Manual de Prácticas de La Leche

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO
INSTITUTO DE ALIMENTOS
MAESTRÍA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

AGROALIMENTARIA
INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
MANUAL DE PRÁCTICAS DE LA ASIGNATURA: CALIDAD

DE LA LECHE
(Tercera edición)
ARMANDO SANTOS MORENO
2018
1

CONTENIDO
INTRODUCCIÓN. 3
Práctica 1. Presentación de la asignatura y normatividad relacionada y videos de 6
ordeña y colecta en los diferentes Sistema de Producción de Leche en México.
UNIDAD I: Calidad Fisicoquímica de la leche
Práctica 2. Densidad. 14
Práctica 3. Contenido de sólidos no grasos (SNG) 20
Práctica 4. Punto Crioscópico 28
Práctica 5. Contenido de grasa 32
Práctica 6. Contenido de lactosa 39
Práctica 7. Contenido de proteínas 47
UNIDAD 2: Calidad Sanitaria de la leche
Práctica 8. Pruebas sanitarias indirectas 54
Práctica 9. Pruebas sanitarias directas 69
Práctica 10. Pruebas de fosfatasa y peroxidasa así como fosfatasa residual 75
Práctica 11. Pruebas directas e indirectas de células somáticas 88
UNIDAD 3: Presencia de adulterantes en la leche
Práctica 12. Presencia de antibióticos así como la adición de agua 104
Práctica 13. Pruebas cuantitativas y cualitativas de diferentes adulterantes 112
(agua oxigenada, derivados clorados, formaldehído,
neutralizantes y sales cuaternarias de amonio
Práctica 14. Presencia de materiales extraños 129
Unidad IV. Uso de Instrumentos Automatizados para medir la calidad
fisicoquímica de la leche
Práctica 15. Uso del EcoMilk y LactoScan para la determinación de algunas 133
parámetros fisicoquímicos en la leche
Práctica 16. Uso del MilkoScan para la determinación de algunos parámetros 138
fisicoquímicos en la leche
2

INTRODUCCIÓN
Actualmente, atendiendo a un enfoque productor/usuario, la calidad de la leche

puede definirse como: la suma de las características que la definen (nutritivas,
composicionales, higiénicas, microbiológicas, sensoriales, tecnológicas, etcétera)
y que concurren a proporcionar una mayor o menor satisfacción al utilizador, ya
sea éste consumidor intermedio (industrial) o final.
Sin embargo, todo alimento, y en especial la leche, a partir de su obtención sufre

un proceso de deterioro en sus propiedades originales; por ejemplo en su
composición, en sus características sanitarias y sensoriales.
Los principales agentes causantes de este deterioro son los microorganismos y las
enzimas; éstas son de origen microbiano, o propias del alimento (vg. en la leche,
la lactosa, las lipasas y proteasas). A su vez, la actividad microbiana y enzimática
es afectada por diversas variables fisicoquímicas del alimento o de su entorno, por
ejemplo: la temperatura, la actividad del agua, el pH, la fuerza iónica, la humedad
relativa ambiental, etcétera.
Por regla general, entre mayor sea el contenido de agua del alimento (también, su
actividad de agua, aw), más susceptible es de deteriorarse con el tiempo. Es por
ello que la leche, que contiene más de 85% de agua, es quizá uno de los
alimentos de menor vida útil, si es que no se toman medidas para controlar la
actividad de los agentes de deterioro, tan pronto como se obtiene por la ordeña.
Empero, si bien la calidad de la leche cruda (y por extrapolación, de cualquier

lacticinio) debe ser concebida como la suma de un conjunto de atributos de
distinta índole, para operar prácticamente en la realidad, es decir, con criterio
tecnológico, es evidente la utilidad de seccionar la noción de “calidad integral” (la
suma de atributos), en componentes parciales. Así, se puede hablar de calidad
composicional, fisicoquímica, microbiológica, sanitaria, sensorial, tecnológica,
etcétera.
3

Cada una de estas “calidades” puede revelarse por la medición de variables (o
parámetros), concretos, por ejemplo:
• Calidad composicional: % de sólidos totales, % de grasa, % de proteínas,

etcétera.
• Calidad fiscoquímica: el pH de la leche, su acidez titulable, su densidad, su

punto crioscópico, viscosidad, estabilidad al alcohol, etcétera.
• Calidad sanitaria: carga mesofílica total, cuenta de coliformes, carga de

células somáticas, presencia de inhibidores, presencia de adulterantes,
etcétera.
• Calidad sensorial: color, sabor, olor.
• Calidad tecnológica: fermentabilidad, “cuajabilidad”, estabilidad al calor,

etcétera.
La apreciación, o mejor, la evaluación de la calidad de la leche cruda es

indispensable para fines concretos, por ejemplo:
La pertinencia de su empleo para elaborar productos seguros (inocuos)

para el consumidor.
La selección de la leche para elaborar productos lácteos concretos, según
las exigencias del producto y el proceso (vg. un yogur, una leche UHT, o
cajeta).
El pago de la leche, como materia prima, según su calidad: composicional,
sanitaria y tecnológica.
Finalmente, la leche cruda y los lacticinios con ella elaborados deben cumplir con
normas de calidad, técnicas y sanitarias, para garantizar su inocuidad frente a los
consumidores, y facilitar su desplazamiento en los canales de comercialización,
nacionales y extranjeros.
A la leche cruda (llamada “bronca” en México), se le puede practicar numerosas

pruebas de calidad, sin embargo, algunas son más frecuentes, porque se
consideran básicas, entre ellas se hallan: la de densidad, porcentaje de grasa,
4

acidez, de estabilidad al alcohol, estabilidad al calor, reductasa (con azul de
metileno y resazurina), neutralizantes y conservadores, presencia de inhibidores, y
sólidos totales, (por densimetría y refractometría).
A continuación se presenta un conjunto de prácticas que contienen pruebas

relativamente sencillas para apreciar y evaluar la calidad de la leche cruda
empleada como materia prima en la industria de lacticinios.
5

Práctica 1
Título: Presentación del programa de la asignatura y normatividad relacionada y

videos de ordeña y colecta en los diferentes Sistema de Producción de
Leche en México.
Duración: 3.0 horas
Introducción
En este manual de análisis de leche se considerará sólo la leche de vaca y

por lo tanto, se hablará únicamente de este tipo de leche cuando se refiera a
leche.
La producción de leche sucede principalmente de tres Sistemas: el

intensivo, el familiar o de traspatio y el extensivo o de doble propósito.
La ordeña en los Sistemas de Producción Familiar y el Extensivo se realiza

ya sea manual o mecánica y el almacenamiento en el rancho de este fluido es
generalmente a temperatura ambiente. La colecta en estos dos sistemas también
se efectúa a temperatura ambiente.
En el Sistema de Producción Intensivo, la ordeña es mecánica y la colecta

se realiza principalmente, de manera refrigerada.
Objetivo de la práctica
Analizar los Sistemas de Producción de Leche así como la colecta y los

tipos de ordeña para la comprención de la calidad de leche México.
6

Metodología
Sistemas de producción
Ordeña
Colecta
Normatividad
Recursos materiales y equipo
1. Distintos videos sobre Sistemas de Producción de leche, tipos de ordena y

colecta.
2. Bocinas
3. Proyector Multimedia
4. Computadora
5. Pantalla para proyección
6. Mesas
7. Sillas
7

Descripción del desarrollo de la práctica
Sistemas de producción de leche
PRODUCCIÓN DE LECHE
SISTEMA SISTEMA SISTEMA DOBLE

TRASPATIO ESTABULADO PROPÓSITO
Ordeño Ordeño Ordeño Ordeño Ordeño

mecánico manual mecánico mecánico manual
SÍNTESIS DE ORDEÑO DE VACAS PARA LA ELABORACIÓN DE

QUESOS MEXICANOS GENUINOS
Ordeña
1. Ordeña en el Sistema de Producción de Traspatio
Mecánica
Manual
2. Ordeña en el Sistema Estabilado
Mecánica
3. Ordeña en el Sistema Doble Propósito (Extencivo)
Mecánica
Manual
8

Colecta
Salida del rancho Transvasado
Transbordado Transporte
Centro de acopio
Llegada de la leche a
quesería
Análisis de la leche
9

1. Análisis fisicoquímico de la leche
Queso Época Grasa (g/L) Proteína (g/L) SNG (g/L) Densidad (g/mL) pH Acidez (g/L)
Lluvias --- --- --- --- --- ---

Queso Chapingo
Secas 38.5 30.2 86.6 1.028 6.77 ---
Queso Crema de Lluvias 34.56±5.85 34.16±1.51 88.28±2.49 1.030±0.002 --- ---
Chiapas Secas 35.71±8.32 33.90±1.87 89.86±2.77 1.031±0.002 --- ---
Queso Bola de Lluvias 41.6±1.8 32.8±.0.7 86.37±1.85 1.031±0.0008 6.6±0.07 1.64
Ocosingo Secas 39.1±1.3 33.1±0.6 86.3±1.6 1.043±0.003 6.56±0.04 1.61
Queso Adobera Lluvias 41.3±3.14 34.18±0.5 90.02±1.36 1.032±0.012 6.58±0.58 1.90±0.03
Atengo, Jalisco Secas 36.66±3.14 33.28±0.46 87.42±1.02 1.033±0.006 6.78±0.18 1.75±0.030
Queso Asadero Lluvias 34.62±2.2 32.75±2.0 85.1±4.7 1.031±0 6.74±0.02 ---
de
Aguascalientes Secas 33.42±2.0 32.5±1.0 84.57±2.5 1.032±0 6.48±0.05 ---
Quesillo de Lluvias 35.4±4.0 27.6±1.2 82.2±1.8 --- --- ---
Reyes, Etla,
Oaxaca Secas 36.6±3.8 27.5±2.3 80.7±3.5 --- --- ---
Queso Cocido de Lluvias --- --- --- --- --- ---
Sonora Secas 40.5±5.0 34.7±0.8 87.1±2.1 1.03±0.0 --- 1.658±0.10
Queso Añejo de Lluvias --- --- --- --- --- ---
Zacatecas Secas 33.5±4.86 31.8±0.26 85.9±0.72 1.03±0.0 --- 22.9±3.6
Especificaciones
de la NMX-700- 28-29.9, 30-
--- 30,31,y >32 ≥83 ≥1.0295 No especificada <1.3
COFOCALEC- 30.9 y >31
2004
10

2. Análisis microbiológico
Queso Época Bacterias mesófilas aerobias (log Acidez (g/L)

UFC/mL)
Crema de Chiapas Lluvias 6.75 ± 1.09 1.61 ±0.09
Secas 6.70 ±1.31 1.56 ±0.70
Bola de Ocosingo, Chiapas Lluvias 5.30 ±0.53 ---
Secas 6.22 ±0.62 ---
Adobera Atengo, Jalisco Lluvias 6.12 ±0.38 ---
Secas 4.77 ±0.46 ---
Asadero de Aguascalientes Lluvias 7.94 ±0.032 1.80 ±0.052
Secas 8.08 ±0.52 2.02 ±0.058
NMX-700-F-COFOCALEC-2004 < 5.0; 5.0 a 5.5; 5.5 a 5.8; 5.8 a 6.1 1.3 a 1.5
11

Normatividad
1. NMX-700-F-COFOCALEC-2012
12

Evaluación
1. Los alumnos formaran equipos de máximo cinco personas en donde

discutirán los resultados y obtendrán conclusiones de cada experimento
2. