UNIVERSIDAD VERACRUZANA

Facultad de Química Farmacéutica

Biológica

MANUAL DE LABORATORIO DE
BIOQUÍMICA

Elaborado por:

Dra. Alma Vázquez Luna

M.C. Gabriel Arturo Soto Ojeda

Dra. Minerva Hernández Lozano

Dra. Silvia Devars Ramos

Dra. Yolanda Cocotle Ronzón

Xalapa de Enríquez, Veracruz 2017

 Laboratorio de Bioquímica

ÍNDICE
INTRODUCCIÓN...............................................................................................................iv
OBJETIVOS ...................................................................................................................... v
AGUA................................................................................................................................ 2
PRÁCTICA No. 1. DETERMINACIÓN DE pKA .............................................................. 5
PRÁCTICA No. 2.PREPARACIÓN DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS. ............... 8
AMINOÁCIDOS Y PÉPTIDOS......................................................................................... 12
PRÁCTICA No. 3.IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN
CAPA FINA . ................................................................................................................ 14
PROTEÍNAS.................................................................................................................... 21
PRÁCTICA No. 4. CRISTALIZACIÓN DE LA ALBÚMINA DE HUEVO......................... 24
PRÁCTICA No. 5. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. ............................................. 27
CARBOHIDRATOS ......................................................................................................... 31
PRÁCTICA No. 6. IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS POR CROMATOGRAFÍA
EN CAPA FINA. ........................................................................................................... 39
PRÁCTICA No. 7. CUANTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS. ................................... 42
ENZIMAS ........................................................................................................................ 47
PRÁCTICA No. 8. CINÉTICA ENZIMÁTICA: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL
SUSTRATO, DE LA ENZIMA Y DEL INCREMENTO DE LA TEMPERATURA. ........... 51
LÍPIDOS .......................................................................................................................... 57
PRÁCTICA No. 9. EXTRACCIÓN E IDENTIFICACIÓN DEL COLESTEROL. .............. 59
PRÁCTICA No. 10. DETERMINACION DE CAROTENOS........................................... 62
ÁCIDOS NUCLEICOS..................................................................................................... 65
PRÁCTICA No. 11. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DEL ADN.¡Error! Marcador no
definido.
PREPARACIÓN DE REACTIVOS................................................................................... 72
CONTROL DE CALIDAD: ............................................................................................... 74
BIBLIOGRAFÍA:.............................................................................................................. 77

i
 Laboratorio de Bioquímica

EVALUACIÓN:

Técnicas Porcentaje
Evaluación de conocimientos y habilidades del
pensamiento:
60 %
a) Examen parcial.
b) Reportes de prácticas.
Evaluación de habilidades de ejecución y actitudes:
a) Pruebas de ejecución, escala, guías de observación,
asistencia. 40 %

Corresponde al 40 % del curso teórico 100 %

INVESTIGACIÓN POR PRÁCTICA:

Incluirá una investigación documental para el marco teórico acompañada del

diagrama de trabajo. Incluirán fundamentos o conceptos manejados en la sesión, así como
una justificación del uso de los reactivos y métodos empleados en la práctica acompañados
de sus respectivas citas bibliográficas.

PRÁCTICA:

Deberá incluir parte de la investigación realizada previamente. Si existen dos o más

trabajos individuales iguales no tendrán valor en la evaluación. La práctica completa para
ser válida deberá incluir los siguientes apartados:

1) Titulo
2) Objetivo
3) Resumen
4) Introducción
5) Marco teórico
6) Material y método
7) Resultados
8) Discusión
9) Conclusión
10) Cuestionario
11) Bibliografía

ii
 Laboratorio de Bioquímica

ACTIVIDADES DURANTE LA PRÁCTICA:

Comprende la realización de la práctica de acuerdo con el diagrama de trabajo propuesto.

Se considerará tanto la forma de trabajar, como la disposición de trabajo en equipo, el
cumplimiento en el horario establecido. Material, puntualidad, y limpieza durante la
realización de las prácticas. No se permitirá abandonar el laboratorio a los integrantes del
equipo hasta que recojan su material y limpien la mesa.

