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UNIVERSIDAD AUTONOMA JUAN MISAEL SARACHO

INGENIERIA QUIMICA
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Tema N3

TRABAJO DE INVESTIGACION
El crecimiento de la población a nivel mundial y el aumento del uso del agua para
diferentes actividades, ha incrementado los niveles de contaminación. Esta contaminación
está relacionada con los vertidos de origen doméstico e industrial a los cuerpos de agua. En
el caso de los residuos de origen doméstico, la carga contaminante está representada por
altos porcentajes de materia orgánica y microorganismos de origen fecal. Estos
microorganismos son causantes de enfermedades de origen hídrico, que generan altos
porcentajes de morbi-mortalidad en la población. El control de la calidad microbiológica
del agua de consumo y de vertido, requiere una serie de análisis dirigidos a determinar la
presencia de microorganismos patógenos. El diagnóstico de estos microorganismos,
requiere laboratorios especializados y representa varios días de análisis y costos elevados.
Como alternativa a estos inconvenientes, se ha propuesto el uso de indicadores microbianos
que se puedan identificar mediante el uso de métodos sencillos, rápidos y económicos. Este
trabajo hace una revisión de los principales indicadores de contaminación fecal y su
significado en la evaluación de la calidad del agua
El aumento de este tipo de microorganismos está relacionado con cambios dramáticos en el
ambiente y en la población incrementados por los procesos de urbanización, la expansión
de la pobreza, la ocupación de regiones no habitadas anteriormente, las migraciones no
controladas con gran número de refugiados y desplazados, la facilidad y rapidez en los
desplazamientos y el movimiento creciente de animales y de productos de origen animal. A
esto se suma que la resistencia a los agentes antimicrobianos continúa reduciendo la
eficacia de los medicamentos incrementando los niveles de mortalidad y de costos
sanitarios. Este grupo de microorganismos no está limitado a ninguna región en el mundo
ni se circunscribe a países en desarrollo o desarrollados; representa una amenaza general,
que exige una respuesta coordinada de todos los servicios de salud de todos los países.
Asimismo constituyen una carga financiera que obliga a gastos enormes para el control de
brotes epidémicos y la atención médica y de salud pública
El riesgo de contaminación tanto a nivel humano como ambiental hace necesario el control
de la presencia de microorganismos en el agua. Determinar el tipo de microorganismos
presentes y su concentración proporciona herramientas indispensables para conocer la
calidad del agua y para la toma de decisiones en relación al control de vertidos, tratamiento
de aguas y conservación de ecosistemas
Las bacterias que se encuentran con mayor frecuencia en el agua son las bacterias entéricas
que colonizan el tracto gastrointestinal del hombre y son eliminadas a través de la materia
fecal. Cuando estos microorganismos se introducen en el agua, las condiciones ambientales
son muy diferentes y por consiguiente su capacidad de reproducirse y de sobrevivir son
limitadas. Debido a que su detección y recuento a nivel de laboratorio son lentos y

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laboriosos, se ha buscado un grupo alternativo de indicadores que sean de más rápida y


fácil detección.
Los Streptococcus fecales (o estreptococos del grupo “D” de Lancefield) entran a
formar parte de este grupo.

Estos microorganismos también están considerados como "otros indicadores", los cuales no
están contemplados en la NTN Norma Técnica Nacional (NTN ITINTEC 214.003).
Los estreptococos son bacterias esféricas grampositivas que forman pares o cadenas
durante el crecimiento. Algunos forman parte de la microbiota normal humana, otros se
relacionan con importantes enfermedades humanas atribuibles a una sensibilización hacia
ellos. La clasificación de los estreptococos se ha establecido tomando en consideración la
morfología de la colonia las reacciones hemolíticas, la especificidad serológica
(clasificación de Lancefield), las reacciones bioquímicas, la resistencia a factores físicos y
químicos y finalmente a sus características ecológicas (APHA, 1995).

