ni el ácido

fórmico. lo que evita la posibilidad de que la etiqueta detectada simplemente corresponden a metanol sin ataduras. El marcador unido a las proteínas plasmáticas n

La mayor parte de la etiqueta que se encuentra en los tejidos es el resultado de la formación de formaldehído o (en menor
proporción, en cualquier caso, debido a su menor reactividad) aductos de formiato. El metanol es altamente volátil y,
finalmente, su radiactividad apenas podía tenerse en cuenta, ya que el método de conteo ya se elimina esta posibilidad.
Además, el mantenimiento estabilizada de los niveles de radioactividad en plasma no podría pertenecer a formiato ni
metanol,
ya que estos sustratos no unidos se toman fácilmente hacia arriba y oxidan por los tejidos, se filtra por el riñón o incluso perdido a
través de la respiración como ocurre con alcoholes volátiles de cadena corta. La forma de la gráfica del curso del tiempo que
representa los cambios en la etiqueta de tejido apoya la hipótesis de si se asume que la etiqueta se une firmemente al menos por 6
horas después de la administración de aspartamo. Este comportamiento también se encuentra en aductos de formaldehído-proteína
(3 1), especies de larga vida difícil de eliminar, en la que la proteína se desnaturaliza y su función original alterado.

La transferencia de unidades "de un carbono" de aspartame a las proteínas plasmáticas y tisulares se ha conocido
durante un tiempo (35). Su naturaleza, y el mecanismo de unión, sin embargo, se supone que debido a la incorporación
del carbono metanol para estructuras de aminoácidos normales (que forman esencialmente el grupo metilo de la
metionina) a través del tetrahidrofolato "de un carbono" y S-adenosil- vías rnethionine (35). La falta de radiactividad en el
punto de metionina a partir de proteínas de rata marcado aspartme tratados, sin embargo, muestra que este supuesto ya
no podía ser mantenida. El hallazgo de otro -different- marcado DNP derivatizado ácido (s) amino en los hidrolizados de
proteínas expuestas confirma que la etiqueta no se realizó en proteína mediante el etiquetado metabolismo de la piscina
de un carbono de metionina,

es decir, antes de la síntesis de la proteína. La coincidencia de este etiquetado residuo de ácido DNP-amino con la obtenida de
la proteína experimentalmente expuestos a formaldehído confirma que la etiqueta fijada a proteínas de rata después de la
exposición aspartame marcado se deriva a partir de aductos de formaldehído, y definitivamente demuestra que la etiqueta en las
proteínas del tejido no se corresponde con metionina.

Esto concuerda con la incorporación de la etiqueta en la proteína completamente sintetizado a una velocidad notablemente uniforme
de distribución de etiquetas entre las especies moleculares diferentes a pesar de su eventual diferente volumen de negocios (síntesis)
tarifas.

El análisis de distribución de etiquetas en los ácidos nucleicos muestra una notable uniformidad en las actividades específicas de ADN
y proteínas, con RNA que muestra los valores algo inferiores en el mismo rango. Esta distribución está de acuerdo con una exposición
bastante uniforme a las mismas especies que reaccionan, y no podía ser explicado a través de la incorporación de las vías de un
carbono en las moléculas que muestran ampliamente diferentes vidas medias, como es el caso con el ARN altamente reciclada y
algunas proteínas y ADN y las proteínas de larga duración. El hallazgo de grandes cantidades de etiqueta en el ADN, más alta que en el
ARN, se podría solamente explica a través de la reacción directa, ya que su baja rotación requeriría tiempos de exposición
excesivamente largos para lograr las actividades específicas observadas. La existencia adicional de diferentes bases marcadas,
probablemente se formó por la unión de formaldehído y el " basa no coincide con ninguna de las otras bases. Los chromatograius de
capa delgada muestran una sola mancha, resuelto en al menos tres picos, ninguno de los que coincidieron con la adenina, guanina ni
timina. La falta de etiqueta en estos puntos es incompatible con la vías de "one-carbono" hipótesis de incorporación de etiquetas, ya que
se necesitan dos unidades "IC" para la síntesis de adenina y guanina y uno para la de timina. La presencia de marcador en otras
moléculas diferentes apoya fuertemente la formación postulado aducto, atribuyendo a formaldehído la responsabilidad principal de la
aparición de etiqueta metanol aspartamo en los componentes del tejido. La evidencia presentada, a continuación, demuestra que una
porción significativa del carbono metanol de aspartamo encuentra su camino en aductos de proteínas y ácidos nucleicos basa no
coincide con ninguna de las otras bases. Los chromatograius de capa delgada muestran una sola mancha, resuelto en al menos tres
picos, ninguno de los que coincidieron con la adenina, guanina ni timina. La falta de etiqueta en estos puntos es incompatible con la vías
de "one-carbono" hipótesis de incorporación de etiquetas, ya que se necesitan dos unidades "IC" para la síntesis de adenina y guanina y
uno para la de timina. La presencia de marcador en otras moléculas diferentes apoya fuertemente la formación postulado aducto,
atribuyendo a formaldehído la responsabilidad principal de la aparición de etiqueta metanol aspartamo en los componentes del tejido. La evidencia presentada, a co
en las condiciones ensayadas, tanto en ratas normales y cirróticos. Los resultados presentados muestran que los aductos
de carbono de la proteína y el ADN se podrían haber generado sólo de formaldehído derivado de metanol aspartame, ya
que todas las formas otherbiochemical en el que este carbono puede encontrarse no podría producir aductos con proteínas
y ácidos nucleicos.

