Biocompatibilidad y osteogenicidad / calcificación.

Potencial de la caseína fosfopéptido-amorfo

Fluoruro de fosfato de calcio

Introducción: Se ha demostrado que la fosfato de caseína fosfopéptido-amorfo (CPP-ACP) y la CPP-ACP

con fluoruro (CPP-ACFP) proporcionan iones biodisponibles para promover la mineralización. Por lo
tanto, el objetivo de este estudio fue evaluar la biocompatibilidad de los materiales y el potencial
osteogénico / calcificación para aplicaciones endodónticas. Métodos: se incubaron líneas celulares tipo
osteoblasto y fibroblastos de ratón y humano con 0.05% –3.0% p / v CPP-ACP y CPP-ACFP, y toxicidad,
proliferación, fosfatasa alcalina, interleucina (IL) -1a e IL-6. Se determinó la producción, el colágeno tipo
I, la osteocalcina y la producción de osteopontina y la mineralización / calcificación. Resultados: CPP-
ACP y CPP-ACFP no fueron tóxicos y no tuvieron un efecto significativo sobre la proliferación o
producción de la citocina inflamatoria IL-1a. La actividad de fosfatasa alcalina de las células similares a
osteoblastos aumentó significativamente (P <.05) por CPP-ACP y CPP-ACFP, al igual que la producción
de la citocina osteotrópica IL-6, la formación de depósitos minerales de calcio y la secreción de
Proteínas relacionadas con la mineralización (colágeno tipo I y osteocalcina). Conclusiones: CPPACP y
CPP-ACFP son biocompatibles y tienen el potencial de inducir la diferenciación y mineralización
osteoblástica. Las aplicaciones potenciales incluyen apexificación, reparación de perforaciones, terapia
de pulpa vital y procedimientos de endodoncia regenerativa. (J Endod 2018; 44: 452–457)

Palabras clave

Biocompatibilidad, CPP-ACFP, CPP-ACP, diferenciación, endodoncia, proliferación.

Significado

Los resultados de este estudio sugieren que tanto la biomineralización mediada por células
(osteogénesis) como la precipitación espontánea de calcio (calcificación) fueron promovidas por CPP-
ACP / CPP-ACFP. Por lo tanto, CPP-ACP y CPP-ACFP pueden tener una aplicación potencial en
endodoncia contemporánea, incluida la apexificación, la reparación de la perforación, la terapia de
pulpa vital y los procedimientos de endodoncia regenerativa.
T

El mecanismo de acción de los cementos de reparación endodóntica que se basan en hidróxido de

calcio y silicato de calcio, como el agregado de trióxido mineral, depende de su bioactividad
representada por su capacidad para liberar iones como el calcio (Ca2 +) y el hidróxido (OH–). Calcio

Los cementos a base de silicato que liberan Ca2 + mejoran la viabilidad, proliferación y diferenciación
de las células formadoras de tejido duro, y la liberación de OH aumenta la alcalinidad del entorno que
soporta la reparación del tejido duro y la calcificación activa (1, 2). El Ca2 + liberado de los cementos de
reparación endodóntica estimula la expresión de genes asociados a la mineralización, como la proteína
morfogenética ósea 2, el colágeno 1 y la osteocalcina (3–5). La liberación de altas concentraciones de
Ca2 + desde el cemento de reparación en el sitio pulpar activa la migración de pre-odontoblastos
ubicados en la pulpa central (6, 7). El Ca2 + liberado de los cementos de reparación puede servir como
una señal bioactiva que promueve el proceso de reparación de tejidos basados en células. Sin embargo,
el alto pH del hidróxido de calcio puede no ser óptimo para los mecanismos de reparación basados en
células, y la modificación de los cementos para mejorar sus propiedades físicas y biológicas muestra
resultados prometedores (2).

De la Escuela Dental de Melbourne, Salud Oral, CRC, Instituto Bio21, Universidad de Melbourne,
Melbourne, Australia.