CUESTIONARIO:

Se entregarán como parte de la práctica. La bibliografía utilizada para obtener las

respuestas también se incluirá en la práctica.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES:

iii
 Laboratorio de Bioquímica

INTRODUCCIÓN

La bioquímica es una ciencia joven que hasta hace unas décadas no se le

consideraba por derecho propio una ciencia sino una rama de alguna otra como la fisiología
o la química. Hoy el progreso que esta ciencia ha alcanzado ha enriquecido de manera
notables el entendimiento de las la bases de la vida y ha abierto nuevas áreas de interés
como son la diferenciación celular, la evaluación, el comportamiento y la memoria.

No obstante que los organismos vivos e incluso las células individuales que los constituyen
tienen una gran complejidad, comparten ciertas características unificadas como es el hecho
de que se usan los mismos tipos de biomoléculas y todos consumen energía. Por ello los
seres vivos pueden estudiarse con los métodos de la química, física y las disciplinas
aparentemente sin relación con la bioquímica pueden contestar importantes preguntas en
esta área de la ciencia.

La experiencia educativa denominada Laboratorio de Bioquímica que se imparte en la

Facultad de la Universidad Veracruzana tiene, al igual que todas las experiencias
educativas que integran el plan de estudios de esta licenciatura, como uno de los principales
objetivos que los alumnos desarrollen conocimientos, habilidades, destrezas, actitudes y
valores necesarios para adquirir un pensamiento lógico, crítico y creativo, este trabajo tiene
el fin de contribuir a ello.

El contenido hace énfasis en la estructura y dinámica de importantes componentes de la

célula y se encuentra divido por temas acorde al programa de estudios de la parte teórica
cada uno contempla una serie de prácticas que además de proporcionar el fundamento de
la parte experimental incluye un breve cuestionario para reforzar los conocimientos y cada
practica a realizar ha sido adaptada para resaltar conceptos, principios y pruebas concretas
representativas de la notable unidad bioquímica que exhiben todas las formas de vida.

En la parte final de este trabajo se incluye un anexo en donde se encuentran las

metodologías para la preparación de reactivos y soluciones a utilizar en cada práctica,
además de las consideraciones necesarias sobre el control de calidad de equipos y material
del laboratorio.

iv
 Laboratorio de Bioquímica

Objetivo General

Que el alumno adquiera conocimientos y desarrolle habilidades, destrezas, actitudes

y valores necesarios para favorecer el trabajo responsable individual y en equipo,
adquiriendo un pensamiento lógico, crítico y creativo y adquieran las competencias y
habilidades propias de su formación en el área de la Bioquímica.

Objetivos Particulares

Que el alumno:

Realice una serie de prácticas que le permitan identificar las características

fisicoquímicas y bioquímicas de las biomoléculas.
Desarrolle habilidades para aprender a utilizar el método científico como una
herramienta en la identificación, análisis y la solución de problemas.
Fortalezca actitudes de compromiso y apertura mediante el trabajo en equipo.

v
Laboratorio de Bioquímica

1
 Laboratorio de Bioquímica

AGUA
A causa de su ubicuidad el agua La mayor electronegatividad del
es considerada con frecuencia un líquido oxígeno con respecto al hidrógeno
inerte y meramente destinada a llenar los determina una distribución asimétrica de
espacios en los organismos vivos. Pero, la carga eléctrica en torno al átomo de
en realidad el agua es una sustancia de oxígeno y por lo tanto un déficit
gran reaccionabilidad con propiedades electrónico en torno a la de hidrógeno.
poco frecuentes, que la diferencia tanto Todo ello hace que la molécula de agua
física como químicamente de los líquidos sea un dipolo eléctrico.
corrientes.
Una importante consecuencia de la
El agua es la biomolécula más polaridad de la molécula de agua es la
abundante en el ser humano. Constituye atracción de las moléculas de agua por
un 65- 70% del peso total del cuerpo, este otras. La atracción entre una carga
contenido debe mantenerse próximo a parcialmente positiva del átomo de
esos valores pues de lo contrario al fallar hidrógeno y una molécula de agua, una
la homeostasis, el organismo se ve parcialmente negativa del átomo de
abocado a situaciones patológicas. La oxígeno y otra, produce un puente de
importancia del estudio de esta hidrógeno.
biomolécula radica en el hecho de que
prácticamente la totalidad de las
reacciones bioquímicas del organismo
tiene lugar en el seno del agua.
104.5 °C
La estructura de la molécula del
agua (H2O) tiene carácter tetraédrico, con
el átomo de oxígeno en el centro y los dos
átomos de hidrógeno dispuestos en dos
de los vértices de dicho tetraedro,
quedando los otros dos restantes Figura 1.1
ocupados por los electrones no
Ángulos entre los enlaces covalentes de
compartidos. El ángulo formado entre los
la molécula de agua.
dos átomos de hidrógeno es de 104.5°
mientras que la distancia de enlace entre
el oxígeno e hidrógeno es de 0.096nm.

