Manual de Estudo Dirigido em Biotecnologia Molecular- Prof ª Cristiane Alves da Fonseca

AGENTES BIOLÓGICOS UTILIZADOS NA BIOTECNOLOGIA

-A CÉLULA Como Unidade dos Seres Vivos:

-Unidade estrutural dos seres vivos (eucariontes e procariontes).
-Formada por água, íons inorgânicos e moléculas orgânicas (proteínas,
carboidratos, lipídios e ácidos nucléicos).
-Todas apresentam membrana plasmática.
Células procariontes (reino monera) - Bactérias

Células eucariontes (reinos protista, fungo, planta e animal)

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RELAÇÃO ENTRE AS ESTRUTURAS CELULARES E SUA FUNÇÃO

Estrutura Função Cel. Cel. animal Cel. vegetal
Bacteriana
Parede celular Manutenção da Presente ou Ausente Presente
forma e proteção da ausente
célula
Membrana Manutenção da
plasmática estabilidade do
meio intracelular; Presente
controle das trocas
entre a célula e o
meio extracelular
Carioteca ou mb Controle do fluxo de
Nuclear substâncias entre o Ausente Presente
núcleo e o
citoplasma
Cromossomos Controle da
estrutura e do Único e Múltiplos e lineares; DNA e
fracionamento circular, proteínas
celular. apenas DNA
Nucléolo(s) Formação de Ausente Presente
ribossomos
Centríolos Formação de cílios
e flagelos; Ausente Presente Ausente
participação na
divisão celular
Ribossomos Síntese de Presente
proteínas
Retículo
Endoplasmático Síntese de
Rugoso proteínas
Retículo Síntese de lipídios; Ausente Presente
Endoplasmático armazenamento e
Liso inativação de
substâncias.
Complexo de Secreção celular
golgi
Lisossomos Digestão intracelular
Vacúolo central Equilíbrio osmótico
e armazenamento Ausente Presente
Mitocôndrias Respiração celular Presente
aeróbia Ausente
Cloroplastos Fotossíntese Ausente Presente
Citoesqueleto Manutenção da
forma celular; Ausente Presente
contração;
ancoragem de
organelas

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TÉCNICAS LABORATORIAIS:
-Técnicas microscópicas  permitem uma visualização detalhada da célula.
 Microscopia óptica: utilizada p/ observar cortes de tecidos que são fixados
(álcool, ácido acético, formaldeído) e tingidos com corantes que reagem com
proteínas ou ácidos nucléicos, aumentando o contraste da imagem.
 Microscopia de contraste de fase  transforma as diferenças de espessura
ou densidade do fragmento observado em diferença de contraste.
 Microscopia Fluorescente  associa anticorpos específicos a um reagente de
forma a marcar as moléculas e visualizar sua distribuição nas células.
 Microscopia confocal  combina a microscopia fluorescente com a análise
eletrônica da imagem fornecendo uma imagem tridimensional.
 Microscopia eletrônica  permite a observação plana de cortes tingidos com
sais de metais pesados (microscopia de transmissão) e a observação
tridimensional das células (microscopia de varredura).
-Técnicas físicas como a centrifugação diferencial (ultracentrifugação,
centrifugação em gradiente)  separam os componentes celulares para estudos
bioquímicos posteriores.
-Técnicas instrumentais  possibilitam a contagem de células, e a separação de
populações celulares (cell sorter) ou de cromossomos (flow sorter).
-Técnicas de cultura de células com objetivos diversos.

TODA CÉLULA DERIVA DE OUTRA PREEXISTENTE

-Todo organismo multicelular se forma a partir da multiplicação de uma única célula-
ovo ou zigoto.
-As contribuições dos genes maternos e paternos para o desenvolvimento do embrião
não são idênticas (impriting)
-As células embrionárias se diferenciam, formando mais de 200 tipos de células em
animais e um pouco menos em vegetais.
-Os diferentes tipos celulares cumprem funções específicas que, integradas,
asseguram a unidade de organismo.

-Vegetais: a persistência de tecidos embrionários totipotentes (meristemas) na planta

adulta permite o crescimento e regeneração durante a vida toda do organismo. Células
especializadas podem reverter a um estado não diferenciado e regenerar um
organismo completo e diferenciado.

-Animais
- A totipotência se restringe às células do embrião com menos de 4 dias que são as
únicas capazes de regenerar um organismo inteiro.

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- No embrião de mais de 4 dias algumas células internas do blastocisto (células

tronco-embrionárias) podem originar todos os tecidos do organismo, sendo
consideradas pluripotentes.

- Célula-tronco totipotente ou embrionárias (16-32 células)  Célula-tronco

pluripotente (32 a 64 células)  células oligopotentes/multipotentes 
células unipotentes (diferenciadas).

Aplicações das células como agentes biológicos:

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A DIVERSIDADE MICROBIANA

- O termo “microrganismos” se aplica a um grupo heterogêneo de seres que

vivem como células independentes ou como agregados celulares: bactérias,
protozoários, algas e fungos e, também vírus.
- Mostram uma diversidade surpreendente de estrutura e modos de vida.
- Os aeróbios crescem se houver oxigênio, os anaeróbios se não houver.
- Autótrofos sintetizam seus alimentos a partir de dióxido de carbono; os
fotossintéticos utilizam a luz como fonte de energia e os quimiossintéticos,
algumas reações químicas inorgânicas.
- Os heterótrofos dependem das moléculas orgânicas elaboradas pelos
autótrofos, que absorvem ou ingerem.
- Os mesmos métodos de isolamento, cultura “in vitro” e identificação podem
ser aplicados com pequenas variações a estes grupos.

AS BACTÉRIAS

-AS EUBACTÉRIAS

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-As bactérias ou monera são organismos unicelulares procarióticos em que uma

parede celular pode cumprir uma função protetora.
-Além do DNA cromossômico, podem apresentar plasmídios.
-Em condições favoráveis de umidade, pH e temperatura, as bactérias se
multiplicam rapidamente por fissão celular produzindo milhões de células em
poucas horas.

-As eubactérias são as mais estudadas e conhecidas, pois têm grande

importância ecológica, industrial e médica. Nas eubactérias incluem-se as
cianobactérias (estas últimas também conhecidas pela antiga denominação
"algas cianofíceas" ou "algas azuis").
-Formam um grupo com mais de 5.000 espécies conhecidas. Pequenas
(0,0005-0,005mm) de formas diversas (esféricas, bastonetes, helicoidais)
podem ser encontradas isoladas ou em pares, cadeias ou agregados.
-Algumas se locomovem livremente, mediante um ou mais flagelos distribuídos
na superfície celular, enquanto outras se aderem mediante pêlos ou fímbrias a
um organismo hospedeiro.
-Em condições desfavoráveis, algumas bactérias formam esporos que resistem
em forma latente até que a situação mude, germinando e retomando sua
atividade fisiológica.

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-Uma técnica laboratorial (coloração de Gram) permite diferenciar as bactérias

pela estrutura da parede celular.

Bactérias Gram-positivas: sua parede celular é composta por uma espessa camada de
peptideoglicanos (proteínas + carboidratos). Algumas também possuem uma camada de
Ácido Teicóico externa à camada de peptideoglicanos. EX: gêneros como clostridium,
Bacillus, Mycobacterium, Streptomyces etc.

O Lugol (iodo) utilizado no método de coloração de Gram fixa a violeta genciana a este
tipo de parede celular.

Bactérias Gram-negativas: possuem parede celular composta por lipopolissacarídeos,

lipopoliproteínas e fosfolipídeos. Ex: Micoplasmas, Salmonelas, E. Coli, treponema
pallidum, Clamídeas etc.

-Estas bactérias não retém a violeta genciana no método de coloração de Gram.

-As infecções por gram-negativas são mais difíceis de se tratar devido a uma
camada adicional na parede celular que as protege e dificulta a entrada de
antibióticos.

Bacilos gram-negativos Cocos gram-negativos

Bacilos gram-positivos Cocos gram-positivos

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AS ARQUEOBACTÉRIAS

-são um grupo heterogêneo, de organismos procarióticos, filogeneticamente

distante das eubactérias.
-inclui seres anaeróbios, aeróbios, autótrofos, heterótrofos, termófilos,
acidófilos, halófilos, fotossintetizantes, etc., constituindo um grupo bastante
diverso.
-Os principais pontos de distinção entre arqueobactérias e eubactérias são:
paredes celulares, fosfolípedes de membrana, síntese protéica e fatores
genéticos.
-Quando foram descritas, acreditava-se que as arqueobactérias eram
organismos que eram encontrados quase que exclusivamente em ambientes
extremos da vida.
-Existem gêneros com vias metabólicas peculiares que as tornam dependentes
de enxofre ou produtoras de metano.

-Devido a estas propriedades, nos últimos anos tem-se acelerado a prospecção

de arqueobactérias com propriedades interessantes para serem utilizadas em
processos industriais que exijam condições ambientais extremas.

Utilização de bactérias como agentes biológicos:

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PROTOZOÁRIOS

-Os protozoários se classificam no reino protista onde se agrupam organismos

eucariontes, unicelulares, autótrofos e heterótrofos, de reprodução sexuada ou
assexuada.

- Este reino é constituído por cerca de 65.000 espécies conhecidas, das quais 50% são
fósseis e o restante ainda vive hoje; destes, aproximadamente 25.000 são de vida livre,
10.000 espécies são parasitos dos mais variados animais e apenas cerca de 30 espécies
atingem o homem (Giárdia,Ttrichomonas, Toxoplasma, Leishmania, etc.)

-Neste reino também se colocam as algas inferiores: euglenófitas, pirrófitas

(dinoflagelados) e crisófitas (diatomáceas), que são Protistas autótrofos
(fotossintetizantes). Os protozoários são Protistas heterótrofos.

-Alguns vivem livres em ambientes marinhos, de água doce, úmidos ou solo.

-De importância fundamental para o ser humano do ponto de vista médico, sua
caracterização molecular pode dar origem a testes diagnósticos e vacinas.

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AS ALGAS
-Classificadas junto com os protozoários no reino protista, são organismos uni ou
pluricelulares, autotróficos e aquáticos.
-Cumprem papel fundamental na biosfera por serem capazes de fixar CO 2 e produzir
O2. Algumas participam na formação de solos e na fixação de nitrogênio.
-As macroalgas marinhas (algas pardas, vermelhas e parte das algas verdes) formam
filamentos e talos que podem chegar a 30m, apesar de não terem órgãos
diferenciados.
-São utilizadas na alimentação humana e também como adubo.
-Devido a sua capacidade de formar géis e emulsões, os ficocolóides extraídos delas
(agar, carragenina, alginato) se empregam em análises clínicas (preparação de meios
de cultura p/ bactérias e fungos) e em várias indústrias, tais como a alimentícia
(sorvetes, cremes, geléias etc.), a farmacêutica (laxantes, cápsulas de medicamentos)
e a cosmética (cremes, sabonetes, xampus, dentifrícios etc.).
-As microalgas representam um grupo diversificado de aprox. 25.000 espécies. O
grupo bem caracterizado compreende aprox. 50 espécies de microrganismos
fotossintéticos, tanto eucariontes (diatomáceas, dinoflagelados, euglenóides e outras
algas verdes) como procariontes (cianobactérias).

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OS FUNGOS
-O reino Fungo comporta mais de 100.000 espécies.
-São organismos eucarióticos, uni ou pluricelulares, com uma parede formada por quitina.
-Todos são heterótrofos e podem se reproduzir sexuada ou assexuadamente.
-As leveduras são fungos unicelulares que se desenvolvem em lugares úmidos e se
reproduzem por brotamento. Pertence a este grupo um dos microrganismos de maior
importância econômica: Saccharomyces cerevisiae (levedo de cerveja ou “levedura”).
Utilizado na preparação de alimentos e bebidas, produção de etanol, vitaminas e outros
metabólitos. Transformada mediante técnicas de engenharia genética, produz uma vacina
contra hepatite B.
-Em Bolores e mofos, as células formam um emaranhado de filamentos ou hifas, denominado
micélio.
-São também responsáveis por diversas doenças nas plantas e podem destruir alimentos e
materiais como madeiras e tecidos.
-Os fungos têm grande relevância para a medicina, pois algumas espécies produzem
substâncias como antibióticos, esteróides, ácidos orgânicos etc. Os fungos não precisam
parasitar o homem para sobreviverem, apenas poucas espécies atacam eventualmente o
organismo humano causando, em geral, micoses, intoxicações ou envenenamentos.

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OS VÍRUS

-Organismo que é reproduzido no interior de células vivas (parasita intracelular obrigatório). -É

considerado muitas vezes partícula infecciosa, composta de uma cápsula protéica e um ácido
nucléico (DNA ou RNA) que depende de um organismo hospedeiro para sua replicação.
-Podem atravessar filtros extremamente finos e cristalizar. Muitos possuem enzimas que serão
liberadas dentro da célula hospedeira.
-São utilizados como vetores para introduzir genes em uma célula hospedeira.
-Várias doenças são causadas por vírus (poliovírus, HIV, coronavírus, etc). Ao infectar as células
animais normais, alguns vírus as transformam em células cancerosas.
-Os vírus que infectam insetos podem ser utilizados no controle de pragas. Ex: Lagarta da soja 
Baculovírus evita a aplicação de 1,2 milhões de litros de inseticidas por ano nas lavouras
brasileiras.
-Os vírus podem ser divididos em grandes grupos denominados famílias, de acordo com o tipo de
genoma do ácido nucléico, tamanho, forma, subestrutura e o modo de duplicação da partícula
viral.
-Muitos genomas virais (papilomavírus, adenovírus, retrovírus e SV40) são utilizados como
vetores de duplicação e de expressão de genes celulares e virais. Transferência de genes em
células de mamíferos podem ser mediadas por vírus (terapia gênica). Através da rDNA pode-se
obter grandes quantidades de antígenos puros p/ vacinas e diagnóstico.

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TÉCNICAS LABORATORI AIS

Cultivar e Identificar Microrganismos: a identificação de um microrganismo demanda:
1- observação microscópica;
2- utilização de alguns métodos específicos de coloração,
3- Métodos bioquímicos e eventualmente genéticos e imunológicos.

-Encontrar e manter um microrganismo no laboratório demanda a aplicação de técnicas

bacteriológicas aplicáveis também, com algumas variações, a fungos e algas.
-Cultivar microrganismos exige, além de um meio nutriente que satisfaça suas necessidades
metabólicas, um cuidado especial com a temperatura, umidade e iluminação.
-Meios nutrientes se empregam líquidos ou solidificados com agar.
-Recipientes mais comuns são: tubos de ensaio, placas de petri e frascos com tampa-rosca.
-Para inocular os meios: alças de platina e pipetas diversas.
-Dificuldade: conseguir a multiplicação do microrganismo desejado evitando contaminações
por outros microrganismos.
-Trabalha-se em condições assépticas com a esterilização prévia dos materiais utilizados.
-Microrganismos são isolados a partir de amostras de solo, água, ar ou fluidos corporais. As
linhagens obtidas se conservam como culturas puras.
Biossegurança (Classif. De acordo c/ risco de causarem danos aos prof e coletividade)

(a) Classe de risco 1 - (baixo risco individual e baixo risco para a comunidade) - organismo
que não cause doença ao homem ou animal.

(b) Classe de risco 2 - (risco individual moderado e risco limitado para a comunidade) -
patógeno que cause doença ao homem ou aos animais, mas que não consiste em sério risco,
a quem o manipula em condições de contenção, `a comunidade, aos seres vivos e ao meio
ambiente. As exposições laboratoriais podem causar infecção, mas a existência de medidas
eficazes de tratamento e prevenção limitam o risco, sendo o risco de disseminação bastante
limitado.

(c) Classe de risco 3 - (elevado risco individual e risco limitado para a comunidade) -
patógeno que geralmente causa doenças graves ao homem ou aos animais e pode
representar um sério risco a quem o manipula. Pode representar um risco se disseminado na
comunidade, mas usualmente existem medidas de tratamento e de prevenção.

(d) Classe de risco 4 - (elevado risco individual e elevado risco para a comunidade) -
patógeno que representa grande ameaça para o ser humano e para aos animais,
representando grande risco a quem o manipula e tendo grande poder de transmissibilidade de
um indivíduo a outro. Normalmente não existem medidas preventivas e de tratamento para
esses agentes.

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