UNIVERSIDAD: Universidad de Buenos Aires – UBA

NÚCLEO DISCIPLINARIO: Salud Animal

TÍTULO DEL TRABAJO: “CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE COCOS GRAM

POSITIVOS AISLADOS DE EQUINOS”

AUTORES: Bustos, Carla P., González M. Solange, Guida Nora (Directora)

CORREOS ELECTRÓNICOS DE LOS AUTORES: carlabustos@fvet.uba,ar ,

msgonzalez@fvet.uba.ar , nguida@fvet.uba.ar

PALABRAS CLAVES: Equino, Streptococcus, Staphylococcus

INTRODUCCIÓN
Los cocos gram positivos son un grupo heterogéneo de microorganismos compuesto por
bacterias de diversas características, entre los que encontramos habitantes normales de piel
y mucosas hasta importantes agentes patógenos.
El género Staphylococcus está integrado por cocos positivos a la tinción de Gram,
agrupados en forma de racimos, catalasa positivo y aerobios o anaerobios facultativos.
Agrupa aproximadamente 50 especies y subespecies, muchas de las cuales son patógenos
oportunistas en caballos (Sellon D. C., 2007). La mayoría de las especies patógenas son
coagulasa positivos, entre ellas se encuentran dos de los estafilococos más importantes en
medicina equina: Staphylococcus aureus (S. aureus) y Staphylococcus intermedius. Muchas
especies son parte de la microflora normal, particularmente de piel y nasofaringe. En
humanos, es común encontrar portadores de S. aureus en fosas nasales (Sellon D. C.,
2007) en forma intermitente o persistente aunque también existen personas que nunca son
colonizadas por este microorganismo. Los estafilococos pueden poseer diversos factores de
virulencia que permiten la colonización del huésped y causar enfermedad. S. aureus
produce enzimas y toxinas que contribuyen sustancialmente a su patogenicidad. Entre las
enzimas se destacan las coagulasas, fosfatasas, desoxirribonucleasas termoestables,
lipasas, gelatinasas, proteasas, hialuronidasas y fibrinolisinas. También elabora toxinas
hemolíticas (alfa, beta, gamma y delta) y leucocidinas que actúan sobre la membrana de los
glóbulos rojos y blancos respectivamente. Produce otras toxinas como superantígenos
pirógenos responsables de múltiples síndromes clínicos. No suele identificarse la fuente de
infección en procesos bacterianos producidos por estafilococos en caballos, pero se cree
que podrían originarse a partir de la microflora endógena, el contacto con otros equinos e
incluso con humanos.
El género Streptococcus incluye cocos gram positivos agrupados en cadenas, catalasa
negativos y anaerobios facultativos. Numerosas especies pueden clasificarse en base a su
actividad hemolítica, en alfa hemolítico, beta hemolítico y no hemolítico. Los estreptococos
patógenos más significativos en medicina humana y veterinaria son beta hemolíticos. En
1933, la bacterióloga Rebecca Lancefield clasificó a los estreptococos en grupos según las
características antigénicas de los hidratos de carbono de su pared celular. Dentro del grupo
C de Lancefield se encuentra el Streptococcus equi, de gran importancia en caballos. El
Streptococcus equi subsp zooepidemicus es comensal de las mucosas nasofaríngea y
genital equina y se comporta como patógeno oportunista. El Streptococcus equi subsp equi
(See) es el agente causal de la Adenitis equina, enfermedad piógena altamente difundida en
nuestro país. Se trata de un patógeno primario altamente adaptado al huésped que se aísla
de caballos que padecen la enfermedad o que permanecen como portadores de la misma.
Su aislamiento en humanos y otros animales es sólo ocasional. Los factores de virulencia de
See incluyen la cápsula de ácido hialurónico, hialuronidasa, estreptolisina S, estreptokinasa,
exotoxinas pirógenas, péptidoglicano y proteína M. Se cree que es posible la formación de
una sustancia polisacárida extracelular o biofilm (Oggioni, M. R., 2006). Los estreptococos
de los grupos B, C y G suelen ser sensibles a la penicilina (Famiglietti, A. 2004). Sin
embargo, algunas cepas han mostrado resistencia y por ello se debe considerar la
utilización de otros antimicrobianos de uso rutinario como sulfamidas, fluorquinolonas,
cefalosporinas y tetraciclinas.
Se trabajó con diversas muestras provenientes de caballos enfermos y de clínicamente
sanos. La identificación bacteriana comenzó con la prueba de catalasa. A los cocos catalasa
positivo se les hizo las pruebas de oxido-fermentación, sensibilidad a la furazolidona y
crecimiento en agar manitol salado. Se continuó estudiando a las cepas de S. aureus a
través de la prueba de la coagulasa, detección de DNasa y de biofilm. Se estudió la
actividad hemolítica de los cocos catalasa negativo, se detectó el antígeno de Lancefield y
se les realizaron pruebas bioquímicas y fermentaciones de azúcares. Se investigó la
capacidad de formar biofilm y la sensibilidad antibiótica de las cepas identificadas como
See.

