LABORATORIO DE QUÍMICA

PRACTICO

MÉTODOS DE SEPARACIÓN: CROMATOGRAFÍA

I.OBJETIVO
❖ Conocer y comprender los fundamentos de la cromatografía.
❖ Utilizar las diferentes técnicas cromatográficas para identificar y purificar compuestos Orgánicos.
❖ Conocer el procedimiento para elegir el eluyente más adecuado para separar una mezcla de carotenos por
cromatografía en columna.

II.INTRODUCCION
La cromatografía es una técnica de separación de solutos de una mezcla, que se basa en la diferente velocidad
con que se mueve cada uno de los solutos a través de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en
movimiento. A este disolvente se le llama fase móvil y el medio poroso puede ser la fase estacionaria, o bien servir
de soporte a esta fase. Se habla de cromatografía en columna cuando la fase estacionaria o su soporte están
contenidos en una columna.

La separación cromatográfica constituye un proceso dinámico que permite un intercambio continuo por
desplazamiento de una fase con respecto a la otra. El diferente reparto de solutos entre las fases móvil y
estacionaria es la causa de la separación de los solutos. El soluto que tiene mayor afinidad por la fase estacionaria
se moverá con mayor lentitud.
La fase móvil se llama eluyente. Cuando emerge por la salida de la columna se llama eluato. El proceso que
consiste en hacer pasar un líquido o un gas a lo largo de la columna de cromatografía se llama elución. El volumen
de elución (ve) es el volumen de fase móvil que se requiere para eluir un soluto dado de la columna cromatográfica.

Se puede clasificar las cromatografías en 5 grandes grupos:

A. Cromatografía de Reparto.
B. Cromatografía de Adsorción.
C. Cromatografía de Intercambio Iónico.
D. Cromatografía de Exclusión.
E. Cromatografía de Afinidad.

A. Cromatografía de Reparto:
Está basada en la separación o reparto de una mezcla de solutos entre la fase móvil (disolvente) y la fase
estacionaria soportada sobre un sólido adecuado, de acuerdo a las distintas solubilidades de estos solutos en
ambas fases. Si el disolvente es un líquido se denomina cromatografía líquida.
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Son cromatografía de reparto la cromatografía en papel y la cromatografía en capa fina (TLC).

La cromatografía en papel se utiliza para la separación de cantidades mínimas de soluto y también como un criterio
de pureza. Se basa en la diferente velocidad con qu e se mueve cada uno de los solutos a través de una fase
estacionaria que es el agua retenida sobre un soporte sólido e inerte (celulosa), arrastrado por un disolvente en
movimiento.

Una vez realizada la cromatografía, la posición de los componentes se determina mediante una técnica que permita
“visualizarlos”. Es común revelar el cromatograma mediante reacciones que originen productos coloreados.

Los componentes de una mezcla se pueden identificar por su migración con respecto al solvente móvil en
condiciones definidas en relación con el comportamiento de patrones. El cromatograma no es alterado por la
presencia de otros solutos.

Se calcula la razón de migración del soluto con respecto a la fase móvil ( Rf ) que se compara con la de los patrones

El Rf debe calcularse de acuerdo a la distancia recorrida por el soluto, desde su punto de partida hasta el punto
medido de la posición de éste una vez corrida la cromatografía, y la distancia recorrida por la fase móvil, también
medida desde el punto de partida del soluto hasta el frente del solvente en el papel.

Como los Rf son constantes en condiciones definidas y controladas permiten identificar los componentes de una
mezcla de solutos, en la medida que los Rf de muestras y patrones se obtengan en un mismo experimento.

