Laboratorio de Bioquímica, Diciembre 7 de 2105

Informe No.5

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Gutiérrez, Viany, 2111

Rodríguez E. Duván, 2111841

Resumen:
Se emplearon dos métodos para cuantificar una proteína, Albumina sérica bovina (BSA): el
método de Bradford y el método de Biuret, que mediante la preparación de una curva de
calibración sirvieron para determinar la concentración de BSA en una muestra desconocida
de la proteína.

Palabras claves: método de Bradford, método de Biuret, curva de calibración, Ley de

Lambert-Beer.

1. Introducción respuesta a diferentes concentraciones de

proteínas. Este compuesto inter acciona con
Cuando se quiere conocer la actividad específica
aminoácidos básicos (especialmente arginina) y
de una enzima o el contenido proteico de un
aromáticos. Esta unión del colorante con las
alimento, es necesario conocer cuantitativamente
proteínas provoca un cambio en el máximo de
la concentración de proteínas. Se han
absorción del colorante desde 465 a 595 nm. Por
desarrollado diferentes métodos que se basan en
lo tanto, este método se basa en la propiedad del
la formación de complejos entre las proteínas y
Azul Brillante de Coomassie G-250 de
reactivos específicos.
presentarse en dos formas con colores
El método de Bradford cuantifica la unión entre
diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte
un colorante y una proteína, y compara su señal a
en azul cuando el colorante se une a la proteína.
595nm con soluciones patrón de la misma. Otro
Experimentalmente se mide la diferencia de
método es la técnica de Biuret, que forma un
Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).
complejo violeta con la proteína, y compara su
El método tiene una sensibilidad de 1-15 μg.
señal a 545nm.
Método de Biuret
2. Marco teórico La reacción de Biuret es una reacción coloreada
(violeta) debida a la formación de un complejo de
Método de Bradford Cu en un medio alcalino en compuestos que
Está basado en el cambio de color del poseen más de un enlace peptídico, como las
colorante azul brillante de Coomassie en proteínas:

1
 Método de Biuret.
tubo Concentración(mg/ml) Absorbancia
Blanco 0 0,000
5 2,5 0,065
6 5,0 0,131
7 7,5 0,192
8 10 0,257
9 15 0,366
Figura 1. Complejo formado de Cu2+. 10 20 0,478
M. problema M2 5,80 0,150
Este método tiene una sensibilidad de 1000-10000
μg. Tabla 2. Datos espectrometricos obtenidos durante el ensayo de
Biuret

A partir de los datos de las tablas 1 y 2 se

3. Resultados y discusión
construyeron las gráficas de absorbancia en
Las tablas 1 y 2 muestran los datos función de la concentración con el fin de hallar la
espectrometricos obtenidos luego de aplicar los expresión matemática que correlacione de forma
métodos de cuantificación de proteínas; en ellas lineal las dos variables y así poder hallar la
se especifica la concentración de cada patrón de la concentración de la muestra problema por
curva y su respectiva absorbancia así como la interpolación.
absorbancia de la muestra problema que en los
dos métodos se ubicó dentro del rango de
cuantificación por lo que no fue necesario diluir la Método de Bradford
muestra. 1.5
1.422
Método de Bradford 1.149
Absorbancia

1 1.066

tubo Concentración(mg/ml) Absorbancia 0.669

0.5
A = 0,902C + 0,4902
Blanco 0 0,001 R² = 0,9793
1 0,2 0,669 0
0 0.5 1 1.5
2 0,6 1,066 Concentración (mg/ml)

3 0,8 1,149 Gráfica 1.Curva de calibración. Los datos experimentales

no se ajustan de manera estricta a una relación lineal.
4 1 1,422
M. problema M1 0,59 1,027 A partir de la expresión matemática presentada en
la gráfica 1 se puede hallar la concentración de la
muestra analizada por el método de Bradford.
Tabla 1. Datos espectrometricos obtenidos durante el ensayo de Sustituyendo el valor obtenido de absorbancia,
Bradford. 1,027 se obtiene:

2
 Método de Biuret
𝐴 = 0,902 𝐶 + 0,4902 0.6
1,027 = 0,902 𝐶 + 0,4902 0.5

Absorbancia
0.4
Por lo que la concentración en mg/ml de la 0.3
solución es
0.2
A= 0,0235 C + 0,0135
0.1
1,027 − 0,4902
𝐶= = 0,59 𝑚𝑔/𝑚𝑙 0
0,902 0 5 10 15 20 25
Concentración (mg/ml)
De igual forma se halló la concentración de una
muestra problema empleando el método de Gráfica 2. Curva de calibración. Los datos se ajustan
Biuret. A partir de la gráfica 2 se obtiene que la perfectamente a una relación lineal
concentración está dada por la expresión
El resultado del método de Bradford es
aceptable, sin embargo cabe resaltar que la curva
de calibración puede mejorarse ya que la
0,150 − 0,0135
𝐶= = 5,80 𝑚𝑔/𝑚𝑙 concentración calculada debería ser un poco
0,0235 menor dada la correlación existente entre las
absorbancias. Por el contrario el método de Biuret
funcionó muy bien y el resultado es confiable ya
que se ubica entre una concentración de 5 y 7,5
mg/ml tal como el valor de absorbancia lo
predice.