OBJETIVOS
-Identificar cepas de S. aureus y See a partir de muestras de equinos y caracterizarlas
fenotípicamente.

MATERIALES Y MÉTODOS
Se trabajó con cocos positivos a la coloración de gram aislados a partir de equinos enfermos
y animales clínicamente sanos. Las diferentes muestras se procesaron en laboratorio de
diagnóstico de la Cátedra de Enfermedades Infecciosas de la Facultad de Ciencias
Veterinarias – UBA. El control de calidad de los medios y el ensayo de las pruebas se
realizaron con cepas de referencia de S aureus (ATCC 6538, ATCC 25923 y ATCC 29213) y
de See (ATCC 33398).

-Prueba de la Catalasa
Se detectó la presencia del sistema enzimático catalasa responsable de descomponer el
peróxido de hidrógeno. Se sembraron las cepas en agar tripteína soja y se incubaron a 37°C
durante 24-48 hs. Se colocó una colonia en un portaobjeto y se adicionó H 2O2. La reacción
es positiva ante la formación instantánea de burbujas.
Se clasificó a los microorganismos en dos grandes grupos: catalasa positivo y catalasa
negativo. Se prosiguió con la identificación bioquímica de ambos grupos.
Cocos catalasa positivo:
-Prueba de óxido-fermentación (OF)
Esta prueba es utilizada para determinar el metabolismo fermentativo u oxidativo de la
glucosa. El medio de cultivo semisólido contiene una solución de glucosa al 10%
(concentración final del 1%), esterilizada por filtración. Se inocularon las cepas por
duplicado, a uno de los tubos se lo selló con parafina y se incubaron a 37° durante 24-48 hs.
La utilización de glucosa conlleva a la producción de ácido que se manifiesta por un cambio
de color del medio, el cual vira del violeta al amarillo. Los microorganismos fermentadores
producen ácido en ambos tubos y los que oxidan sólo lo producen en el tubo sin parafina.
-Prueba de sensibilidad a la furazolidona
Se utilizó el método de disco en placa de agar según Bauer-Kirby recomendado por el
NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standars 2006). Se utilizaron
monodiscos de furazolidona de 100 microgramos y agar de Mueller-Hinton (Difco) como
medio de cultivo. La incubación fue a 37°C por 24 hs y la lectura se realizó según el NCCLS.
-Prueba del manitol salado
El agar manitol salado es un medio selectivo debido a su alta concentración de sal. El
extracto de carne y la pluripeptona son la fuente de carbono y nitrógeno presentes en el
mismo. Cuenta con manitol que es el hidrato de carbono fermentable y un indicador de PH
que es el rojo fenol. La prueba consiste en sembrar las cepas a partir de un cultivo de agar
tripteína soja de no más de 24 hs en el medio en cuestión e incubarlas a 37°C durante 24
hs. Las bacterias que hidrolizan el manitol acidifican el medio y crecen formando colonias
que se ven de color amarillo brillante. Las bacterias que no utilizan el manitol, forman
colonias de color rojo o púrpura debido a que no hay acidificación del medio.