El grupo de los Enterococos es un subgrupo de los Estreptococos fecales e incluye a


especies como S. faecalis, S. faecium, S. gallinarum y S. avium. Los Enterococos son
diferenciados de otros estreptococos fecales por su habilidad de crecer en medios con 6,5%
de Cloruro de Sodio, a pH 9,6, a 10° C y a 45°C (APHA, 1995). Debido a su resistencia a
estos factores que permiten un mayor tiempo de supervivencia (CABELLI et al, 1976) son
considerados como indicadores de contaminación fecal antigua en contraste con la
presencia de coliformes que indican contaminación fecal reciente (SOARES, 1996).

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El uso de Estreptococos fecales como indicadores de contaminación fecal del agua de
consumo humano no es reciente. En 1928, Green luego de un estudio prolongado concluyó
que Streptococcus faecalis tenía un mayor significado sanitario que Escherichia coli
(Citado por SOARES, 1996). Recientemente los estreptococos fecales han sido
considerados como organismos de supervivencia superior a los coliformes en aguas. A
puntos distantes de la fuente de contaminación, ellos fueron muchas veces los únicos
indicadores de contaminación fecal (CABELLI et al, 1983).

Los estreptococos fecales han sido utilizados con los coliformes fecales para diferenciar la
contaminación fecal del hombre de otros animales de sangre caliente (APHA, 1995). La
razón entre coliformes fecales (CF) y estreptococos fecales (EF) proveen información
acerca de la fuente de contaminación. Un rango mayor de 4 es considerado indicativo de
contaminación fecal humana, un rango menor a 0,7 sugiere contaminación por una fuente
no humana (APHA, 1995).

Los estreptococos fecales rara vez se multiplican en agua contaminada y son más
persistentes que E. coli y las bacterias coliformes. Además los estreptococos son muy
resistentes al secado y pueden ser utilizados para realizar controles sistemáticos después de
la colocación de nuevas tuberías maestras o la reparación de los sistemas de distribución,
así como para detectar la contaminación de aguas subterráneas o superficiales (OMS,
1995).

Cabelli et al (1982), llevaron a cabo una investigación epidemiológica de la calidad de agua


y sus efectos a la salud en playas marinas. Muestras de agua fueron analizadas para
determinar la presencia de coliformes, Enterococos, Pseudomonas aeruginosa y
Clostridium perfringens, como posibles indicadores. Se demostró una correlación entre los
niveles de Enterococos en el agua y una mayor incidencia en enfermedades
gastrointestinales en nadadores que usaron estas aguas.

Estudios realizados por Fleisher y col. (1993) en playas marinas y Seyfried y col. (1985) en
agua dulce, demostraron que existe una relación matemática entre la densidad de
Estreptococos fecales y la aparición de casos de gastroenteritis, no hallando asociación
entre esta enfermedad y Coliformes fecales. Asimismo en Israel, Fattal y col. (1987)
analizando aguas marinas para la presencia de Escherichia coli, Enterococos y Coliformes
fecales, concluyeron que es mayor el riesgo de contraer enfermedades entéricas en aguas
con un alto nivel de Enterococos.

En el Perú, Vergaray y Méndez (2001), modificaron el método de Numeración de


Estreptococos fecales y Enterococos por el Método de Tubos múltiples establecido por la
APHA (1995), utilizando Agar M-Enterococos en lugar de Caldo Púrpura de Bromocresol,
obteniendo resultados satisfactorios.

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1. DETERMINACION DE ESTREPTOCOCOS FECALES EN
AGUA
Determinar la presencia de Estreptococos fecales en una muestra de agua mediantes la
técnica del Numero Más Probable (NMP) usando tubos múltiples

ESTREPTOCOCOS FECALES
DEFINICION:
Inicialmente, los enterococos pertenecían al género Streptococcus grupo D de Lancefield.
En 1970, fueron oficialmente clasificados por Kalina como un género independiente, la
división de los géneros se basó en estudios taxonómicos y moleculares.
Los enterococos son células esféricas u ovoides, de tamaño 0,6 - 2,0 × 0,6 - 2,5 µm. Se
presentan en forma de pares o de cadenas cortas. Son cocos Gram positivos, no formadores
de endosporas y no mótiles. Son microorganismos anaerobios facultativos,
quimiorganotrofos, con metabolismo fermentativo. Su crecimiento óptimo es a 37 ºC.
Tienen la habilidad de crecer en presencia de 6,5 % de NaCl, a 10 y 45 ºC y pH 9,6. Son
capaces de hidrolizar la esculina en presencia de 40 % de bilis y poseen la enzima
pirrolidonil arilamidasa. Las colonias en los medios agarizados, generalmente se presentan
incoloras a grises, y tienen de 2 a 3 mm de diámetro a los dos días de incubación.51 Según
Porte et al., pueden presentar hemólisis de tipo α, β o pueden ser no hemolíticos, en tanto
Díaz et al. Plantean que una misma cepa puede variar en sus propiedades hemolíticas en
dependencia del animal del que provenga la sangre empleada en el medio de cultivo.
Los enterococos también pueden estar presentes en suelo, alimentos, agua, plantas,
animales e insectos y suelen considerarse buenos indicadores de contaminación fecal
debido a que son muy resistentes a condiciones adversas como la congelación y la
desecación.
El uso de Enterococcus como un indicador de contaminación fecal de aguas con fines
recreativos fue recomendado por la Agencia de Protección Ambiental de los Estados
Unidos (USEPA, de las siglas en inglés) en 1986.
Al respecto, Vergaray et al. consideran al género Enterococcus como el indicador
bacteriológico más eficiente para evaluar la calidad de agua de mar para uso recreativo,
debido a que es muy resistente a las condiciones salinas de este medio y además, está
relacionado directamente con gastroenteritis, enfermedades respiratorias, conjuntivitis y
dermatitis, entre otras.

Según Díaz et al. La presencia de E. faecalis y E. faecium es usada frecuentemente para


indicar contaminación de origen fecal, E. faecalis es considerado como un indicador de

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contaminación fecal de fuentes humanas, mientras que E. faecium y otras especies indican
contaminación de otras fuentes.

FUNDAMENTO:
Determinación del número de estreptococos mediante siembra de distintos volúmenes del
agua a analizar en series de tubos conteniendo medio de cultivo liquido glucosado con
agentes inhibidores selectivos e incubación a temperatura adecuada. El procedimiento
comprende las pruebas: presuntiva y de confirmación de estreptococos fecales.
MATERIAL:
Pipetas graduadas en ml y divididas en 1,10 estériles.
Estufa regulada a 37 ˚C (± 1 ˚C).
MEDIOS DE CULTIVO:

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 Preparación del medio glucosafosfatos-azida (Rothe) simple.

Peptona bacteriológica 20 g
Glucosa 5 g
Cloruro sódico 5 g
Fosfato bipotásico (PO4HK2) 2,7 g
Fosfato monopotásico (PO4H2K) 2,7 g
Azida sádica 0,2 g
Agua destilada 1.000 ml
Disolver los componentes por calentamiento, ajustar el pH y repartir a razón de 10 ml
por tubo.
Para los tubos de la serie que reciban volúmenes de agua de 10 ml deberá prepararse el
medio a doble concentración, duplicando las cantidades de los componentes en el
mismo volumen de agua destilada y distribuyéndola a razón de 10 ml por tubo.
Para los tubos o frascos de la serie que tengan que recibir volúmenes de agua de 50 ml
se utilizará el mismo medio concentrado, pero distribuyéndolo a razón de 50 ml por
cada uno.
Esterilizar en autoclave a 121 ˚C durante quince minutos. El pH final del medio deberá
ser 6,8-7
 Preparación del medio de cultivo giucosa-fosfatos azida-etilvioleta (Litsky).

Peptona bacteriológica, 20 g
Glucosa, 5 g
Cloruro sódico, 5 g
Fosfato bipotásico (PO4HK2), 2,7 g
Fosfato monopotásico (PO4H2K), 2,7 g
Azida sádica, 0,3 g
Solución acuosa de etil-violeta al 0,01 por 100 (P/V), 5 ml
Agua destilada, 1.000 ml
Disolver los componentes, menos .1 etil-violeta, por calor suave, ajustar el pH, añadir el
etil-violeta a razón de 10 ml por tubo.
Esterilizar en autoclave a 121 ˚C durante quince minutos.
El pH final del medio deberá ser 6,8-7.

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Para ambos medios se recomienda utilizar tubos con tapón de rosca para su cierre
hermético. No se utilizará algodón ya que debe evitarse la evaporación del medio
durante el almacenamiento.

PROCEDIMIENTO:
 Prueba presuntiva.

Disponer en una gradilla una serie de tubos con medio de Rothe, según la tabla de
NMP que se haya elegido.
Mediante pipetas estériles, sembrar los tubos de la serie, tomando los volúmenes del
agua, ya homogeneizada, que se indican en la tabla.
Homogeneizar los tubos sembrados.
Incubar a 37 ºC (± 1 ºC) durante cuarenta y ocho horas (± tres horas).
Se consideran tubos positivos aquellos que presenten enturbiamiento y/o sedimento.

 Prueba de confirmación.

Todos los tubos positivos de la prueba presuntiva se someterán a la prueba de


confirmación.
De cada tubo positivo presuntivo homogeneizar su contenido y transferir tres asas al
tubo con medio de Litsky.
Si el sedimento es escaso o insuficiente, es imprescindible eliminar previamente a la
homogeneización el líquido sobrenadante.
También puede tomarse directamente el sedimento por capilaridad, mediante pipeta
Pasteur.
Incubar los tubos resembrados a 37 ˚C (± 1 ˚C).
Si a las veinticuatro horas no se observa ni enturbiamiento ni sedimento violeta
prolongar la incubación hasta cuarenta y ocho horas (± tres horas).

 Lectura y expresión de resultados.

Se considerarán tubos positivos aquellos que presenten enturbiamiento y/o


sedimento de color violeta.
Se calculará por tabulación el número más probable (NMP) de estreptococos fecales
referidos a 100 ml de agua.

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BIBLIOGRAFIA:

https://es.wikipedia.org/wiki/N%C3%BAmero_m%C3%A1s_probable
http://cidta.usal.es/residuales/libros/leg/06Metodos%20oficiales%20de%20analisis
%20microb.pdf
https://es.wikipedia.org/wiki/Streptococcus
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bibvirtual/tesis/basic/marchand_p_e/anteced.htm
https://www.google.com/search?
ei=GW0VXYW3I8ev5wKutJP4CQ&q=aplicaciones+en+la+industria+estreptococos+fecales&
oq=aplicaciones+en+la+industria+estreptococos+fecales&gs_l=psy-ab.3...8901.12483..130
04...0.0..0.581.4225.0j9j5j1j1j1......0....1..gws-wiz.......0i71.t83yXh7a7NU
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-03002014000100001

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2. INVESTIGACION DE COLIFORMES TOTALES Y
FECALES EN DESECHOS SOLIDOS Y COMPOSTA

COLIFORMES.
Escherich, en 1885, aisló en heces humanas
bacterias que se encontraban de manera consistente
y en gran cantidad, por lo que las llamó
"organismos característicos de las heces humanas",
dándoles el nombre de Bacterium coli commune y
Bacterium lactis aerogenes. Migula en 1895,
designó a la primera Escherichia coli commune r
posteriormente, se demostró que estas especies en
realidad eran un conjunto bacteriano de especies y
variedades de especies. En la actualidad, el grupo
coliforme se define como todos aquellos bacilos
cortos, gram negativos, aerobios y anaerobios
facultativos, que fermentan la lactosa con
producción de gas en 48 horas a 35 \C. Y los
coliformes fecales se definen como todos aquellos
bacilos cortos, gram negativos, aerobios y
anaerobios facultativos, capaces de fermentar
lactosa con producción de ácido y gas en 24-48 horas a 44 b 0.5 %C.
La principal diferencia entre los coliformes totales y fecales es la capacidad de estos
últimos de crecer a mayor temperatura en condiciones de laboratorio. Desde el punto de
vista salud, este grupo es más importante que los coliformes totales, dado que se relaciona
más con la probabilidad de encontrar patógenos excretados (bacterias, parásitos y virus
entéricos).
Las ventajas de este grupo como indicador son:
- El 95% de los coliformes fecales, dan positiva la prueba detemperatura
- Pueden estar ausentes si la contaminación no es de origen fecal
- Sobreviven menos tiempo que los coliformes totales, por lo que permiten suponer
contaminación reciente, si se encuentran en concentraciones altas
- Son más exigentes que los coliformes totales para reproducirse en el ambiente
extraintestinal

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- Los procedimientos de laboratorio para su cuantificación son relativamente sencillos Sin
embargo, algunas cepas dan negativa la prueba de temperatura
en el laboratorio; se ha visto que tienen la capacidad de reproducirse en aguas ricas en
nutrimentos, en sedimentos y aún en aguas poco contaminadas; algunas cepas de
Escherichia coli sobreviven menos tiempo que Salmonella en aguas a bajas temperaturas y
algunas son patógenas al hombre.
5 TÉCNICA DE TUBOS MULTIPLES.
5.1 Diluciones seriadas.
Los análisis microbiológicos del agua, ya sea para la prueba de tubos múltiples o de filtro
de membrana requieren del empleo de cantidades variables de muestra, ésto se logra
mediante el proceso de diluciones decimales seriadas, las cuales se deben utilizar cuando se
siembren volúmenes de muestra menores de lmL-
El diluente se debe preparar en tubos con tapa de rosca añadiendo 9 mL de éste para la
preparación de diluciones 1:10 (IO**1) o en botellas con tapón esmerilado con capacidad
para 99 mL para la preparación de diluciones 1:100 (10~2). Es recomendable destinar tubos
y botellas exclusivamente para dilución de muestras, conviene calibrar los tubos y las
botellas de dilución a 9 y 99 mi respectivamente, marcando el nivel con un lápiz de
diamante. Este procedimiento permite al técnico descartar tubos o botellas que contengan
volúmenes diferentes a los requeridos para realizar adecuadamente las diluciones decimales
seriadas.
El diluente ideal es aquel que no provoca cambios en el número de bacterias presentes en la
muestra y que no deprime la recuperación de organismos debilitados. La sobrevivencia de
microorganismos en un determinado diluente puede ser muy variable, y está influenciada
por el tiempo de permanencia en éste, temperatura, pH, gradiente osmótico, capacidades
amortiguadora y quelante, presencia de iones calcio, magnesio y hierro. El agua destilada
no es recomendable como diluente puesto que carece de iones metálicos esenciales asi
como de capacidad quelante y amortiguadora. Se han utilizado diferentes tipos de
soluciones para dilución, las más comunes son la peptonada y la de fosfatos. La primera
contiene 0.1 de peptona en agua destilada y se recomienda en la detección de organismos
debilitados provenientes de aguas residuales industriales o de aguas superficiales con
contenidos altos de iones de metales pesados.
La segunda, se prepara a partir de una solución madre (A), que lleva 34.0 g de KH2PO4,
pH 7.2, y de otra (B) preparada con 50 g de MgSO4*7H2O por litro de agua destilada. Para
preparar el diluente fosfatado, se agregan a un litro de agua destilada 1.25 mL de la
solución A y 5.0 mL de la B, el producto final deberá tener un pH de 7.2bO.l. Esta solución
de fosfato y magnesio megora la recuperación de bacterias con lesiones metabólicas
inducidas por agua de alta calidad o por aguas con contenidos altos de iones de metales
pesados. Se ha observado que cuando se utiliza el agua peptonada como diluente a
temperatura ambiente, puede haber multiplicación bacteriana cuando el tiempo de

