SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE

CENTRO NACIONAL DE HOTELERÍA, TURISMO Y ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DE SUPERFICIES

1. OBJETIVO

Este procedimiento tiene por objeto explicar los pasos a seguir para realizar la evaluación de la
calidad microbiológica en superficies, empleando la técnica recuento en placa.

2. ALCANCE

Este procedimiento es aplicable para el análisis de microorganismos en superficies de utensilios,

equipos, materiales, áreas de procesamiento de alimentos y áreas del laboratorio de microbiología.

3. DEFINICIONES

DESINFECCIÓN: Proceso de inactivación, destrucción o remoción de la carga bacteriana presente

sobre una superficie. La desinfección no implica necesariamente esterilización.

ESTERILIZACIÓN: Proceso en la cual se elimina completamente toda forma de vida microbiana.

HIGIENE: La higiene es el conjunto de conocimientos y técnicas que aplican los individuos para el
control de los factores que ejercen o pueden ejercer efectos nocivos sobre su salud.

LIMPIEZA: La limpieza se define como el proceso de remover, a través de medios mecánicos y/o
físicos, el polvo, la grasa y otros contaminantes de las superficies, equipos, materiales, personal, etc.
Este proceso, junto con un adecuado proceso de desinfección, es indispensable para controlar la
presencia de los microorganismos en el ambiente.

SANITIZACIÓN: Proceso empleado para reducir el contenido de microorganismos viables en una

superficie limpia.

4. DESARROLLO DE ACTIVIDADES

4.1. FUNDAMENTO

La evaluación microbiológica de las superficies se basa en el recuento de microorganismos

indicadores de contaminación que pueden ser transmitidos al producto durante el proceso de
elaboración. Para realizar el aislamiento se requieren medios de cultivos selectivos y específicos
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según las necesidades de cada microorganismo o grupo bacteriano a evaluar; por ejemplo:
Coliformes totales, Coliformes termotolerantes, Staphylococcus aureus coagulasa positiva, mohos y
levaduras, mesófilos aerobios, son considerados para evaluar la calidad microbiológica de las
superficies.

La técnica se basa en analizar volúmenes decimales de muestra en un medio de cultivo específico

para el analito en cuestión, realizando la siembra en profundidad. Se asume que cada una de las
células presentes en el inóculo dará lugar a una unidad formadora de colonia (UFC) lo que permite
realizar el recuento de microorganismos presentes en la muestra.

La evaluación microbiológica de superficie se realiza con el fin de determinar el grado de

contaminación, verificar la eficacia de los procesos de limpieza y desinfección y conocer la calidad
sanitaria de las instalaciones.

4.2. INTERFERENCIAS

 Alta concentración del analito.

 Contaminación cruzada en el transporte, recepción y almacenamiento de las muestras.
 Dilución de nutrientes y pH inestable en los medios de cultivos.
 Inadecuada homogeneización.
 Residuos de detergentes y desinfectantes.
 Temperatura de incubación fuera del rango de especificación para el analito.

4.3. TOMA Y PRESERVACIÓN DE MUESTRAS

Recolectar las muestras de superficie con la ayuda de hisopos estériles (Escobillones). Delimitar el
área (10 X 10 cm o 20 X 20 cm). Realizar un barrido del área delimitada empleando hisopos
estériles. Luego introducir los hisopos en tubos con 5 ml de caldo BHI. Conservar a temperatura
entre 2 y 6 °C y transportar de inmediato al laboratorio para realizar los respectivos análisis

4.4. EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS.

4.4.1. Equipos.

 Balanza electrónica.
 Cabina de flujo laminar.
 Cuenta colonias.
 Incubadora 35 °C.
 Incubadora 22 °C.
 Neveras.