2
 Laboratorio de Bioquímica

La estructura del agua, con la Disolvente de moléculas

consiguiente capacidad de formar anfipáticas: se lleva a cabo por la
puentes de hidrogeno va a reconstituir el formación de micelas.
fundamento de las propiedades físicas y Disolvente de compuestos polares
químicas del agua. Estas son: de naturaleza no iónica: gracias a
la capacidad para establecer
Elevada temperatura de ebullición:
puentes de hidrógeno.
100 °C.
Elevada tensión superficial:
Densidad máxima de 4 °C: basada
determinada por una elevada
en la presencia de puentes de
cohesión entre las moléculas de
hidrógeno. Se debe al aumento
su superficie tendiendo a que la
del volumen de agua sólida con
superficie libre de agua sea
respecto a la líquida.
mínima.
Elevado calor específico: (1 cal/g x
Transparencia: no afecta
°C) calor necesario para elevar la
directamente al ser humano, pero
temperatura de 1 g de líquido en 1
es importante para que se pueda
°C.
producir el proceso de la
Elevado calor de evaporización:
fotosíntesis a la masa oceánica y
(536 cal/g) calor necesario para
fondos marinos.
vaporizar 1 g de líquido.
Elevada conductividad calorífica: Ionización del agua
permite una conducción de calor
Debido a la ionización de algunas
adecuada en el interior corporal
moléculas de agua, el agua pura no solo
(termorregulación)
consiste en H2O, también tiene una
Elevada constante dieléctrica: (K=
concentración baja de iones hidronio, otra
80 a 20 °C), implica que es un
concentración igual de iones hidróxido. El
buen disolvente de compuestos
ion hidronio algunas veces escrito como
iónicos.
H3O+ realmente tiene varias moléculas de
Capacidad de hidratación y
agua asociadas a él. Es más conveniente
solvatación de iones: debido al
referirnos al ion hidronio como protones
carácter bipolar sus moléculas
representando así: H+.
pueden rodear distintos iones
aislándolos del resto:

3
 Laboratorio de Bioquímica

De acuerdo con el concepto de Bronsted- La ionizacion del agua pura produce

Lowry un ácido es un donador de protones 10− M H+ y 10− M OH − .
y una base un aceptador.
Ácido- base
La ionización del agua puede ser
Los valores de H+ de la mayor parte de
analizada cuantitativamente. La constante
las disoluciones son muy pequeñas, como
de equilibrio para ionización del agua está
para compararse. Una magnitud más
dada por:
práctica es la conocida como pH.
H OH
Keq
H O

Porque la masa de 1 L de agua es 1000 g pH log H +

y la masa de 1 mol de agua es de 18 g, el

La relación entre el pH de una disolución
agua tiene una concentración de
y las concentraciones de un ácido y de su
aproximadamente 55.5 M. por lo que:
base conjugada pueden deducirse con la

Keq 55.5 M [H+][OH] ecuación de Henderson- Hasselbach:

La constante de equilibrio para la log A−

pH pK
HA
ionización del agua es de 1.8 x 10-16 a 25
°C debido a que la constante de equilibrio Tampones:
es tan pequeña, la concentración de agua
Los tampones estabilizan el pH de
permanece casi inalterada por ionizacion.
una solución.
Sustituyendo la Keq queda:
La capacidad de un tampón para resistir
× 10− 4 + −
las variaciones de pH cuando se añade
A 25 °C tiene un valor de 1 × 10− 4 M , ácido o base es directamente
constante designada como Kw. proporcional a la concentración del par
−
conjugado ácido- base . Es
+ − − 4
Kw H OH 1 × 10 M
máxima cuando pH=pK y decrece al variar
Tomando la raíz cuadrada de los el pH desde dicho punto.
términos:

+
1.0 × 10−

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 Laboratorio de Bioquímica

UNIVERSIDAD VERACRUZANA
ÁREA ACADÉMICA TÉCNICA
FAC. DE QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGICA
LABORATORIO DE BIOQUIMÍCA
PRÁCTICA No. 1
DETERMINACIÓN DE pKA

Objetivo: Ahora es posible usar la ecuación de

Que el alumno realice una curva de
titulación de aminoácidos y a partir de ella
determine el pK y el pH en el que se
encuentra su poder amortiguador.
Fundamento:
Los ácidos difieren en el grado en que
se disocian en agua. Los ácidos fuertes se
disocian por completo; los ácidos débiles no.
La probabilidad de que un ácido se disocie se
define por su constante de disociación, K :
Henderson- Hasselbalch para predecir el
grado de disociación del medio:
pH pK log
Los aminoácidos tienen un grupo amino que
les permite actuar como base y combinarse
con ácidos; y un grupo carboxilo les permite
combinarse con bases. Los aminoácidos y
las proteínas sirven de amortiguadores y
pueden resistir a cambios de acidez y de
alcalinidad.

H+ A Materiales y reactivos
K =
HA
Material de laboratorio
Debido a que las formas protonadas y no
2 vasos de precipitado de 100 mL
protonadas de un ácido tienen propiedades
2 vasos de precipitados de 150 mL
biológicas diferentes, es importante poder
1 pipeta graduada de 1 mL
predecir el grado de disociación de un ácido
1 bureta
a cualquier pH. Es conveniente modificar la
1 agitador magnético
expresión de en una forma análoga al pH,
Piceta
el pK.

pK log K
Reactivos

20 ml por equipo de los siguientes

aminoácidos:

5
 Laboratorio de Bioquímica

Glicina 0.025 M pH 2.0 3. Añada 0.1 mL de NaOH 1.0 M. agitar

Lisina 0.025 M pH 2.0 el vaso y volver a medir el pH
Ácido aspártico 0.025 M pH 2.0 anotando los resultados.
NaOH 1M 4. Repita el paso 3 hasta llegar a un pH
de 12 aproximadamente.
Equipo 5. Haga lo mismo (pasos del 1 a 4) para
Potenciómetro los otros aminoácidos.
6. Haga una gráfica de pH contra
Procedimiento volumen en mL de NaOH gastados.
Determinación de pKa 7. Localiza en la gráfica los diferentes pK
1. Ponga 20 mL de la solución de glicina de los aminoácidos.
en un vaso de precipitados de 100 8. Identifica a que pH tienen poder
mL. amortiguador.
2. Proceda a la medición del pH.

HOJA DE RESULTADOS

Nombre: Grupo: Fecha:

1. Realice una gráfica de los resultados (pH contra mL de NaOH gastados).

2. Calcule el pK y el pH en el cual se encuentra la máxima capacidad amortiguadora.
3. Compare sus resultados con los reportados en la literatura.

Discusión de resultados:

Conclusión:

Cuestionario:
1. Indique el pKa de los siguientes ácidos:
a) Ácido pirúvico
b) Ácido láctico
c) Ácido benzoico
d) Ácido oxálico

6
 Laboratorio de Bioquímica

e) Ácido succínico
f) Ácido carbónico
2. Indique el nombre completo, pKa y peso molecular (o fórmula) de los siguientes
compuestos usados como reguladores de pH en bioquímica: TRIS, CAPS, MES, TES y
tricita.
3. ¿Para qué valores de concentración de los componentes de un buffer, tiene este la máxima
capacidad amortiguadora?
4. ¿Por qué los aminoácidos actúan como reguladores del pH?
5. Defina ¿Qué es la capacidad buffer?