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preparación de las diluciones y el sembrado exceden de 40 minutos, por esta razón, se
requiere que cuando se use este tipo de diluente estos pasos no tarden más de 30 minutos.
Las diluciones no se deben prepara bajo la luz del sol, ya que ésto representa un efecto
adverso para las bacterias presentes en la muestra, las que en muchas acasiones ya se
encuentran debilitadas.
Se recomienda un mínimo de tres diluciones seriadas para asegurar la obtención de datos
cuantitativos. Cuando se carezca de datos acteriológicos previos de una muestra, es
recomendable emplear 5 diluciones decimales para contar con una certeza razonable de que
se va a obtener un punto limite entre resultados positivos y negativos. Una dilución decimal
se obtiene mezclando 9 partes de diluyente y una parte de muestra, esta mezcla debe ser
homogenizada mediante pipeteo o utilizando un homogenizador. Un aspecto muy
importante en este procedimiento es el cambiar de pipeta cada vez que se haya despachado
líquido para evitar errores por acarreo de microorganismos.
Una vez formada una dilución decimal el procedimiento se repite en forma seriada hasta
alcanzar la dilución deseada.
5.2 Técnica de tubos multiples.
La prueba de tubos múltiples constituye un método estandarizado para la determinación de
la densidad de bacterias indicadoras de contaminación. En esta prueba, réplicas de tubos de
medios de cultivo específicos, son inoculados con diluciones decimales de una muestra
dada de agua. La densidad bacteriana es calculada por medio de fórmulas de probabilidad
que estiman el número más probable de bacterias para producir ciertas combinaciones de
resultados positivos (como turbidez o formación de gas) y negativos.
Prueba confirmativa coliformes
Cada tubo del ensayo previo que muestre formación de gas en el tubo Durham, se siembra
con una asa de inoculación en tubos de ensayo son caldo verde brillante dotados de tubos
Durham. Luego se incuba durante 48p3 horas a 35b_.5^C. Los tubos con formación de gas
se consideran como positivos, con respecto a bacterias coliformes.
Prueba confirmativa coliformes fecales
Para la prueba confirmativa de coliformes fecales, se realizan inoculaciones en caldo EC,
provenientes de los tubos del ensayo previo que mostraron formación de gas, incubar
durante 24p_2 horas a 44.5b_0.2%C. Bajo estas condiciones la formación de gas en caldo
EC indica el origen fecal de las bacterias coliformes.
Cuando se analizan muestras de agua potable, se utilizan 5 tubos de fermentación, cada uno
con contenidos de 10 o 100ml de la muestra y mínimo 3 diluciones. Pero resulta impractico
usar porciones de 100ml.

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Esta técnica puede también ser usada para sedimentos, haciendo una dilución de 10" . Se
pesan 50 gr de muestra (sólida o semisólida) y se adicionan 450 mi de agua de dilución y se
agita por 1 ó 2 minutos.
Los resultados del análisis de los tubos de réplica y diluciones son reportados en términos
de el Número Más Probable (NMP).
El valor numérico de la estimación del contenido bacteriano es determinado por la dilución
que mostró ambos resultados positivos y negativos.
La mejor evaluación de la calidad sanitaria del agua depende de la interpretación de
resultados de la técnica de los tubos múltiples o de otros métodos, posiblemente más
precisos y de toda la demás información relativa al agua que pueda ser obtenida por
reconocimiento de la zona.
Determinación del número más probable
Codificar los resultados de la serie de diluciones en los tubos de la siguiente manera: si
inicialmente son inoculadas 5 porciones de 10 mL de muestra, 5 de 1 mL y 5 de 0.1 mL, y
los resultados positivos fuesen respectivamente 5, 3 y 0, éstos se codificarán como 5-3-0. El
código obtenido es buscado en la tabla del NMP (cuadros 4 y 5) y se registra directamente
el NMP en 100 mL.

PRÁCTICA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES


EN DESECHOS SOLIDOS

I. OBJETIVO

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Determinar la presencia de coliformes totales y fecales en un desecho sólido por el método
del Número más Probable (NMP) utilizando la técnica de tubos de fermentación múltiple.
II. INTRODUCCION

Al igual que en el agua, es importante, sobre todo desde el punto de vista sanitario, la
realización del análisis microbiológico de los desechos sólidos para conocer la naturaleza
de los microorganismos presentes por ejemplo en las basuras para lo cual se requiere de una
muestra representativa del lugar en estudio la cual llega al laboratorio una vez que se ha
llevado a cabo todo el proceso de recolección, cuarteo y molienda correspondiente.

III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS

 Muestra de Basura ó Composta. Mínimo 50 g.


 Matraz Erlenmeyer de 1 L conteniendo 450 mL de agua peptonada estéril al
0.1%.
 Homogeneizador Waring Blendor estéril.
 Mechero Bunsen.
 Cerillos ó encendedor.
 Matraz de 500 mL estéril.
 7 tubos de 18 x 150 mm conteniendo 9 mL de agua de dilución estéril, cada
uno.
 7 Pipetas de 1 mL estériles.
 20 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo 10 mL de caldo
lactosado estéril de concentración sencilla, cada uno.
 20 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo 10 mL de caldo
bilis verde brillante estéril, cada uno.
 15 tubos de 18 x 150 mm con campana Durham, conteniendo 10 mL de caldo
E.C. estéril, cada uno.
 2 Cajas de Petri conteniendo Agar Endo estéril.
 5 Tubos de 18 x 150 mm conteniendo agar nutritivo inclinado estéril.
 Colorantes para Tinción de Gram.
 Asa Bacteriológica.
 Gradillas para tubos de 18 x 150 y de 13 x 100 mm.
 Agitador de tubos Vortex.
 Incubadora a 35 °C.
 Baño Incubador Fecal a una temperatura constante de 44.5 °C.
 Microscopio.
 Aceite de inmersión.
 5 Tubos de 13 x 100 mm conteniendo medio de SIM estéril.
 5 Tubos de 13 x 100 mm conteniendo medio de MR-VP estéril.
 5 Tubos de 13 x 100 mm conteniendo medio de Simmons estéril.
 Reactivos para ensayos bioquímicos.

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IV. TECNICA

PRUEBA PRESUNTIVA

1. Pesar 50 g de muestra (basura cruda o composta).

2. Agregar 450 mL de agua peptonada estéril al 0.1% para obtener una dilución de 10-1.
3. Llevar la muestra diluida al homogeneizador Waring Blendor estéril.

4. Agitar durante 3 minutos a velocidad máxima (8,000 rpm).

5. Vaciar el homogeneizado en un matraz estéril y etiquetar.

6. Preparar 7 tubos de 18 x 150 mm con 9 mL de agua de dilución estéril.

7. Tomar una alícuota de 1 mL del homogeneizado con una pipeta estéril y llevarlo a uno de
los tubos para obtener una dilución de 10-2.

8. Agitar el tubo y tomar alícuota de 1 mL con otra pipeta estéril y llevarlo a otro tubo para
obtener dilución de 10-3.

9. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilución de 10-4 o hasta donde sea
necesario.

10. Inocular asépticamente con 1 mL de muestra por quintuplicado, tubos de fermentación


conteniendo caldo lactosado o caldo lauril triptosa, a partir de las últimas 4 diluciones.
11. Incubar por 24 horas a 35 °C.

12. Observar turbidez y producción de gas:

INTERPRETACION:

Después de 24 horas de incubación:

• Producción de turbidez y gas:

Prueba presuntiva positiva.

Efectuar prueba confirmativa para todos los tubos positivos.

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• Ausencia de gas o producción de gas dudosa:

Incubación adicional por 24 horas más. (Total 48 horas).

Después de 48 horas de incubación:

• Si se observa turbidez y producción de gas: Prueba presuntiva positiva.

Efectuar prueba confirmativa para todos los tubos positivos.

• Ausencia de gas para todos los tubos aun cuando haya turbidez:

Prueba presuntiva negativa, por lo tanto, GRUPO COLIFORME AUSENTE.


PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TOTALES.

1. A partir de los tubos que presentaron producción de gas durante la prueba presuntiva,
inocular asépticamente con asa bacteriológica una muestra (3 asadas), en tubos de
fermentación conteniendo caldo LBVB (Lactosa Bilis Verde Brillante).

2. Incubar 48 horas a 35 °C.

3. Observar turbidez y producción de gas dentro de la campana Durham.


NOTA:

Si a las 24 h de incubación todos los tubos dieran positivos, se da por


terminado el análisis y se procede a hacer los cálculos de NMP.

INTERPRETACION:

• Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe


turbidez: Se consideran negativos, estableciéndose el Código
0,0,0 para efecto del cálculo del NMP.

• Si en los tubos se observa presencia de turbidez y gas: POSITIVOS.

Establecer el Código y Calcular el Número Más Probable usando las tablas


correspondientes.

• Si todos los tubos dan negativos ó todos dan positivos, con base en los grados de dilución
analizados, considerar la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución

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menores (mayores volúmenes de muestra) ó mayores (menores volúmenes de muestra),
respectivamente.

PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES FECALES.

1. A partir de los tubos que presentaron producción de gas durante la prueba presuntiva,
inocular asépticamente con asa bacteriológica una muestra (3 asadas), tubos de
fermentación conteniendo caldo EC (Escherichia coli).

