REPORTE 3. ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. PARTE II.
FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS: EFECTO DE
LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR.
Equipo 1. Bioquímica Experimental. Autores: Acosta García Juan Pablo, Jiménez Martínez Arturo, Serrano Malagón Pedro.
Ciudad de México. Facultad de Química, UNAM. 28 de marzo de 2019
Resumen
La velocidad de la reacción enzimática se puede ver
afectada por la concentración del sustrato de a enzima o
por la presencia de un inhibidor enzimático. En el
presente trabajo se realizó un ensayo enzimático con la
Lactato deshidrogenasa (LDH) que se obtuvo de la
fracción 3 en el proceso de purificación de proteínas,
donde se evaluó el efecto que tiene la concentración del
sustrato (piruvato), así como el efecto que tiene un
inhibidor enzimático (oxamato) sobre la actividad
enzimática. También se determinaron los parámetros
cinéticos de la reacción catalizada por la LDH, utilizando
el gráfico de la ecuación linealizada de Lineweaver-Burk
para calcular la velocidad máxima (Vmax) y la constante
de Michaelis-Menten (Km), cuyos resultados fueron
0.0789 y 0.2162 respectivamente para la evaluación de
la concentración de sustrato y un valor de Vmax y Km de
0.0429 y 0.7566 para el efecto de un inhibidor, dado que
las líneas de tendencia intersetan en el segundo
cuadrante, y no en el eje “X” ni “Y”, concluimos que es un
inhibidor mixto.
Introducción
La cinética enzimática estudia la velocidad de las
reacciones catalizadas por enzimas. Estos estudios
proporcionan información directa acerca del mecanismo
de la reacción catalítica y de la especificidad del enzima,
mediante el seguimiento de la desaparición de sustrato
o la formación producto. en función del tiempo. La
velocidad de la reacción enzimática se puede ver
afectada por la concentración del sustrato de a enzima o
por la presencia de un inhibidor enzimático. Un inhibidor
enzimático es una molécula que se une al sitio activo de
la enzima, disminuyendo su actividad o bloqueándola. La
inhibición competitiva sucede cuando se agrega un
sustrato, pero también el inhibidor, ambos compiten por
entrar al sitio activo de la enzima.
Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración
inicial del sustrato sobre la actividad enzimática
comenzaron a realizarse por Leonor Michaelis y Maud
Menten que propusieron una ecuación de velocidad que
explica el comportamiento cinético de los enzimas
(Cinética de Michaelis-Menten) cuyas observaciones
experimentales fueron las siguientes: A bajas
concentraciones de sustrato, la velocidad inicial
incrementa linealmente, mientras la concentración de
sustrato aumenta. A mayores concentraciones de
sustrato, los incrementos de la velocidad inicial se hacen
menores mientras la concentración de sustrato
aumenta. Y después de una cierta concentración de
sustrato, la velocidad inicial ya no aumenta pues ha
alcanzado un punto máximo (velocidad máxima), por
otro lado, la concentración de sustrato a la que se alcanza
la velocidad máxima se le conoce como Km.
Con el fin de obtener una línea recta en lugar de una
curva, se optó por realizar la representación gráfica de
doble recíprocos o diagrama de Lineweaber-burk, que
también permitiría la obtención de los parámetros
cinéticos de la enzima y que, además, permitiría ver de
forma gráfica cómo actúa un inhibidor sobre ella,
habiendo inhibidores del tipo competitivo, no
competitivo, incompetitivo y mixto.
Objetivos
• Calcular los parámetros cinéticos de la reacción
catalizada por la LDH utilizando diferentes
gráficos de la ecuación linealizada de Michaelis-
Menten.
• Determinar el efecto y el tipo de inhibición de un
inhibidor en la actividad de LDH.
• Analizar el efecto de un inhibidor sobre los
parámetros cinéticos de la enzima.
Hipótesis
Si el oxamato tiene una estructura análoga al piruvato,
este competirá con el piruvato por el sitio catalítico de la
LDH y por lo tanto se espera que sea un inhibidor de tipo
competitivo.
Metodología
Para estudiar el efecto de la concentración en la actividad
de la LDH , se prepararon diferentes soluciones con 600
uL de amortiguador de fosfatos pH 7.0 100 mM, 63 uL de
NADH 4mM, volúmenes especificados en el protocolo de
piruvato 10 mM para obtener soluciones 0.06, 0.09, 0.15,
0.25, 0.36 y 0.5 mM, 10 uL de enzima diluida 200 veces
de la fracción F3 obtenida del protocolo anterior (este se
agrega al último y antes de hacerlo, se lee en
espectrofotómetro a 340 nm) y agua cantidad bastante
para 1000 uL. Luego de agregar la enzima, se empieza a
leer y a registrar las absorbancias que van adquiriendo
las soluciones cada 20 segundos, o 10 en caso de que esta
disminuya muy rápido, a 340 nm en espectrofotómetro.
Por último, se hace tratamiento de los datos para su
interpretación.
Para el efecto del inhibidor se realiza exactamente el Tabla1. Tratamiento de datos para la obtención del diagrama de
mismo procedimiento, pero añadiendo 34 uL de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk
Oxamato 10 mM a cada solución. [sustrato] 1/[s] m m A A 1/AC 1/(A
Cons Inhib Cons. c/Inhib c/inhib)
Sust.
Resultados
0.060 16.667 0.176 0.028 0.019 0.003 52.093 322.827
A continuación, se muestra el ensayo de la actividad
enzimática (Gráfico 1) de la LDH a través de una curva 0.090 11.111 0.197 0.046 0.021 0.005 46.516 198.019

