Entre los sustratos sobre los que actúa, el más
Curva tipo de azúcares reductores. significativo es la sacarosa, de ahí que la enzima se
Efecto de la concentración de enzima
sobre la velocidad de reacción y Efecto
del pH sobre la velocidad de reacción.
Introducción
Marco teórico
Velocidad instantánea: La velocidad física de un
cuerpo en un punto o velocidad instantánea es la que
tiene el cuerpo en un instante específico, en un punto
determinado de su trayectoria. Se define la velocidad
instantánea o simplemente velocidad como el límite de
la velocidad media cuando el intervalo de tiempo
considerado tiende a 0.
Enzima: Las enzimas son proteínas que catalizan
reacciones químicas en los seres vivos. Los enzimas
son catalizadores, es decir, sustancias que, sin
consumirse en una reacción, aumentan notablemente su
velocidad.
Sustrato: En bioquímica, un sustrato es una molécula
sobre la cual actúa una enzima. Las enzimas catalizan
reacciones químicas que involucran sustrato(s). El
sustrato se une al sitio activo de la enzima, y se forma
un complejo enzima-sustrato. Por acción de la enzima,
el sustrato se transforma en producto, se libera del sitio
activo y queda libre para recibir otro sustrato.
Azúcar reductor: Los azúcares reductores son aquellos
azúcares que poseen su grupo carbonilo (grupo
funcional) intacto, y que a través del mismo pueden
reaccionar como reductores con otras moléculas que
actuarán como oxidantes. Esta propiedad permite
determinar la concentración de una disolución de azúcar
midiendo la cantidad de agente oxidante que es
reducido.
Absorbancia: Se trata de la medida que refleja cómo se
atenúa la radiación cuando atraviesa un elemento. La
absorbancia puede expresarse mediante un logaritmo
que surge a partir del vínculo entre la intensidad que
sale y la intensidad que ingresa a la sustancia.
Invertasa: conocida también con el nombre de
sacarasa, es una enzima que cataliza la hidrólisis de los
terminales no reductores β-d-fructofuranosílicos de los
fructofuranósidos, rompiendo el enlace β-d
fructofuranosil.
conozca también, como ya se ha señalado, con el
nombre de sacarasa. Esta enzima hidroliza la fructosa y
la glucosa mediante la siguiente reacción reversible:
Sacarosa ↔ Fructosa + Glucosa
Azúcares invertidos
Estos glúcidos, además de ser ampliamente utilizados
en la industria alimentaria, son fuentes principales de
carbono y energía para organismos procariontes y
eucariontes.
El nombre de invertasa hace referencia a que los
productos de la reacción son conocidos como "azúcares
invertidos" debido al cambio rotacional que modifica sus
propiedades ópticas; de una rotación positiva o
dextrógira a una rotación negativa o levógira:
Sacarosa ([α] D = + 66,5º) + H₂O → D-glucosa ([α] D = +
52,5º) + D-fructosa ([α] D = -92º)
Método DNS
Es una técnica que emplea ácido 3,5 dinitrosalicilico
para la hidrólisis de polisacáridos presentes en una
muestra; trabaja basándose en los valores de
espectrofotométricos arrojados por una serie de
diluciones.
Permite cuantificar los productos de una reacción
enzimática y así poder observar La cinética enzimática.
La curva de calibración (gráfica) se construye de la
siguiente manera: Absorbancias (Eje de ordenadas: Y).
y Concentración (Eje de abscisas: X).
Se ensaya una serie de diluciones de concentración
conocida y se determinan sus absorbancias con ayuda
del espectrofotómetro calibrado a 540 nm,
construyéndose así la curva de calibrado, que
teóricamente debe comportarse como una recta.
La concentración de una solución problema
(desconocida), se puede averiguar por interpolación de
la absorbancia de la solución en la curva de calibración.
El DNS reacciona únicamente con los azucares
reductores. La sacarosa es un disacárido no reductor,
pero tras su hidrólisis en medio ácido se liberan glucosa
y fructosa que sí son reductores y reaccionan con el
DNS generando un producto coloreado.
Esta técnica es aplicable a todos los procedimientos de
sistemas de cultivos de medios líquidos y sólidos cuya
molécula de sustrato sean azúcares reductores como
glucosa, xilosa, entre otros. También es aplicable en
fermentaciones para determinar la presencia de
azucares reductores que generan hongos o bacterias
por unidad de tiempo.
Reacción:
Efecto de la concentración de enzima sobre la
velocidad de reacción
La actividad catalítica de un enzima se determina
midiendo la velocidad inicial de reacción, que es la
pendiente de la curva de progreso (curva de producto
formado ó sustrato transformado frente al tiempo) en el
tiempo cero (Fig. 1). Inicialmente, las reacciones
transcurren linealmente, pudiéndose tomar la pendiente
de esta recta como velocidad inicial. A tiempos más
largos, el progreso de la reacción se aparta de la
linealidad. Esta caída de la velocidad de reacción se
debe a la disminución significativa de la concentración
de sustrato
Figura 1. Curva de progreso de una reacción
enzimática. Obsérvese cómo, inicialmente, se produce
una disminución de sustrato, o aparición de producto,
que es lineal con el tiempo.
Bajo condiciones dadas, dos moléculas de enzima
actúan independientemente en solución para
transformar el doble de sustrato que una sola molécula
de enzima en un tiempo “t”, la velocidad es, por lo tanto
directamente proporcional a la concentración de la
enzima, lo que se expresa como:
V0 = K [E]
Efecto del pH sobre la velocidad de reacción.
La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al
cual se lleva a cabo la reacción. La curva actividad-pH
puede ser diferente para cada tipo de enzima (Fig. 2).
En el caso más general la curva tiene forma de
campana. El valor de pH al cual la actividad es máxima
se denomina pH óptimo; dicho pH no tiene porqué
coincidir con el pH intracelular. La relación entre el pH y
la actividad depende del comportamiento ácido-base
del enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima
(centro activo) pueden contener grupos funcionales
ácidos y básicos, siendo su grado de disociación
dependiente del pH, lo que determinará, entre otros
aspectos, la conformación de la proteína, la capacidad
de unión del sustrato al centro activo del enzima (Km) y
la capacidad de transformación del sustrato (kcat). Los
estudios cinéticos a diferentes valores de pH nos
proporcionan información sobre el mecanismo
catalítico de los enzimas y la naturaleza de los
aminoácidos más directamente implicados en la
catálisis.
 Resultados y Discusión