B. Cromatografía de Adsorción:
Está basada en la diferente adsorción y posterior desorción de sustancias contenidas en un disolvente móvil
(líquido o gas) sobre un sólido estacionario. No se debe confundir la adsorción que es un fenómeno de superficie
que se manifiesta por el aumento de concentración de la interfase que rodea al medio estacionario, con la absorción
que consiste en la penetración de una sustancia en el seno de otra. Ejemplos de cromatografía de adsorción son
la cromatografía en columna de alúmina y de carbón activado, la placa de sílica gel.
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C. Cromatografía de Intercambio Iónico:

La fase estacionaria es una matriz polimérica porosa que posee grupos iónicos unidos covalentemente y contra-
iones móviles que pueden ser intercambiados por iones arrastrados por la fase móvil (líquido).

D. Cromatografía de Exclusión Molecular:

Las moléculas pueden ser separadas también sobre la base de sus diferentes tamaños al pasar a través de una
columna que contiene partículas hidratadas de geles porosos. Se encuentra en el mercado un buen número de
materiales para estos fines, cuya composición y porosidad son controladas cuidadosamente, de modo que
moléculas de tamaño relativamente parecido puedan ser separadas mediante la adecuada selección del tamaño
del poro gel (tabla 1). El Sephadex consta de partículas pequeñas de dextrano formadas por una red tridimensional
de cadenas de polisacáridos ramificados. Es altamente polar debido a su alto contenido de grupos hidroxilos, por
ello se hincha considerablemente cuando se coloca en agua. La mezcla de moléculas grandes y pequeñas se
colocan sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la muestra desciende por la columna, las moléculas
pequeñas difunden dentro del gel teniendo que recorrer un camino más largo, mientras que las moléculas grandes
pueden ser completamente excluidas de los poros del gel. Eventualmente se obtiene una separación completa en
la que las moléculas grandes salen primero de la columna y por último las más pequeñas.

III.PARTE EXPERIMENTAL

a. -Preparación de la muestra
En un mortero, machacar una hoja de acelga con una mezcla de 4 ml de hexano y 2 ml de etanol. Con una pipeta
Pasteur transferir el extracto a un tubo de ensayo y agitar con mucha suavidad con una cantidad igual de agua,
evitando la formación de emulsiones. Eliminar la fase acuosa con ayuda de una pipeta Pasteur, y el lavar
sucesivamente dos veces con 2 ml de agua para eliminar el etanol. Transferir la fase orgánica a un tubo de ensayo
y añadir con una espátula sulfato sódico anhidro para eliminar el agua.

b.- Preparación de la placa de cromatografía.

Marcar la placa, con ayuda de un lápiz los puntos en donde se va depositar la muestra (tres puntos). Con un capilar,
tomar un poco de la disolución orgánica conteniendo los pigmentos y pinchar la placa de cromatografía en los tres
puntos con concentraciones diferentes. Para evitar que la mezcla difunda por la placa, vaciar el contenido del
capilar poco a poco sobre el punto, y soplar suavemente cada vez, para secar el disolvente.
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c.- Desarrollo de las placas

Preparar varias mezclas de disolventes, desarrollar las placas. Preparar unos 10 ml de eluyente cada vez,
empezando por una mezcla de Hexano/Acetona 7:3 Hexano/Etanol 6:4 Cloroformo/Acetona 6:4

Disolventes Mezclas
Hexano
Cloroformo
Acetona
Etanol

Una buena separación revela la presencia de al menos siete puntos coloreados

IV.PREGUNTAS

1. Calcular el Rf de cada uno de los puntos obtenidos

2. Indicar cuál sería la mezcla de disolventes más adecuados para realizar la separación.

3. ¿Cuáles son algunos criterios que deben tenerse en cuenta en la elección de absorbente en una separación

cromatográfica determinada?

4. ¿En qué consiste la cromatografía de CCD preparativa?

5. Usted tiene un compuesto impuro y quisiera saber cuántas sustancias están contaminando su compuesto.

Explique cómo lo haría utilizando cromatografía de capa delgada o de papel.

6. Investigue el nombre que reciben los reveladores de yodo y ácido sulfocrómico. Porque?