Dirigir las solicitudes de reimpresión al profesor Eric. C. Reynolds, Melbourne Dental School, Salud Oral,
CRC, Instituto Bio21, Universidad de Melbourne, Melbourne, Victoria

3010, Australia. Dirección de correo electrónico: e.reynolds@unimelb.edu.au

0099-2399 / $ - ver material frontal

Copyright ª 2017 Asociación Americana de Endodoncia.

https://doi.org/10.1016/j.joen.2017.11.005

La caseína fosfopéptido-fosfato de calcio amorfo (CPP-ACP) es un complejo de Ca2 + y de ion fosfato

(Pi) estabilizado con fosfopéptidos que proporciona Ca2 + biodisponible a pH neutro y promueve la
remineralización del esmalte y la dentina (8). Una versión que contiene flúor (fosfato de fluoruro de
calcio amorfo-caseína [CPP-ACFP]) tiene una eficacia remineralizante superior en comparación con
CPP-ACP (9).

In vitro, el CPP enriquecido con calcio indujo la captación de Ca2 + por las células de tipo osteoblasto,
promovió la diferenciación osteoblástica, aumentó el nivel y la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) y
aumentó la formación de nódulos calcificados (10, 11). Por lo tanto, el CPPACP puede desempeñar un
papel en la promoción de la osteogénesis y la calcificación. Además, se ha demostrado que la adición
de CPP-ACP a los cementos a base de silicato de calcio mejora la liberación iónica (1); por lo tanto, el
CPP-ACP agregado a estos materiales puede ayudar a promover la reparación del tejido dental duro.

De la Escuela Dental de Melbourne, Salud Oral, CRC, Instituto Bio21, Universidad de Melbourne,
Melbourne, Australia.

Dirigir las solicitudes de reimpresión al profesor Eric. C. Reynolds, Melbourne Dental School, Salud Oral,
CRC, Instituto Bio21, Universidad de Melbourne, Melbourne, Victoria

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Figure 1 Effectof CPP-ACPFon productionof ALP activityby theosteoblast-like
cell linesMG-63and MC3T3-E1. CPP-ACP, CPP-ACFP.*Denotessig
nificantdifferences
. ( P < .05) comparedwithcontrols( cells in mediumalone).OD, opticaldensity.
Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron examinar los efectos de CPP-ACP y CPP-
ACFP en líneas celulares de tipo osteoblasto y tipo fibroblasto para evaluar la
biocompatibilidad y el potencial osteogénico / calcificación

Materiales y métodos Cultivo de células Líneas celulares tipo osteoblasto humano (MG-63) y
ratón (MC3T3-E1) (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia) y líneas celulares tipo
fibroblasto humano (HGF1) y ratón (NIH3T3) (ATCC, Manassas, VIRGINIA)

medio fecundado completo completo de phaminimum (a-MEM completo), compuesto de a-MEM

suplementado con 10% v / v de suero de ternera fetal, 1 U / mL de penicilina, 0.1 mg / mL de
estreptomicina, 1 mmol / L de piruvato de sodio y 2 mmol / L L-glutamina (Sigma-Aldrich). Para el
ensayo de mineralización, el a-MEM completo se complementó con 10 mmol / L de glicerofosfato y 50
mg / ml de ácido ascórbico (Sigma-Aldrich) como medio osteogénico. Las células se mantuvieron en un
incubador Heracell150 humidificado (ThermoFisherScientific, Lombard, IL) a 37 ° C y 5% v / v CO2.

Preparación de la solución CPP-ACP y CPP-ACFP.

Los polvos solubles de CPP-ACP y CPP-ACFP (9) se mezclaron con a-MEM completo mediante agitación
magnética durante 24 horas y se esterilizaron a través de un filtro de 0,22 mm (Corning Incorporated
Life Sciences, Bedford, MA). Se prepararon soluciones madre de 3,0% p / v de CPP-ACP y 3,0% p / v de
CPP-ACFP y se diluyeron en serie hasta 7 concentraciones (0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,7%, 1,5% y 3,0%).
Virginia Occidental).

Proliferación celular y ensayos de citotoxicidad celular

La proliferación celular y la citotoxicidad celular se evaluaron mediante el uso de un kit de ensayo de

metil-tiazol-tetrazolio (Ensayo de proliferación de células no radiactivas acuosas CellTiter 96) y un kit de
ensayo de lactato deshidrogenasa (Ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96), respectivamente,
según las instrucciones del fabricante ( Promega Corporation, Fitchburg, WI).