patrón absorbancia Proteína (mg/ml) Factor de dilución* Proteína (mg/ml) Proteína (mg)**
Concentración medida
1 0,669 0,2 0,1/1,1 0,018 0,020

2 1,066 0,6 0,1/1,1 0,054 0,055

3 1,149 0,8 0,1/1,1 0,072 0,079

4 1,422 1 0,1/1,1 0,090 0,01

5 0,065 2,5 0,1/1,1 0,225 0,248

6 0,131 5,0 0,1/1,1 0,45 0,5

7 0,192 7,5 0,1/1,1 0,675 0,742

8 0,257 10 0,1/1,1 0,9 0,99

9 0,366 15 0,1/1,1 1,35 1,49

10 0,478 20 0,1/1,1 1,8 1,98

M1 1,027 0,61 0,1/1,1 0,055 0,06

M2 0,150 5,80 0,1/1,1 0,522 0,57
Tabla 3. Cantidad de proteína en cada muestra.
*De cada patón se tomó una alícuota de 0,1 ml y se mezcló con 1ml de reactivo.
**La cantidad de proteína en la muestra analizada se halla multiplicando la concentración de la solución medida por el
volumen final de 1,1 ml.

3
4. Problemas propuestos
a. Defina con sus propias palabras que es una
curva patrón.
Es un método que se utiliza para hallar una
concentración desconocida de un analito, a partir
de patrones con cantidades conocidas de este.
Para utilizar la curva debe haber una relación
lineal entre la señal aportada por el instrumento y
la concentración del analito de interés.
b. Explique por qué en el método de Biuret la
absorbancia de una proteína se lee a una
longitud de 545nm.
El reactivo de Biuret forma un complejo colorido
que tiene un máximo de absorción a 545nm. El
reactivo es una solución alcalina que contiene
cobre y forma un complejo con los enlaces
peptídicos de la proteína, ver figura 1.. La
reacción se basa en la formación de un complejo
de color violeta, debido a la reacción entre los
pares de electrones libres del nitrógeno que
forman el enlace peptídico y los iones Cu2+. Este
complejo posee máximo de absorción en 300nm y
en 545nm, pero la utilizada es la segunda debido a
que a 300nm se encuentran interferencias con
otros elementos.
c. ¿Cuál es el método más sensible y el menos
sensible? ¿Por qué?
La sensibilidad de un método analítico mide la
capacidad del método para diferenciar entre
pequeñas variaciones del analito. Y según la
IUPAC se define como la pendiente de la curva
de calibración. Por lo tanto el método más
sensible es el de Bradford, puede distinguir
menores diferencias de concentración y la
pendiente de la curva de calibración es mayor en
comparación del método de Biuret. En
consecuencia el método menos sensible es el de
Biuret.
2
d. Decide qué método de determinación de
proteínas elegirías para la cuantificación de
proteínas en: suero, orina, durante una
purificación enzimática, en un extracto
bacteriano concentrado, en preparaciones de
membranas plasmáticas solubilizadas con
SDS, en preparaciones de membranas
mitocondriales solubilizadas con Triton X-
100. Justifique su respuesta.
Suero y extracto bacteriano concentrado
La cuantificación de proteínas la haría por el
método de Biuret, es una muestra que muy
probablemente posee la concentración en los
límites de detección.
Orina
La cuantificación de proteínas la haría por el
método de Bradford ya que, la presencia de
nitrógeno en urea de la muestra crea interferencia,
en el método de Biuret.
Durante la purificación enzimática
La cuantificación de proteínas la haría por el
método de Bradford porque, es el método más
sensible ideal para una muestra delicada y escasa.
Además el calentamiento al que se debe someter
la muestra en el método de Biuret podría
desnaturalizar las enzimas.
En preparaciones de membranas plasmáticas
solubilizadas con SDS y en preparaciones de
membranas mitocondriales solubilizadas con
Triton X-100
La cuantificación de proteínas la haría por el
método de Biuret ya que, el método de Bradford
presenta interferencia con detergentes.
5. Conclusiones

1. Dada la sensibilidad de los dos métodos era

de esperarse que la concentración de la muestra
analizada por el método de Bradford tuviera
una concentración menor que la muestra
analizada por el método de Biuret.

2. La concentración real de la muestra analizada

por el método de Bradford es menor. Las
desviaciones de la curva de calibración generan
un aumento de la concentración a la hora de
realizar la interpolación con la absorbancia
obtenida.

3. Cuando se presentan limitaciones en la

cantidad de muestra disponible, el método de
Biuret es una buena opción para realizar
procedimientos de cuantificación de proteínas.

Referencias

CESPON ROMERO, Rosa María.

DESARROLLO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS AUTOMÁTICOS PARA LA
DETERMINACIÓN DE METALES EN EL
MEDIO AMBIENTE LABORAL. Universidad
de Santiago de Compostela. España, Santiago
de Compostela, 2007. Pág. 166.

IBAÑEZ C, Jorge; MAINERO M, Rosa;

DORIA S, María del Carmen. Experimentos de
química en microescala para nivel medio
superior. Universidad Iberoamericana. México,
2009. Págs. 291,292.

OLIVER, Jordi; ROCA, Pilar; RODRIGUEZ,

Ana María. BIOQUIMICA, TECNICAS Y
METODOS. Editorial Hélice. España, Madrid,
2003. Pág. 156.