4.4.2. Materiales.

 Asa de Hokey.
 Bandejas de transporte.
 Cajas Petri grandes.
 Dispensador de pipetas.
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  Frascos y recipientes para descarte.
 Gradillas.
 Hisopos estériles.
 Marcadores.
 Micropipetas de 100 y 1000 µL.
 Pipetas graduadas estériles de 1, 5 y 10 mL.
 Tips para micropipetas, azules y amarillas.
 Toallas de papel absorbente.
 Tubos de ensayos tapa rosca 16 cm x 16 mm.

4.4.3. Medios de cultivos y reactivos.

 Agar Baird Parker

 Agar Cetrimide
 Agar Chromocult
 Agar Endo
 Agar M-FC
 Agar Plate Count
 Agar YGC.
 Caldo BHI
 Kit Oxidasa
 Plasma de conejo.

4.4.3.1. Indicaciones para la preparación del Agar Baird Parker

 Agregar 63 g del polvo en 1000 mL de agua desionizada.

 Someter el medio a calor hasta disolver completamente.
 Ajustar el pH a 7.0 +/- 0,2.
 Esterilizar en autoclave a 121º C, 15 PSI, durante 15 minutos.
 Dejar enfriar aproximadamente a 45º C y adicionar por cada 200 mL de agar base Baird
Parker; 10 mL de solución yema de huevo al 20% y 0.6 mL de Telurito de Potasio 3.5 %.
 Agitar suavemente hasta mezclar completamente el agar con los agregados. Servir en cajas
petri grandes estériles.
 Dejar solidificar y almacenar entre 2 y 8 °C.
 Eliminar el exceso de humedad sobre la superficie de la caja, exponiendo la caja abierta en la
cabina de flujo laminar, durante unos minutos.

4.4.3.2. Indicaciones para la preparación del caldo BHI.

 Agregar 37,63 g del polvo en 1 L de agua destilada.

 Agitar hasta disolver completamente.
 Ajustar el pH a 7,0 ± 0,2 a 25 °C.
 Dispensar de 5 a 7 ml del caldo en tubos de ensayo taparrosca.
 Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos.
 Retirar los tubos de la autoclave, dejar enfriar y refrigerar.

4.4.4. Soluciones.

 Agua peptonada 0,1 %.

 Cloruro de Sodio 0,85 %.
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  Alcohol Etílico 96 %.
 Solución yema de huevo.
 Solución Telurito de Potasio.

4.4.4.1. Indicaciones para la preparación de la solución de yema de huevo al 20%.

 Lavar los huevos con abundante agua y jabón.

 Sumergir los huevos en una solución de alcohol al 70% durante 15 minutos.
 Perforar la corteza del huevo en la parte superior con ayuda de una pinza estéril.
 Dejar salir la albúmina (clara del huevo) cuidadosamente hasta quedar solo la yema.
 Añadir 20 mL de yema de huevo en una probeta estéril con capacidad de 100 mL. Completar
un volumen de 100 mL, añadiendo 80 mL de solución salina 0.85% estéril.
 Agregar en un frasco estéril y rotular adecuadamente con la fecha y nombre de la preparación.
 Agitar vigorosamente para homogeneizar completamente.

Nota: Conservar entre 2 a 6 °C y descartar 8 días después de la preparación o cuando se observe

algún signo de contaminación.

4.4.4.2. Indicaciones para la preparación de la solución Telurito de Potasio 3.5%.

 Pesar 3.5 g de Telurito de Potasio (K2TeO3), en papel parafinado.

 Llevar a un vaso de precipitado y agregar una pequeña cantidad de agua destilada estéril,
para disolver.
 Transferir esta solución a un balón aforado de 100 mL y aforar con agua destilada estéril.
 Almacenar en un frasco estéril, e identificar adecuadamente con el nombre y fecha de la
preparación.
 Conservar entre 2 y 8 °C.

NOTA: En caso de disponer de una solución comercial de Telurito de Potasio al 3.5 %, tomar
directamente del frasco; el volumen necesario y almacenar según las indicaciones del fabricante.

4.5. CONSIDERACIONES DE SALUD, SEGURIDAD Y MANEJO AMBIENTAL.

 Usar bata blanca, guantes, mascarilla, gorro y lentes de protección.

 Lavarse las manos antes y después de manipular.
 Desinfectar el área de trabajo antes y después de realizar una tarea.
 No comer, beber, fumar, aplicarse maquillaje o cremas en el área de trabajo.
 No almacenar alimentos y bebidas en refrigeradores donde se encuentren los medios de cultivos,
reactivos, soluciones y materiales de trabajo.
 Tener en cuenta los avisos de advertencia en lo relacionado con las lámparas UV. No ingresar al
área mientras se encuentre encendida.
 Al salir del laboratorio, verificar que las llaves del gas se encuentren cerradas.

4.6. PROCEDIMIENTO

 Identificar las cajas con el código, fecha y hora de siembra.

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  Tomar el tubo que contiene el escobillón con la muestra y colóquelo en el vórtex durante 30
segundos, ajustando la velocidad para que la pared del tubo quede humedecida arriba a una
altura de 2 cm, y a 3 cm debajo de la tapa.
 Tomar 1 ml de la muestra (tubos con BHI) y adicionar en las respectivas cajas de petri.
Realizar diluciones, en caso de ser necesario.
 Para realizar siembra en agar Baird Parker, tomar 0,1 ml de la muestra, adicionar sobre la
superficie del agar y con ayuda de un asa de hockey, realizar una siembra masiva. Evitar el
contacto con los bordes de la caja, esto permitirá obtener mejor recuento.
 Para siembra en profundidad, agregar en cada caja petri de 15 a 18 ml de medio: Plate Count,
YGC y Endo, M-FC, PC y Chromocult.
 Mezclar el inóculo con el medio de cultivo, de la siguiente manera: rotar las cajas 5 veces de
arriba hacia abajo y de izquierda a derecha, 5 veces en el sentido de las agujas del reloj y 5
veces en sentido contrario. Dejar solidificar.
 Realizar los controles de calidad.
 Invertir e incubar las cajas de PC a 35 ± 0,5 ºC durante 48 ± 3 horas y a 55 +/- 2º C durante 72
horas, ENDO, Chromocult, a 35 ± 0,5 °C durante 22 – 24 horas, YGC a 22 ± 2 °C durante 5 –
7 días, Cetrimide a 35 ± 2 °C durante 72 horas y M-FC a 44.5 ± 0,5 °C durante 24 horas.
 Luego de transcurrir el tiempo de incubación, retirar las cajas de la incubadora y realizar la
lectura de las colonias.
 Seleccionar las cajas de cada dilución que contengan de 20 – 200 colonias y realizar el
recuento.

4.7. CÁLCULOS

Calcular el número de UFC por cm2 según el caso, aplicando las siguientes fórmulas:

Fórmula N° 1: Resultado UFC/ cm2 = (Recuento obtenido en 1 ml de diluyente) X Volumen de

diluyente (mL)/ Área examinada.

Fórmula N° 2: Resultado UFC/ 100 cm2 = Resultado UFC/cm2 x 100

Calcular la densidad para cada parámetro como se describe a continuación:

4.7.1. Coliformes totales: Realizar el recuento de las colonias de coliformes totales en las cajas con
agar ENDO (Colonias rojas con brillo metálico), aplicar la fórmula N° 1 y reportar el resultado como:
Coliformes totales UFC/100 cm2.

4.7.2. Coliformes termotolerantes: Realizar el recuento de las colonias de coliformes termotolerantes

en las cajas con agar M-FC (Colonias azules de distintos tonos), aplicar la fórmula N° 1 y reportar el
resultado como: Coliformes termotolerantes UFC/100 cm2.

4.7.3. Mesófilos aerobios: Realizar el recuento de las colonias de mesófilos aerobios en las cajas con
agar PC (Contar la totalidad de la colonias presentes en el agar), aplicar la fórmula N° 1 y reportar el
resultado como: Mesófilos aerobios UFC/100 cm2.