Actividad ALP

Las líneas celulares MG-63 y MC3T3-E1 se subcultivaron en placas de cultivo de 24 pocillos con a-MEM
completo (5 104 células / pocillo en 1 ml). Después de 24 horas, el medio de cultivo se reemplazó con 1
ml (por pocillo) de diferentes concentraciones de medio modificado con CPP-ACP y CPP-ACFP y se
incubó durante 1, 2 y 3 días. Conjuntos separados de celdas para los diferentes grupos que se usaron
para cada intervalo de tiempo. Se utilizaron cultivos celulares con aMEM completo solo como
controles. Al final de cada período de incubación, las células se lavaron con solución salina tamponada
con fosfato (PBS) (Sigma-Aldrich), se agregaron 100 ml de tampón de lisis (2,5% v / v Triton X-114;
Sigma-Aldrich) a cada pocillo. , y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El
 lisado celular (100 ml) se mezcló con 150 ml de QuantiBluesolution y se midió colorimétricamente la
ALPactivity de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invivogen, San Diego, CA). Se midieron seis
muestras repetidas para cada grupo.

Medición de la producción de citocinas

Para medir la producción de interleucina (IL) -1a (IL-1a) e IL-6 humana y de ratón, se subcultivaron
células MG-63, MC3T3-E1, HGF-1 y NIH3T3 en placas de cultivo de 24 pocillos con a-MEM completo. (5
104 células / pocillo en 1 mL). Después de 24 horas, el medio de cultivo se reemplazó con 1 ml (por
pocillo) de las diferentes concentraciones de medio modificado con CPP-ACP y CPP-ACFP, y las células
se incubaron durante 3 días. Las células cultivadas en medio solo fueron el control negativo, y las
células cultivadas en medio con 20 ng / ml de lipopolisacárido de Escherichia coli (Invitrogen, San
Diego, CA) fueron el control positivo. Al final del período de incubación, el sobrenadante se recogió y
almacenó a –80 ° C hasta su uso. Los niveles de IL-1a e IL-6 en el sobrenadante se midieron mediante el

Figure 2. Effectof CPP-ACPFon productionof theosteotropiccytokineIL-6 by theosteoblast-like

cell lines( MG-6 andMC3T3-E1)andfibroblast-like
cell lines
( HGF-1 and NIH3T3). CPP-ACP, CPP-ACFP.Positivecontrolrepresentscells exposedto E. coli lipopolysaccharide. *Denotessignificantdifferences
( P < .05) comparedwithnegativecontrol( cells in mediumalone).
uso de un kit de ensayo de inmunoabsorción (ELISA, por sus siglas en inglés, IL-1a) humano (Abcam
Australia Pty Ltd, Victoria, VIC, Australia) e IL-6 humano, ratón. IL-1a, y los kits ELISA de ratón IL-6
(eBioscience, San Diego, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se analizaron seis
muestras repetidas para cada grupo.

Mediciones de mineralización
Para evaluar el papel de CPP-ACP y CPP-ACFP en la promoción de la mineralización por osteoblastos, se
indujo la mineralización en las placas de cultivo de 6 pocillos MG-63 y CM3T3-E1 confluentes por medio
de células estereoscópicas. Después de 48 horas, el medio de cultivo se reemplazó con 4 ml / pocillo de
medio CPPACP o CPP-ACFP (1,5% p / v y 3,0% p / v CPP-ACP y 1,5% p / v y 3,0% p / v CPP- Las
soluciones de ACFP se probaron y las células se incubaron durante 14 días. Las células cultivadas con
medio osteogénico solo fueron el control. Después de 14 días, los medios se recolectaron y
almacenaron a –80 ° C hasta que se usaron para la detección de proteínas asociadas a la mineralización
mediante inmunotransferencia y para la cuantificación de la mineralización utilizando el método de
tinción con rojo de alizarina (Sigma-Aldrich) descrito anteriormente (12).