1.- Curva tipo de azúcares reductores

Tubo # Blanc Problemas

o
T 1 2 3 4 5
GLU 0.005 0 0.1 0.2 0.4 0.8 1
M FRU
0.005 (mL)
SAC 0.2 M 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
(mL)
REG de 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Acetatos
Figura 2. Efecto del pH sobre la actividad de diversos 0.05 M, pH
47 (mL)
enzimas. Agua (mL) 1 0.9 0.8 0.6 0.2 0
3,5 DNS 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Objetivos de la práctica (mL)
Desarrollo 5 minutos a 92 °C (en baño maría)
-Basándose en la experimentación, comprender el de color
conocimiento de los parámetros que afectan la Dilución Colocar en baño con hielo y diluir
velocidad enzimática de una reacción. con 2mL de agua destilada
Leer en espectrofotómetro a 540 nm.
-Analizar la velocidad con cada diferente parámetro de Absorbanci 0.12 0.14 0.61 1.10 1.24
a 3 4 1 4 7
cada experimentación.
Azúcar 0 1 2 4 8 10
reductor
(µmoles) /
2.0 mL
Cálculos Azúcar reductor (µmoles) / 2.0 mL

Para tubo 1

0.01mol ----- 1000 mL

x ---------------- 0.1 mL x=1x10-6= 1µmol/mL

Para tubo 2

0.01mol ----- 1000 mL

x ---------------- 0.2 mL x=2x10-6=2µmol/mL

Para tubo 3

0.01mol ----- 1000 mL

x ---------------- 0.4 mL x=4x10-6= 4µmol/mL

Para tubo 4

0.01mol ----- 1000 mL

x ---------------- 0.8 mL x=8x10-6= 8µmol/mL

Para tubo 5

0.01mol ----- 1000 mL

x ---------------- 1 mL x=1x10-5= 10µmol/mL

Para las velocidades: 2.- Efecto de la concentración de enzima
[𝐴. 𝑅. ] sobre la velocidad de reacción
𝑉𝑟 =
10 # Tubo Testigo Problemas
Tubo 1: 1/10= 0.1 µmol/min 1 2 3 4 5
0.5 0.5 0.5 0.5
SAC 0.2 0.5 0.5
Tubo 2: 2/10= 0.2 µmol/min M (mL)
0.5 0.5 0.5 0.5
Regulad 0.5 0.5
Tubo 3: 4/10= 0.4 µmol/min or 0.05 M
Tubo 4: 8/10= 0.8 µmol/min pH 4.7
(mL)
0.5 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
Tubo 5: 10/10= 1 µmol/min Agua
(mL)
Interpretación de gráfica Preincuba 5 min a temperatura ambiente
ción
A mayor concentración de azúcar reductor, mayor es la Enzima 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0-5
absorbancia que se puede leer a través del 10µg/mL
espectrofotómetro. (mL)
Incubaci 5 min a temperatura ambiente
Recordemos que con la ayuda del DNS podemos ón
obtener sustancias coloridas que nos indican la Inactivac 0.5 0.5 mL de DNS a cada tubo
concentración de azúcar reductor con base en su color a ión mL
través de la luz. de
DNS
+ 0.5
de
enzim
a
Desarroll 5 minutos a 92 ° C (en baño maría)
o de
color
Dilución Enfriar en baño de hielo y diluir con 2.0
mL de agua a cada tubo
Leer en un espectrofotómetro a 540 nm
Absorban 0 0.36 -0.4 1.498 1.452
cia
0.87
5
Azúcar 0 0.00 0.00 0.000 0.000
reductor 02 04 6 8 0.00
(µmoles) 1
Velocida 0 0.01 0.00 0.059 0.061
0.03
d (UI) 742 29 24 41
81
Concentrac 0 0.174 0.02 0.592 0.614
ión de
enzima
2 9 4 1 0.38
(µM/ 2 mL) 1

Cálculos Azúcar reductor, Velocidad y

Concentración de enzima.