A las cepas identificadas como S. aureus se las caracterizó fenotípicamente mediante la

detección de las enzimas coagulasa y DNasa y de la capacidad productora de biofilm.
-Prueba de la Coagulasa
Se detectó la capacidad de coagular el plasma por un mecanismo enzimático que une al
microorganismo con el fibrinógeno. Se realizó la prueba en tubo. A partir de un cultivo de 24
hs en agar tripteína soja de cada una de las cepas, se tomó una colonia y se la suspendió
en plasma de conejo (BD BBL Coagulase Plasmas). La lectura se realizó después de
incubarlas a 37°C durante 1, 4 y 24 hs. La presencia de la enzima coagulasa se manifiesta
ante la formación de un coágulo a partir del plasma inoculado.
-Detección de DNasa
Se estudió la capacidad de producir desoxirribonucleasas responsables de la hidrólisis del
ADN. Se usó el medio de cultivo DNasa. El método de siembra fue en estría a partir de un
cultivo fresco y la incubación a 37°C por 24 hs. Para la lectura se agregó HCl 1N sobre la
zona de crecimiento. Esta acidificación del medio precipita los restos ADN, por lo que las
cepas DNasa positivas presentan un halo claro alrededor de sus colonias.
-Detección de biofilm
Se utilizó el método en microplaca de Christensen. Se repicaron las cepas en caldo tripteína
soja (CTS) suplementado con 1% de glucosa filtrada y se incubaron a 37°C durante 18 hs.
Se realizó una dilución 1/100 en medio fresco y se colocaron alícuotas de 0.2 ml en
policubetas de fondo plano. Se utilizó medio estéril como control negativo. La prueba se
testeó por triplicado. Luego de una incubación a 37°C durante 24 hs se procedió a volcar el
contenido y lavar la microplaca 4 veces con PBS de ph 7.2. Se fijó con acetato de sodio al
2%. Se tiñó con cristal violeta al 0.1%, se lavó con agua destilada estéril y se secó mediante
golpes suaves. La lectura de DO (densidad óptica) se realizó mediante Lector de Elisa
Software MRX Revelation a una longitud de onda de 570 nm. Se calculó el promedio de las
DO obtenidas en los pocillos de las cepas evaluadas y se les restó el promedio de las DO
del control negativo. Se consideraron cepas productoras de polisacárido extracelular
aquellas cuyos pocillos presentaron una DO corregida mayor a cero.

Cocos catalasa negativo:

-Detección de beta hemólisis
La actividad hemolítica de los estreptococos se estudió sembrando las cepas en agar
sangre (agar base sangre suplementado con 5% de sangre equina estéril) mediante el
método de siembra por estría. Los cultivos se incubaron a 37°C en atmósfera enriquecida
con 5% de CO2 durante 24-48 hs. La beta hemólisis se observa por la formación de un halo
claro alrededor de las colonias, producto de la lisis completa de los eritrocitos del medio.
-Detección del antígeno de Lancefield
Se utilizó el test de aglutinación de látex (Oxoid) para detectar el antígeno de Lancefield. Se
realizó una suspensión bacteriana a la que se le adicionó la enzima provista por el kit
comercial. Se incubó en baño termostático a 37°C alternando con la agitación del tubo con
la suspensión vigorosamente durante los primeros 5 minutos y luego se continuó con la
incubación por 5 minutos más. Se colocó una gota del extracto obtenido en cada uno de los
cuadrados de la tarjeta de reacción y una gota de cada reactivo (A, B, C, D, F, G) en el área
correspondiente. Se mezclo con palillo y se hizo rotar la tarjeta suavemente. La prueba se
considera positiva si aparece aglutinación en 30 segundos.
-Determinación de capacidades bioquímicas y fermentación de azúcares
Se identificaron las cepas mediante sus capacidades bioquímicas utilizando la galería API
20 STREPT (Biomerieux). La misma se compone de 20 microtubos que contiene sustratos
deshidratados para la detección de actividades enzimáticas y de fermentación de azúcares
que se inoculan con una suspensión densa (superior a 4 de la escala de Mc Farland). La
incubación es en cámara húmeda a 37°C. Las reacciones se traducen en variaciones de
coloración, espontáneas o reveladas mediante la adición de reactivos. La galería incluye las
siguientes pruebas bioquímicas: Voges Proskauer, hidrólisis de ácido hipúrico, hidrólisis de
esculina, pirolidonil arilmilasa, alfa galactosidasa, beta glucuronidasa, beta galactosidasa,
fosfatasa alcalina, leucina amino peptidasa y arginina dihidrolasa. Además incluye la
fermentación de los siguientes azúcares: ribosa, arabinosa, manitol, sorbitol, lactosa,
trehalosa, inulina, rafinosa, almidón y glicógeno. Los resultados de estas reacciones se
escribieron en una tabla de lectura que asigna un valor numérico a cada prueba
obteniéndose así un código. La identificación se logra mediante el ingreso de ese código en
el software de identificación.