temporal, donde se evalúa el efecto de la concentración

0.150 6.667 0.203 0.054 0.022 0.006 45.119 169.783
del piruvato con 6 diferentes concentraciones.
Posteriormente se realizó otro ensayo de actividad 0.250 4.000 0.400 0.120 0.044 0.013 22.932 76.530
enzimática donde se evaluó el efecto que tiene el
0.360 2.778 0.599 0.131 0.065 0.014 15.309 69.827
oxamato como inhibidor enzimático, la curva temporal
se muestra en el gráfico 2. 0.500 2.000 0.732 0.144 0.080 0.016 12.534 63.536

Desde aquí se puede empezar a ver las velocidades

máximas del efecto de la concentración y el inhibidor

Gráfico 1: Efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad Gráfico 3. Diagrama de Michaelis-Menten. La actividad de las
catalítica de la LDH. Se puede apreciar un decremento más rápido de soluciones con inhibidor a las diferentes concentraciones de sustrato,
la absorbancia, en las soluciones que tienen una mayor concentración están muy por debajo de la actividad sin inhibidor.
de piruvato, a medida que pasa el tiempo.

Gráfica 2. Efecto en la actividad de la LDH en presencia de un

inhibidor. Se observa el mismo decremente en las soluciones con Gráfica 4. Diagrama de Lineweaver-Burk. Hay un cambio en la
mayor concentración de sustrato en función del tiempo, pero en esta pendiente y por lo tanto de Km, las líneas de tendencia no intersectan
el decaimiento es menos pronunciado. en el eje “Y” pero sí en el segundo cuadrante

* Cálculo ejemplo de los parámetros cinéticos en solución

dependiente de la concentración (1/AC).