Referencias Bibliográficas:
Libro: apellidos autor; Nombre. (Año).Titulo. Editorial. Edición. País. Página consultada.
Página de internet: Autor o responsable. Título. Fecha de última actualización. Liga: http://www.

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 Laboratorio de Bioquímica

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

ÁREA ACADÉMICA TÉCNICA

FAC. DE QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGICA

LABORATORIO DE BIOQUIMÍCA

PRÁCTICA No. 2

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS.

Objetivo:

Que el alumno aprenda a utilizar la contiene un ácido débil resiste cambios en el

ecuación de Herderson- Hasselbalch y por pH mejor que un volumen igual de agua
medio de esta prepare una solución debido a que el efecto amortiguador depende
amortiguadora. de los cambios en la disociación de un ácido
débil, un amortiguador es más eficaz dentro
Fundamento:
de los límites del pH, donde estos cambios
Las soluciones amortiguadoras son son más grandes, esto es, cerca del pK del
soluciones que conservan su pH con ácido.
tenacidad a pesar de que se les añadan
Procedimiento:
cantidades importantes de ácidos o álcalis.
Están formadas por una mezcla de ácidos Preparación de solución amortiguadora.
débiles y su base conjugada. Al hacer la
1.- Al recibir su problema, estudie las
mezcla entre un ácido débil y su sal en las
condiciones que se piden y busque un buffer
proporciones adecuadas, (estas
cuyo pKa sea adecuado y aplicando la
proporciones se calculan con la ecuación de
ecuación de Henderson-Hasselbach, calcule
Henderson-Hasselbach) logramos obtener
las cantidades de ácido y base conjugada
una solución que será resistente a los
que debe usar para preparar 100ml de
cambios bruscos de pH.
disolución.
Cuando el pH de la solución se aproxima al
2.- Pese las cantidades que calculó o mida
valor del pK del Ácido este comienza a
los volúmenes adecuados y disuelva. Afore
disociarse. Los protones liberados en el
aproximadamente a 75mL.
proceso reemplazan a muchos de los
titulados por la base. Asi una solución que

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 Laboratorio de Bioquímica

3.-Transfiera esta disolución a un vaso de La capacidad buffer es la cantidad de base

precipitados de 150 mL y verifique el pH en
un potenciómetro previamente calibrado y
ajustar la temperatura a las condiciones de
trabajo. Si el pH no es exactamente el pedido,
ajústelo agregando el componente (ácido o
base), que sea necesario para subir o bajar el
pH hasta el valor requerido. Para valores de
pH mayores a 6 usar la sal di básica de
fosfatos.
4.- Afore a 100 mL con agua destilada y
verifique nuevamente el pH.
Determinación de la capacidad Buffer.
fuerte requerida para alterar el pH de la
disolución reguladora, en una unidad de pH:
C. B.
Siendo dpH el incremento de pH resultante
de la adición de un volumen de db de base.
5.- Ponga su disolución en un vaso,
introduzca los electrodos del potenciómetro
y disponga una bureta con disolución de
NaOH 1 N medido exactamente en la bureta
(1mL). Anote el pH resultante. Repita las
adiciones de base, en los volúmenes iguales
(1 mL) y anote los valores de pH
correspondientes, hasta obtener por lo
menos cinco lecturas.

Disposición de desechos

Las soluciones amortiguadas pueden ser vertidas en la tarja; los sobrantes de NaOH deben
recuperarse en frascos ámbar con tapa para ser reutilizados.

HOJA DE RESULTADOS

Nombre: Grupo: Fecha:

a) Preparación de soluciones amortiguadoras:

1. Problema # ______ pH requerido ______ concentración molar _____ volumen final _____
ml.
2. Cálculos efectuados.
3. Cantidades por pesar o medir de A- y HA
4. ¿Cuál es el pH de la solución inicial y cuál el valor final de pH?
5. ¿Porqué para valores de pH cercanos a 5 se usan acetatos y para valores cercanos a 7
fosfatos?

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 Laboratorio de Bioquímica

Discusión.
Conclusiones.
Referencias Bibliográficas.
Libro: apellidos autor; Nombre. (Año). Titulo. Editorial. Edición. País. Página consultada.
Página de internet: Autor o responsable. Título. Fecha de última actualización. Liga: http://www.

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