4.7.4. Mohos y levaduras: Realizar el recuento de las colonias de mohos y levaduras en las cajas
con agar YGC (Los mohos presentan colonias grandes, coloridas, con textura lanosa o algodonosa,
las colonias de levaduras son incoloras y lisas), aplicar la fórmula N° 1 y reportar el resultado como:
Mohos y/o levaduras UFC/100 cm2.
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4.7.5. Escherichia coli: Realizar el recuento de las colonias de Escherichia coli en las cajas con agar
Chromocult (Colonias de color azul a púrpura), aplicar la fórmula N° 1 y reportar el resultado como:
Escherichia coli UFC/100 cm2.

4.7.6. Staphylococcus aureus coagulasa positiva: Realizar el recuento de las colonias de

Staphylococcus aureus en las cajas con agar Baird Parker (Colonias negras y brillantes, lisas,
convexas, de 2 a 3 mm de diámetro, con bordes reducidos blancos, rodeadas de zonas claras que
contrastan con el medio opaco y zona de precipitado). Luego realizar la prueba de la coagulasa
como se indica a continuación:

4.7.6.1. Prueba de la coagulasa.

 Transferir por separado cada una de las colonias presuntivas a tubos que contengan 5 mL
de caldo BHI.
 Incubar a 35 +/- 2 °C durante 18 a 24 horas.
 Transferir 0.3 mL de cada cultivo de BHI, a tubos estériles con 0,3 mL de plasma de conejo
reconstituido (Reconstituir según indicaciones del fabricante).
 Incubar a 35 +/- 2 °C y observar cada hora y durante 6 horas; la formación de un coagulo de
fibrina bien definido al inclinar los tubos. Asumir la prueba negativa si no se observa
formación de coágulo después de 24 horas de incubación.

Realizar la relación correspondiente, aplicando la siguiente fórmula:

Fórmula N° 3: Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en 1 mL de diluyente:

Recuento en 1 mL de diluyente X (Colonias positivas/Colonias examinadas).

Ejemplo:

Recuento en 1 mL de diluyente = (Recuento en la caja x 10)= 20 X 10 = 200

Colonias examinadas = 10
Colonias positivas = 7

Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva en 1 mL de diluyente = 200 X (7/10) = 140

Aplicar la fórmula N° 1 y reportar el resultado como: Staphylococcus aureus coagulasa positiva

UFC/100 cm2.

En caso de no observar crecimiento o encontrar reacción negativa en la prueba coagulasa; reportar

Staphylococcus aureus coagulasa positiva menor de 1 UFC/100 cm2.

4.7.7. Pseudomona aeruginosa: Realizar el recuento de las colonias de Pseudomona aeruginosa en

las cajas con Agar Cetrimida (Crecimiento con pigmento verde azulado alrededor de las colonias;
fluorescencia bajo luz UV a 254 nm). Realizar la prueba de oxidasa (Seguir indicaciones del
fabricante – la reacción es positiva para Pseudomona aeruginosa), aplicar la fórmula descrita y
reportar el resultado como: Pseudomona aeruginosa UFC/100 cm2.

4.7.8. Aerobios termófilos: Realizar el recuento de las colonias de aerobios termófilos en las cajas
con agar PC incubadas a 55 +/- 2 ºC durante 72 horas (Contar la totalidad de la colonias presentes
en el agar), aplicar la fórmula N° 1 y reportar el resultado como: aerobios termófilos UFC/100 cm2.
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4.8. BIBLIOGRAFÍA.

 NTC 5230

 Manual de técnicas de análisis para el control de calidad microbiológico de alimentos para

consumo humano. INVIMA Santa Fe de Bogotá, 1998.

 Manual de medios de cultivo. MERCK, E. Darmstadt, Alemania 1994.

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