Se estudiaron fenotípicamente las cepas identificadas como See a través de la capacidad

de producir biofilm en presencia y ausencia de hidratos de carbono y mediante su perfil de
sensibilidad antibiótica:
-Detección de Biofilm
Se utilizó el método en microplaca de Christensen en CTS y en CTS suplementado con 1%
de glucosa filtrada. Se trabajó por triplicado.
-Pruebas de Sensibilidad antibiótica:
Se utilizó el método de disco en placa de agar según Bauer-Kirby recomendado por el
NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standars 2006) para Streptococcus sp.
El medio utilizado fue agar de Mueller-Hinton (Difco) suplementado con 5% de sangre
equina estéril y la incubación fue a 35 – 37°C por 24 hs en atmósfera de 5% de CO 2. La
lectura se realizó mediante la medición de los halos de inhibición y posterior comparación
con los puntos de corte indicados en las tablas del NCCLS. Los antibióticos probados
fueron: penicilina G, cefotaxime, eritromicina, enrofloxacina, ciprofloxacina y TMS.

RESULTADOS
Aislamiento e identificación bacteriana:
A partir de las bacterias catalasa positiva, se hallaron 20 cepas OF positivas, sensibles a la
furazolidona y capaces de crecer en agar manitol salado acidificando el medio,
identificándose como S aureus. Todos los microorganismos catalasa negativo presentaron
beta hemólisis y pertenecieron al grupo C de Rebecca Lancefield. Mediante las
características bioquímicas y fermentativas estudiadas con el sistema API 20 STREPT
(Biomerieux) se identificaron 9 cepas de See.

Caracterización de las cepas de S aureus:

-Coagulasa: Las cepas de referencia fueron positivas a la prueba. La ATCC 29213 coaguló
el plasma luego de una hora de incubación, la ATCC 25923 a las 4 hs y la ATCC 6538 a las
24 hs. De las 20 cepas aisladas, 17 resultaron coagulasa negativo (UBA 1, UBA 2, UBA 4,
UBA 5, UBA 6, UBA 7, UBA 8, UBA 9, UBA 10, UBA 11, UBA 12, UBA 13, UBA 14, UBA 17,
UBA 18, UBA 19 y UBA 20). Las cepas UBA 15 y UBA 16 coagularon el plasma a las 4 hs
de incubación y la cepa UBA 3 a las 24 hs.
-DNasa: Las ATCC evidenciaron presencia de desoxirribonucleasas mediante la formación
de un extenso halo claro alrededor de la zona de crecimiento.
Las cepas UBA 1, UBA 3, UBA 5, UBA 13 y UBA 15 resultaron negativas a la prueba. El
resto de las cepas fueron positivas, destacándose la formación de un halo similar al de las
cepas de referencia en UBA 16 y UBA 17.

Foto 1: Detección de DNasa en S. aureus. A la izquierda se observa un resultado positivo.

-Biofilm: Se estableció como criterio de evaluación la siguiente escala de DO:

- DO = 0: negativa.
- DO ≥ 0.01 y ≤ 0.05: producción escasa de biofilm.
- DO > 0.05 y ≤ 0.1: producción moderada de biofilm.
- DO > 0.1 producción abundante de biofilm.

Foto 2: Detección de capacidad de producir biofilm en cepas de S. aureus.

Se encontró variación en la capacidad productora de biofilm en las cepas de referencia. La
ATCC 29213 no evidenció producción. Las otras resultaron productoras, la ATCC 25923 en
forma escasa y la ATCC 6538 en forma moderada.
Las cepas UBA 3, UBA 4, UBA 5, UBA 6 y UBA 12 no produjeron polisacárido extracelular.
Se observó formación en forma escasa en las cepas UBA 1, UBA 2, UBA 7, UBA 8, UBA 15,
UBA 19 y UBA 20; de manera moderada en UBA 9, UBA 10, UBA 11, UBA 13, UBA 14, UBA
16 y UBA 18 y abundante en la cepa UBA 17.