2. Incubar en baño de agua durante 24 horas a 44.5°C.

3. Observar turbidez y producción de gas dentro de la campana Durham.

INTERPRETACION:

• Si en ninguno de los tubos se observa producción de gas, aun cuando se observe


turbidez: Se consideran negativos, estableciéndose el Código
0,0,0 para efecto del cálculo del NMP.

• Si todos los tubos dan negativos ó todos dan positivos, con base en los grados de dilución
analizados, considerar la necesidad de repetir el análisis a partir de grados de dilución
menores (mayores volúmenes de muestra) ó mayores (menores volúmenes de muestra),
respectivamente.
• Presencia de turbidez y gas: POSITIVA.

Calcular el Número Más Probable usando las tablas correspondientes.

DIFERENCIACION DE COLIFORMES.

1. A partir de tubos positivos con prueba Confirmativa, inocular con el asa bacteriológica en
condiciones asépticas sobre agar Endo-C, con la técnica de dilución por estría con el objeto
de obtener colonias aisladas.

2. Incubar durante 24 horas a 35 °C.

3. Observar el desarrollo. Los coliformes forman colonias rojas sobre agar EndoC. Las
colonias de Escherichia coli muestran además, brillo metálico verdoso.

4. Tomar material de las colonias de coliformes características que estén aisladas y sembrar en
cada caso en un tubo con agar inclinado estéril.

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5. Incubar durante 24 horas a 35°C.

6. A partir de los cultivos de agar inclinado, preparar frotis, teñirlos al Gram y examinar al
microscopio:

Si se observan solamente bacilos cortos Gram negativos, no esporulados, se confirma la


pureza de los cultivos.

7. A partir de cada uno de los cultivos puros, inocular los siguientes medios: SIM, MR-VP y
Citrato de Simmons, para efectuar las reacciones del IMVyC:

I = Indol.
M = Rojo de Metilo.
V = Voges Proskauer.
C = Citrato, como única fuente de carbono.
8. Incubar a 35 °C durante 24 horas.
9. Realizar los siguientes ensayos bioquímicos:
INDOL:

Cubrir el cultivo en medio de SIM con aproximadamente 5 mm de espesor con el reactivo


de Kovacs y dejar reposar durante 2 minutos.

Reacción positiva: Capa reactiva color cereza.


Reacción negativa: Capa reactiva NO rojo cereza.

ROJO DE METILO:

Añadir 5 gotas de solución indicadora de rojo de metilo a 5 mL de cultivo (MR-VP).


Reacción positiva: Inequívoco color rojo.
Reacción negativa: Inequívoco color amarillo.

La aparición de un tono de color intermedio permite deducir con gran probabilidad la


existencia de un cultivo impuro.

VOGES PROSKAUER:
A 1 mL de cultivo (MR-VP), añadir 0.6 mL de solución de alfa-naftol al 5% y 0.2 mL de
solución de KOH al 40%. Si la reacción no da positiva dentro de los primeros 10 minutos
de reposo, leer la reacción después de 2-4 horas.

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Reacción positiva:

Formación de un anillo de color rojo ladrillo o rojo carmín en la superficie del medio el
cual va bajando poco a poco a través del cultivo.
Reacción negativa:

Ausencia de coloración roja.


CITRATO:

Observar el cultivo en el medio de Simmons.


Reacción positiva:
Crecimiento y en la mayoría de los casos vire del color verde del medio a verde azulado ó
totalmente azul.

Reacción negativa:
Sin crecimiento.
10. De acuerdo a los resultados, consultar las tablas bioquímicas correspondientes para la
identificación de los coliformes.

BIBLIOGRAFIA
http://www.azc.uam.mx/cbi/quimica/microbiologia/p22
https://www.ircwash.org/sites/default/files/245.11-91AD-9090.pdf

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FACULTAD CIENCIAS Y
TECNOLIGIA

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INGENIERIA QUIMICA
MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

MATERIA: MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL


TEMA: DETERMINACION DE ESTREPTOCOCO FECALES EN AGUA
DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES EN
DESECHOS SOLIDOS
GRUPO: LILIBETH ARROYO GUTIERREZ CODIGO: 8
DAMARIS SUAREZ PINEDO 38
CAROLINA RIOS JURADO
YULENIA VALDEZ
FECHA:

20