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THE GENERATION OF DIVERSITY 

The ability of the immune system to recognize antigens depends on the antibodies 
generated by B cells, and on the antigen receptors expressed by T cells.
­despite the differences of TCR and Abs the molecular and cellular processes which 
generate diversity are very similar for each molecule
­this topic will discuss the ways in which the great diversity of Abs and TCRs are 
generated
­we produce more types of antibody than there are genes in our genome

IMMUNOGLOBULIN VARIABILITY
Mechanisms involved in generation of antibody diversity:
1. Multiple Genes­ there is a large number of separate genes (V1­Vn), each encoding one 
V region domain
2. Somatic mutation­ a V gene mutates to produce different B cell clones
3. Somatic recombination­ a number of gene fragments (J1­Jn) recombine to join the 
main part of V region gene ­ this results in a protein that contains elements encoded by 
different gene segments

IMMUNOGLOBULIN GENE RECOMBINATION
­The and light chains, as well as the heavy chains are encoded by separate multigene 
families situated on different chromosomes.
­in germ line DNA each of these multigene families contains coding sequences, called 
gene segments, separated by non­coding regions
­during B cell maturation, these genes are brought together to form functional 
immunoglobulin genes.
­the  and chain families contain V, J, and C gene segments; the rearranged VJ 
segments encode the variable region of the light chains.
­the heavy chain families contain V, D, J and C gene segments; the rearranged VDJ 
gene segments encode the variable region of the heavy chain
-the C gene segments encode the constant regions
­each V gene segment is preceded by a short signal or leader peptide that guides the 
heavy or light chain through the endoplasmic reticulum; the signal peptide is cleaved 
from the nascent heavy and light chain before assembly of the finished Ig molecule
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Light chain genes recombine V and J segments to make a gene for the V domain
­Two separate gene segments were found to code for the V and C regions and in the 
germ line (cells that are not producing Ab), these two gene segments were found to be 
far apart on the chromosomes.
­in contrast, in Ab­producing cells the gene segments were brought closer together
­The V and C fragments do not directly join but are separated by a joining gene segment, 
the J segment

 Structure of the  
  chain system­ The V gene segment codes for the V region of the Ab 
light chain, up to amino acid 95; the J gene segment codes for the rest of the variable 
region 
­in the mouse, there are 3 V segments, 4 J gene segments and 4 C gene segments

 Structure of the 
  chain system ­ this multigene family contains approximately 300 V 
gene segments, 5 J gene segments and 1 C gene segment (Fig.)

Heavy chain genes recombine V, D and J segments to make a gene for the VH 
domain
The heavy chain region is also encoded by V and J segments; additional diversity is 
provided by a third gene segment, the D (diversity) gene segment (Fig)
­the D gene segments encode for amino acids within the complementarity determining 
region (CDR3)
­in mouse, there are over 1000 VH gene segments, 30 D gene segments, 6 functional JH 
gene segments followed by a series of CH gene segments
­each CH gene segment encodes the constant region of the Ig­heavy chain isotype

Recombination sequences flanking the V, D and J gene segments direct joining of 
the gene segments
­recombination of gene segments is a key feature of the generation of a functional gene 
for both the light and heavy chain variable regions
­Unique recombinational signal sequences (RSSs) flank each germ line V, D, and J 
gene segment; signal for recombination process
­one RSS is located 3' to each V gene segment, 5' of each J gene segment and on both 
sides of each D gene segment.
­each RSS contains a conserved palindromic heptamer and a conserved AT­rich nonamer 
sequence separated by an intervening  sequence of 12 or 23 base pairs (Fig,)
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­the 12 and 23 base pair sequence correspond respectively, to one and two turns of the 
DNA helix; for this reason they are referred to as one­turn signal sequences and two­
turn signal sequences
­signal sequences having a one­turn spacer can only join with sequences having a two­
turn spacer (this is the one­turn/two­turn joining rule)
­a two turn spacer occurs in the signal sequence of the VH and JH gene segments, and a 
one turn spacer occurs in the signals on either side of the DH gene segment; this joining 
rule ensures that the VH, JH, and DH gene segments join in a proper order and that
segments of the same type do not join with each other
­V­D­J recombination which takes place at the junctions between the RSSs and coding 
sequences is catalyzed by enzymes collectively referred to as V(D)J recombinase 
­two enzymes which are required in V­D­J recombination are RAG­1 and RAG­2 
proteins and the enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)
­mice that are RAG­1 and RAG­2 deficient have a defect in V­D­J recombination and 
cannot generate functional B or T cells; these mice are called SCID mice (severe 
combined immunodeficiency)

The place at which V and J segment genes join may vary slightly
­slight variations in the positions at which recombination takes place generates additional 
diversity.
­ie. the 95 th AA is encoded by the last codon of the V segment; 
 the 96 th AA is encoded by the first codon of the J segment (Fig.)
Sometimes, the 96 th AA is encoded in part by bases of the intron that is 3' to the V 
segment and in part by bases of the first codon of the J segment
­this will lead to variation in AA sequence 