Caracterización de las cepas de See:

-Biofilm: Se utilizó el mismo criterio de evaluación establecido para la prueba en S aureus.
Se evidenció escasa capacidad formadora de biofilm en CTS en las cepas UBA 487/07, UBA
393/07, UBA 66/09, UBA 659-1/09, UBA 659-2/09, UBA 685, UBA 726/10 y UBA 728/10. La
cepa UBA 67/09 produjo biofilm en forma moderada.
Ante la utilización de CTS suplementado con 1% de glucosa, no se observó formación de
polisacárido extracelular en las cepas UBA 659-2/09, UBA 66/09, UBA 685/09 y UBA 726/10.
Produjeron biofilm en forma escasa UBA 487/07, UBA 393/07, UBA 659-1/09 y UBA 728/10.
Sólo resultó productora en forma moderada la cepa UBA 67/09.
La ATCC 33398 presentó escasa capacidad productora de biofilm en CTS con y sin
suplementar con glucosa.

-Sensibilidad antibiótica:

PEN CTX ERI ENR CIP TMS

ATCC See 33398 S S S S S S
UBA 393/07 R R S R R S
UBA 487/07 S S S S S S
UBA 66/09 S R S I S S
UBA 67/09 S S I I S I
UBA 659-1/09 S S S S S S
UBA 659-2/09 S R S S S S
UBA 685/09 S S S S S S
UBA 726/10 S S S S S R
UBA 728/10 S S S S S S
Tabla 1: Resultados del antibiograma de See.
Referencias: S: sensible, I: resistencia intermedia, R: resistente, PEN: penicilina, CTX: cefotaxime, ERI:
eritromicina, ENR: enrofloxacina, CIP: ciprofloxacina, TMS: trimetroprim sulfametoxazol.
 Foto 3: Sensibilidad antibiótica de las cepas de See por el método de disco en placa de agar.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Logramos aislar S. aureus de nasofaringe de animales clínicamente sanos. Las cepas
aisladas presentaron variabilidad en los ensayos de patogenicidad realizados. El S. aureus
es coagulasa positivo, lo cual constituye su característica más distintiva (Finegold, S. M.,
1989) aunque existen cepas negativas. Las cepas de referencia presentaron coagulasa y
DNasa siendo variable la capacidad de formar biofilm. La mayoría de las cepas estudiadas
resultaron coagulasa negativa, DNasa positivas y productoras de biofilm. La prueba de
coagulasa en tubo utilizada en este estudio permite detectar la presencia tanto de
coagulasa fija como libre aunque se sugiere que las cepas negativas deberían analizarse
para determinar la capacidad de producir coagulasa libre por otro método. El hallazgo de
factores de virulencia en S.aureus presentes en la microflora nasofaríngea equina es
significativo ya que ante factores predisponentes como estrés, desnutrición, parasitosis, etc.
puede romperse el equilibrio entre el agente y el huésped y producirse enfermedad.
Se aislaron cepas de See a partir de muestras purulentas de animales enfermos de Adenitis
equina y de nasofaringe de caballos clínicamente sanos. Este estado de portador o carrier
es de vital importancia en la epidemiología de la enfermedad.
Se evidenció la potencial capacidad de See para formar polisacárido extracelular. Si bien la
mayoría de las cepas sólo lo hicieron en forma escasa, la detección de este factor de
virulencia en estreptococos es significativa. La adición de glucosa influyó negativamente en
la producción de biofilm. Si bien los estreptococos del grupo C de Lancefield suelen ser
susceptibles a la penicilina (Prescott, J. F., 2009) hallamos cepas resistentes a este y a otros
antimicrobianos por el método de difusión en placa. Sin embargo, los resultados no son
necesariamente indicadores de fracaso terapéutico si tenemos en cuenta lo que sucede en
neumonías o sinusitis por Streptococcus pneumoniae en el humano. La resistencia a la
penicilina (según los puntos de corte del NCCLS) no predice falla de tratamiento si se
relaciona la concentración alcanzada en el sitio de infección con la máxima actividad
bactericida de la penicilina que se logra cuando la concentración del antibiótico es mayor
que la CIM por lo menos durante el 40 – 50% del intervalo entre dosis (Famiglietti, A. 2004).
REFERENCIAS
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