Las proteínas asociadas a la mineralización, el colágeno tipo 1 (Col 1), la osteocalcina (OC) y la
osteopontina (OP) se identificaron en medios recolectados mediante inmunotransferencia utilizando
técnicas estándar. Se prepararon muestras con cantidades iguales de proteína (40 mg) medidas
utilizando el método Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) utilizando 4 tampones de muestra de dodecil
sulfato de litio (Invitrogen) y se sometieron a electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y
poliacrilamida en NuPAGE MOPS SDS en funcionamiento tampón (Life Technologies, Camarillo, CA) a
200 V mediante el uso de NuPAGE 4-12% de geles Bis-Tris (Life Technologies). Luego las proteínas se
transfirieron (a 42 voltios durante 1 hora) en un tampón de transferencia NuPAGE (Life Technologies) a
una membrana de nitrocelulosa (PROTRAN; PerkinElmer, Waltham, MA). La membrana se bloqueó con
leche desnatada al 5% p / v en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavó con PBS y se
incubó durante la noche a 4 ° C con anticuerpo primario (anti-colágeno de conejo tipo 1, anti-
osteocalcina de conejo o anti-conejo). osteopontina; Abcam Australia Pty Ltd). Luego se lavó la
membrana 3 veces con 0,1% v / v de Tween-20 en PBS (PBST) con agitación suave durante 15 minutos
para cada lavado, seguido de un lavado final con PBS solo. Después de la incubación durante la noche a
4 ° C con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano con inmunoglobulina G de conejo
(Sigma-Aldrich), la membrana se lavó 3 veces en PBST (15 minutos para cada lavado) y 1 lavado en PBS.
Las proteínas se detectaron mediante el uso del reactivo de quimioluminiscencia Immobilon (Millipore
Corporation, Billerica, MA) y la cámara de imágenes FUJIFILM LAS-300 (FUJIFILM; Berthold Australia Pty
Ltd).

Para cuantificar las proteínas, se realizó densitometría utilizando ImageJ 1.50e (Wayne Rasband;
Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD).

Análisis estadístico

Los datos se analizaron utilizando SPSS versión 11.5.0 (SPSS Inc, Chicago, IL). La prueba de Kolmogorov-
Smirnov indicó que los datos se distribuyeron normalmente y, por lo tanto, se realizaron pruebas
estadísticas paramétricas (análisis de varianza, seguido de la prueba de Tukey para comparaciones
múltiples). El nivel de significación se estableció en p <0,05.

Resultados

Proliferación celular, citotoxicidad celular y actividad ALP

Para las líneas celulares y las concentraciones de CPP-ACP y CPP-ACFP analizadas, no se pudo detectar
un efecto significativo sobre la proliferación o toxicidad celular. Para ambas líneas celulares de tipo
osteoblasto, CPP-ACP y CPP-ACFP aumentaron la actividad de ALP en una respuesta relacionada con la
dosis con máximos de 2 veces en las concentraciones de CPP-ACP / CPP-ACFP de 0.1% -1.5% p / v (Fig.
1). CPP-

El CPPACFP tuvo un efecto significativo en la producción de IL-6 (Fig. 2).

La secreción de IL-6 de las líneas celulares similares a osteoblastos aumentó significativamente (P <.05)
de una manera dependiente de la dosis cuando se incubó con 0.1% –3.0% p / v de CPP-ACP y 0.05% –
3.0% w / v Medios de CPP-ACFP en comparación con el control negativo (Fig. 2). Este efecto fue
significativamente mayor para CPP-ACFP en comparación con CPPACP. Para las 2 líneas celulares
similares a fibroblastos, ni CPP-ACP ni CPPACFP tuvieron ningún efecto significativo en la producción de
IL-6 (Fig. 2).

Mineralización y proteínas relacionadas con la mineralización.

Las concentraciones de tinción de alizarina roja extraídas de células MG-63 similares a osteoblastos
tratadas con medios osteogénicos modificados con CPP-ACFP fueron significativamente más altas (P
<.05) que las concentraciones de tinción extraídas de células similares cultivadas en el control y CPP-
ACP - medios osteogénicos modificados (fig. 3). Las células MC3T3-E1 cultivadas en el CPPACFP– y el
1,5% p / v de medios osteogénicos modificados con CPP-ACP exhibieron concentraciones de tinción
significativamente más altas en comparación con el control (p <0,05). Células MC3T3-E1 cultivadas en

el 3.0% p / v CPP-ACFP – modificadas

Figura 4. (A) Secreción de proteínas relacionadas con la mineralización (Col I, OP y OC) de células
similares a osteoblastos humanos y de ratón después de la exposición a medios osteogénicos
modificados con CPP-ACP y CPP-ACFP. (B) Porcentaje de proteínas relacionadas con la mineralización
(en relación con el control) secretadas por células similares a osteoblastos humanos y de ratón después
de la exposición a medios osteogénicos modificados con CPP-ACP y CPP-ACFP. Control, 1.5% CPP-ACP,
3% CPP-ACP, 1.5% CPP-ACFP,

Discusión

Los cementos a base de silicato de calcio tienen una amplia aplicación en endodoncia contemporánea,
incluyendo apexificación, reparación de perforaciones, terapia de pulpa vital y procedimientos de
ortodoncia regenerativos. Sin embargo, la investigación continúa para mejorar tanto las propiedades
de manejo como la eficacia biológica (2). El presente estudio introduce un medio para mejorar aún más
las propiedades biológicas y tiene una amplia relevancia clínica en la terapia endodóntica, como lo
demuestra el uso de líneas celulares tanto humanas como de ratón.

CPP-ACP y CPP-ACFP no fueron citotóxicos en las concentraciones probadas y no cambiaron

significativamente la proliferación de las líneas celulares similares a fibroblastos y osteoblastos, lo que
confirma la biocompatibilidad de estos complejos iónicos estabilizados con fosfopéptidos. CPP-ACP es
generalmente

Reconocido como certificado de seguridad, y estudios anteriores han indicado que el material es
biocompatible (10, 13). El aumento de la actividad de ALP (un marcador de diferenciación
osteoblástica) relacionado con la dosis de CPP-ACP y de ACPP expresado por la línea celular de tipo
osteoblasto se correlacionó con el aumento de la expresión de la citoquina osteotrópica IL-6, Col 1 y
OC, así como el aumento de la deposición de minerales atribuible a la adición de CPP-ACP / CPP-ACFP.
La ALP es una fosfomonoesterasa inespecífica y desempeña un papel en la mineralización hidrolizando
los ésteres de fosfato en un rango de moléculas para liberar fosfato inorgánico (14). Los CPP contienen
5–7 residuos de fosfoserilo que son fosfoésteres y son esenciales para la estabilización de su carga de
iones de calcio y fosfato en los nanoclusters de ion ACP (8, 15). La ALP hidrolizará los residuos de
fosfoserilo de la CPP, que desestabilizará los nanoclusters de ACP, lo que resultará en la calcificación
por la precipitación de hidroxiapatita o en presencia de iones fluoruro, fluorapatita o
fluorhidroxiapatita.

Este proceso es consistente con el aumento de la mineralización observada en las líneas celulares
similares a los osteoblastos en la adición de CPP-ACP / CPP-ACFP en este estudio. Estos resultados
también son consistentes con una investigación previa que demuestra un aumento en la actividad de
ALP y la presencia de nódulos calcificados en células similares a osteoblastos humanos tratadas con
CPP-Ca (10). Se ha demostrado que los CPP no solo estabilizan los iones de calcio y fosfato
biodisponibles (8, 15) sino que también inducen la captación de Ca2 + y la diferenciación celular (10,
11, 16). Además, el Ca2 + es un regulador eficiente de varias actividades celulares como la
mineralización y la expresión de OC y colágeno (5, 17–19). Por lo tanto, es posible que muchos de los
efectos celulares de CPP-ACP y CPP-ACFP puedan explicarse por el aumento significativo en la
concentración de Ca2 + biodisponible.

Para investigar la diferenciación de las células MG-63 y MC3T3 similares a osteoblastos en osteoblastos
maduros, las células se cultivaron durante 14 días en medios osteogénicos con o sin CPP-ACP o CPP-
ACFP. En general, la exposición de las células MG-63 y MC3T3-E1 a CPP-ACP / CPP-ACFP aumentó la
expresión de Col 1 y OC y disminuyó la expresión de OP. El col 1 es un factor importante para el
desarrollo de un fenotipo osteoblástico maduro, es decir, la diferenciación y la mineralización, y es el
producto predominante de los osteoblastos, que representa el 95% de la matriz ósea no mineral
extracelular (20, 21). La expresión de OC, una proteína específica para el hueso y un marcador de
maduración osteogénica, se produce después del inicio de la actividad de ALP y acompaña a la
formación de tejido mineralizado (22, 23). Col 1, junto con OC, contribuye al inicio de la nucleación y el
ensamblaje jerárquico de apatita dentro del andamio de colágeno, un proceso crítico en la formación
de hueso (24). El aumento en la mineralización y el aumento de la expresión de Col 1 y OC por la
exposición de células similares a osteoblastos a CPP-ACP / CPP-ACFP observado en este estudio son
consistentes con este mecanismo propuesto de iniciación de la mineralización. La OP no se detecta con
formación ósea, ya que su síntesis es muy cercana.

Asociado a la iniciación y mediación de la resorción ósea (25). OP, un fuerte inhibidor del proceso de
mineralización, tiene la capacidad de unirse a los cristales de apatita, lo que inhibe su crecimiento (26).
Como tal, la disminución en la expresión de OP y el aumento de Col 1 y OC que se muestra en este
estudio apoyan a CPP-ACP y CPP-ACFP que favorecen la formación ósea.

Las citoquinas IL-1 son responsables de la producción de inflamación estéril (27). Sin embargo, no hubo
pruebas de que la CPP-ACP o la CPP-ACFP desencadenaran una respuesta inflamatoria en las líneas
celulares tipo osteoblasto y tipo fibroblasto, porque no se pudo detectar IL-1a. Esto es consistente con
la biocompatibilidad conocida de estos nanocomplejos. La producción de IL-6 por las líneas celulares de
tipo osteoblasto se incrementó significativamente por incubación con medios de CPP-ACP y CPP-ACFP.
Aunque se cree que la IL-6 es un factor osteolítico (28), tiene un papel importante en la diferenciación
osteoblástica al aumentar la actividad de ALP (29, 30). La IL-6 es producida por osteoblastos
estimulados por factores de crecimiento, y tiene un papel importante en la formación y el
reclutamiento de osteoclastos para la remodelación ósea reparadora y fisiológica (31, 32). La IL-6
también desempeña un papel en la formación de osteoblastos en situaciones de alto recambio óseo
(33). Se ha informado que la CPP enriquecida con calcio actúa como un modulador del sistema
inmunitario intestinal, lo que desencadena la secreción de citoquinas como la IL-6, atribuida a los
niveles elevados de Ca2 + (34, 35). Por lo tanto, en conjunto, la explicación más probable para los
presentes hallazgos es que CPP-ACP y CPP-ACFP proporcionaron una concentración de Ca2 +
biodisponible elevada que desencadenó la producción de IL-6, induciendo posteriormente la actividad
de ALP, diferenciación osteoblástica y mineralización. Las diferencias entre CPP-ACP y CPP-ACFP en la
inducción de la mineralización y la secreción de IL-6, Col 1 y OC pueden atribuirse al potencial de
mineralización superior de CPP-ACFP (9).
Conclusión

Tanto CPP-ACP como CPP-ACFP son biocompatibles con el potencial de inducir la diferenciación
osteoblástica y la calcificación / mineralización. Estos hallazgos pueden apoyar el uso de estos
materiales como aditivos bioactivos para cementos endodónticos para promover la regeneración de
tejidos duros, así como una barrera de calcificación en la terapia de pulpa vital. Se indican
investigaciones adicionales para comparar directamente los materiales a base de silicato de calcio con
y sin la adición de CPP-ACP o CPP-ACFP.

Expresiones de gratitud

Esta investigación fue apoyada por el gobierno australiano, el Departamento de Industria, Innovación y
Ciencia otorgó el subsidio 20080108. Los autores niegan cualquier conflicto de interés relacionado con
este estudio.

Referencias

1. Dawood AE, Manton DJ, Parashos P, et al. Las propiedades físicas y la liberación de iones de los
cementos a base de silicato de calcio modificados con CPP-ACP. Aust Dent J 2015; 60: 434–44.