Las dosis de aspartamo dadas a las ratas en este experimento eran altos, mayor al menos que cualquier ser humano puede
recibir todos los días con consumo normal del aditivo -en el intervalo de 2-6 mg / kg-día (46) -, pero eran similares a los
utilizados en las pruebas comparables sobre los roedores en la que no se detectaron efectos nocivos. Estas dosis estaban en
el mismo rango que el adi para los seres humanos establecidos para Canadá y la CE (40 mg / kg-día) (46). La dosis
administrada fue también menor que la utilizada para los estudios de toxicidad, que han mostrado que incluso a dosis muy
altas aspartamo no produce daño inmediato apreciable (I 7). La mayoría de estos estudios, sin embargo, se refieren a dirigir
efectos de toxicidad aguda, que no se observaron ya sea en las ratas utilizadas en el presente estudio (excepto, quizás, para
excrementos más suaves en los sometidos a tratamiento crónico con gavages aspartamo).

La cantidad de etiquetas recuperada en los componentes del tejido era bastante alta en todos los grupos, pero especialmente en
las ratas de NA. En ellos, el hígado solo retenido, por un largo tiempo, más de 2% del metanol de carbono dado en una sola dosis
oral de aspartame, y el resto del cuerpo almacenado un 2% adicional o más. Estos son de hecho los niveles extremadamente
altos de productos de adición de formaldehído, una sustancia responsable de los efectos perjudiciales crónicos (33) que también
ha sido considerado carcinogénico (34,47). La aparición repetida de las reivindicaciones de que el aspartamo produce dolor de
cabeza y otros efectos secundarios neurológicos y psicológicos -más a menudo que no desafiado por análisis- cuidado
(5,9,10,15,48) puede eventualmente encontrar al menos una explicación parcial en la permanencia de la etiqueta formaldehído,
ya que la intoxicación formaldehído puede inducir efectos similares (49).

Los efectos acumulativos derivados de la incorporación de la etiqueta en el modelo de la administración crónica sugiere que
el consumo regular de aspartamo puede resultar en la acumulación progresiva de aductos de formaldehído. Se puede
especular que la formación de aductos puede ayudar a explicar el consumo de aspartamo efectos crónica puede inducir en
tejidos sensibles tales como el cerebro (6,9,19,50) más. En cualquier caso, los posibles efectos negativos que la
acumulación de productos de adición de formaldehído puede inducir es, obviamente, a largo plazo. La alteración de la
integridad de las proteínas y puede funcionar necesita algo de tiempo para inducir efectos sustanciales. El daño a los ácidos
nucleicos, principalmente al ADN puede llegar a inducir la muerte celular y / o mutaciones. Los resultados presentados
sugieren que la conversión de metanol aspartame en aductos de formaldehído en cantidades significativas en vivo debe a
tenerse en cuenta debido a la amplia utilización de este edulcorante. Se necesitan más estudios epidemiológicos y de largo
plazo para determinar el alcance del peligro que supone el consumo de aspartamo para los seres humanos.

Expresiones de gratitud

Esta investigación se llevó a cabo dentro de un estudio general de la toxicidad de los edulcorantes artificiales apoyado
a través de la Fundación Bosch y Gimpera, Barcelona. Se agradece a
Robin Rycroft, al Servicio de Asesoramiento Idiomas de la Universidad de Barcelona, ​por la revisión del
manuscrito.

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