Azucar reductor (µmol)

Para tubo 1

0.2mol ----- 1000 mL

x ---------------- 0.1 mL x=2x10-4= 1µmol/mL

Para tubo 2 Interpretación de gráfica

0.2mol ----- 1000 mL A mayor cantidad de enzima hay mayor cantidad de

azúcar reductor debido a que la sacarosa al ser
x ---------------- 0.2 mL x=0.0004 µmol afectada por la invertasa, nos da dos productos:
Para tubo 3 Fructuosa y Glucosa. Entonces entre más enzima le
agreguemos a nuestro tubo con sacarosa, más producto
0.2mol ----- 1000 mL tendremos.
x ---------------- 0.3 mL x=0.0006 µmol 3.- Efecto del pH sobre la velocidad de
Para tubo 4 reacción
0.2mol ----- 1000 mL # Tubo Testigo Problemas
1 2 3 4 5 6
x ---------------- 0.4 mL x=0.0008 µmol SAC 0.2 M 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
(mL)
Regulador pH= 5 pH= pH= 4 pH= pH 5 pH= pH=
Para tubo 5 de citratos 3 4.5 6.5 7.5
0.2 M (0.5
0.2mol ----- 1000 mL mL)
Agua (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
x ---------------- 0.5 mL x=0.001 µmol Preincubación 5 min a temperatura ambiente
Enzima 0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
10µg/mL
(mL)
Incubación 5 min a temperatura ambiente
Velocidad (U.I.)
Inactivación 0.5 0.5 mL de DNS a cada tubo
1 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑎𝑐𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 mL
𝑉=( )( ) DNS +
2 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑧ú𝑐𝑎𝑟 𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 (5𝑚𝑖𝑛) 0.5
enzim
a
Entonces Desarrollo 5 minutos a 92 ° C (en baño maría)
de color
Tubo 1 = 0.01742 Dilución Enfriar en baño de hielo y diluir con 2.0 mL de agua a cada
tubo
Tubo 2 = 0.0029 Leer en un espectrofotómetro a 540 nm
-
Tubo 3 = 0.05924 - -
Absorbancia 0 0.03 0.367 0.611 0.068
0.029 0.033
8
Tubo 4 = 0.06141 Azúcar
reductor 3.5 3.55 3.55 5.58 6.93 7.31
Tubo 5 =0.0381 93
(µmoles) 561 61 61 71 74
Concentración de enzima (µmol/2 mL) 0.3
Velocidad 556 0.35 0.35 0.55 0.69 0.73
Utilizando la ec. lineal tenemos que: (UI) 1 561 561 871 374 193
pH 5 3 4 4.5 5 6.5 7.5
Y=a+bx Donde a=0.0724 y b=2.482

Acomodando datos entonces: Cálculos azúcar reductor y velocidad

[E]= (A+0.0724)/2.482 Azúcar reductor
Por tanto: Usando la ec. de recta, despejando x tenemos que
Tubo 1= 0.174 X= (y-b)/m donde y= absorbancia b=-0.6426 m=0.1847
Tubo 2 = 0.029 Tubo 1 =3.5561
Tubo 3 =0.5924 Tubo 2 =3.5561
Tubo 4 = 0.6141 Tubo 3 =3.5561
Tubo 5 = 0.3810 Tubo 4 =5.5871

Tubo 5 = 6.9374

Tubo 6 =7.3193
Velocidad
[𝐴. 𝑅. ]
𝑉𝑟 =
10
Tenemos entonces:

Tubo 1 =0.35561

Tubo 2 =0.35561

Tubo 3 =0.35561

Tubo 4 =0.55871

Tubo 5 =0.69374

Tubo 6 = 0.73193

Interpretación de gráfica

pH óptimo: 5

A pH óptimo la concentración de azúcar reductor es

mayor que en cualquier otro pH.

Conclusión

La velocidad de reacción enzimática se puede ver

afectada por factores como el pH, la temperatura y la
concentración de enzima, los cuales nos dan diferentes
comportamientos que pueden ser comparados con la
curva tipo original.

Fuentes de consulta

Castellan. (1983). Fisicoquímica. México: Pearson.

M.M., L. L. (2015). Fundamentos de bioquímica. México:

Fotoletra.

McMurry. (2015). Química orgánica. México: CENGAGE.

Voet, D. (2016). Fundamentos de bioquímica. México:

Panamericana.