Vmax (1/AC): 1/Vmax = b ∴ Vmax = 1/b = 1/12.676 = 0.078

mg*min*mmol-1
Km (1/AC): m=km/Vmax ∴ Km=m*Vmax = 2.7403*0.0789 =
0.2162 mmol
Tabla 2. Determinación de parámetros cinéticos para el efecto de la
concentración de piruvato y el efecto del inhibidor
Factor Vmax Km
Efecto de la 0.0789 0.2162
concentración de mg*min*mmol-1 mmol
sustrato
Efecto del inhibidor 0.0429 0.7566
mg*min*mmol-1 mmol
Análisis de resultados
De acuerdo con los resultados obtenidos, el efecto que
tiene la concentración del sustrato sobre la actividad
enzimática nos indica que la velocidad de la reacción va a
incrementar linealmente mientras aumenta la
concentración de piruvato hasta alcanzar un punto donde
la velocidad de reacción ya no crece proporcionalmente a la
concentración de piruvato, pues a partir de ese momento la
enzima empieza a saturarse y alcanza su velocidad
máxima. Por otra parte, la presencia de un compuesto con
estructura análoga al piruvato (oxamato) tiene un efecto
inhibidor sobre la actividad enzimática, pues al ser muy
similar al piruvato, este compite por el sitio catalítico de la
enzima disminuyendo así a velocidad con la que la LDH
cataliza la reacción.
En cuanto a los parámetros cinéticos, se observa una mayor
velocidad de reacción cuando no hay inhibidor que cuando
lo hay, cosa que tiene mucho sentido ya que, si no hay un
factor que inhiba la reacción, está se podrá llevar a cabo
mucho más rápido. Por otro lado, la Km de las soluciones
que contiene oxamato como inhibidor presentan un valor
mayor que el de las soluciones que no lo contiene, cosa que
nuevamente tiene sentido ya que el valor de Km es
inversamente proporcional a la afinidad de la molécula por
la enzima, es decir, que mientras menor sea el valor de Km
mayor será la afinidad a la enzima y, como el piruvato es el
sustrato natural, presenta la mayor afinidad. Esto se puede
observar en la gráfica 2 donde se adiciono el inhibidor, a
medida que aumenta la concentración de piruvato la
absorbancia cae más rápido debido al desplazamiento del
oxamato por el piruvato, favoreciendo nuevamente la
formación de productos.
Con la gráfica 3 y 4 se pueden obtener los parámetros
cinéticos, en la grafica 3 solo con observarla y haciendo
extrapolaciones y en la 4 haciendo los respectivos cálculos,
en ambas deberían coincidir los datos, pero no lo hicieron
en la curva del efecto del inhibidor. El diagrama de
Lineweaver-Burk, al requerir dobles inversos, pequeños
errores en la experimentación, pueden conducir a mayores
errores a la hora de tratar los datos. Podemos decir que
probablemente hubo errores durante la experimentación
porque el comportamiento de las curvas después de hacer
el tratamiento de los datos, no son lo más apegado a los
modelos, esto se puede notar más en particular en la grafica
3, ya que no se obtuvo una curva tan bien pronunciado
como se esperaría, y al momento de pasar a doble
recíprocos, se obtuvo una línea de tendencia con R2 de
0.7978.
Por último, en gráfica 4 vemos que las líneas de tendencia
de las curvas con y sin inhibidor intersectan el segundo
cuadrante, y no en “Y” como se hubiera esperado debido al
gran parecido del oxamato con el piruvato, lo que indica
que es un inhibidor mixto y, como ya vimos, cambio el valor
de Km y Vmax como se esperaría de este tipo de
inhibidores. Sin embargo, teniendo en cuenta que
posiblemente hubo errores en experimentación, no se
descarta la idea de que sea un inhibidor competitivo.
Conclusión.
Dado los resultados obtenidos, el aumento en la
concentración de enzima provoca, en un principio, un
incremento lineal de la velocidad de reaccion y a medida
que va aumentando la concentración, la velocidad va
disminuyendo por la saturación de la enzima. Mientras que
un inhibidor hace que la velocidad sea menor, pero a
medida que se aumenta la concentración de sustrato, este
desplaza al inhibidor.
El oxamato es un inhibidor de tipo mixto, ya que hubo
cambios en ambos parámetros cinéticos de la enzima,
además de que las líneas de tendencia de Lineweaver-burk
se intersectaron en el segundo cuadrante, pero de existir
errores experimentales, este puede ser competitivo.
Referencias
• Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a
edition Ed. Freeman and company.
• Jennifer L. Powers§, Natalie E. Kiesman, Connie
M. Tran, John H. Brown, and Vicky L. H.
Bevilacqua, (April 12, 2007) .
• Lactate Dehydrogenase Kinetics and Inhibition
Using a Microplate Reader. Consultado el 9 de
octubre de 2018, recuperado de
https://iubmb.onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/
10.1002/bmb.74.
• Lehninger, A.L. 2005. Principios de Bioquímica.
4ª edición. Editorial Omega. Barcelona. pp. 191-
237. Mathews C. 1992. Bioquímica, 2da edición,
Ed. McGraw-Hill pp. 398-433.