­ in addition, a few nucleotides may be inserted between the VH and D and between the 
D and JH segments by means of the enzyme TdT (Fig)
­because addition occurs without a need for a coding template these nucleotides are 
called N­nucleotides (for non­template) and it is called N­region diversity 

SOMATIC MUTATION
Once the variable region has been rearranged, additional diversity can be generated by 
somatic hypermutation
­individual nucleotides are replaced with alternative nucleotides thus altering the 
specificity of the encoded Ig; this only occurs after exposure to antigen
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­somatic mutation is targeted to the V region segments and occurs at a frequency of 10­3 
per base pair per generation (1 in every 1000 base pairs is mutated, this is much higher 
than the spontaneous mutation rate of 1 in 109 bases) thus it is called hypermutation
­somatic mutation is random, and will generate Abs with varying affinity for antigen
­following exposure to antigen, B cells with higher affinity receptors will be 
preferentially selected because of their greater ability to bind antigen

­Additional diversity is generated as virtually any light chain may pair with any 
heavy chain

To summarize:
Five mechanisms for the generation of antibody diversity:
1. multiple germ line V genes
2. V­J and V­D­J recombination
3. recombinational inaccuracies
4. somatic point mutations
5. assorted heavy and light chains

CLASS SWITCH
- initially mature B cells express both IgM and IgD; How? a single mRNA consisting of
VDJ CμCδ is initially transcribed; then through alternate splicing results in
separate VDJ Cμ and VDJ Cδ mRNAs
­following stimulation of a B cell, the heavy­chain DNA can undergo a further 
rearrangement in which  the V D J unit of the heavy chain can combine with any CH 
gene segment
­the exact mechanism of this process called class switching is unclear
­it appears that there are DNA flanking sequences (switch sites, S) located upstream of 
each CH segment (except C)  that may be involved 
-“Switch recombinase” is the enzyme that catalyzes the rearrangement of the VDJ
genes during class switching; Gene recombination is a proposed mechanism
­ recombination occurs between the switch sites, bringing the C region close to the VDJ

The control of class switching is dependent on at least two factors:

1. the concentration of various interleukins. For example, IL-4 enhances the


production of IgE and IgG1, whereas IL-5 increases IgA
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2. interaction of the CD40 protein on the B cell with CD40 ligand protein on the
helper T cell. For example, in hyper-IgM syndrome, the failure to interact properly
results in an inability of the B cell to switch to the production of IgG, IgA, or IgE.
Therefore, only IgM is made.

Note that once a B cell has “class” switched past a certain H chain gene, it can no
longer make that class of H chain because the intervening DNA is excised and
discarded. Class switching occurs only with heavy chains; light chains do not undergo
class switching

Allelic exclusion

A single B cell expresses only one L chain gene (either κ or λ) and one H chain gene. In
theory, a B cell could express two sets of immunoglobulin genes, a maternal set and a
paternal set. But this is not what happens. Only one set of genes is expressed, either
maternal or paternal, and the other set is silent (i.e., it is excluded). This is
called allelic exclusion. Successful rearrangement of the genetic material from one
chromosome results in the shutting down of rearrangement of genetic material from the
second chromosome
- If no successful rearrangement occurs, rearrangement of genetic material on the second
chromosome takes place. If no successful rearrangement occurs on either chromosome,
the cell dies.
Each individual contains a mixture of B cells, some expressing the paternal genes and
others the maternal ones. The mechanism of this exclusion is unknown although
methylation is thought to be the mechanism of silencing.

. Membrane and secreted Igs are produced by differential splicing of RNA 
transcripts of heavy genes
­the antigen receptor of the membrane bound and secreted Ig is identical except for an 
extra stretch of AAs at the C terminus of each heavy chain
­differential splicing gives rise to each form of Ig 

STAGES OF IMMUNOGLOBULIN PRODUCTION
1. heavy chain rearrangement of D to J
2. addition of V gene segment
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3. transcription of VDJ­
4. translation produces membrane  and  chains
5. the  chain induces recombination of the light chain V­J 
6. transcription of VJ­ or VJ­ 
7. translation of  and 
8. both membrane IgM and IgD are present on the B cell
9. after primary antigen stimulation, the cell produces secreted IgM
10. after stimulation with a T­dependent antigen and with T cell help (cytokines), the cell 
can switch classes to produce either IgG, IgA, or IgE which is accompanied by somatic 
mutation of the V domains

GENES OF THE TCR
The TCR is generated by 4 sets of genes; the  and  expressed mainly in peripheral T 
cells, and the  and  expressed in a minor population of peripheral T cells
­arrangement of TCR genes is remarkably similar to the Ig heavy chains having V, D, J, 
and C gene segments

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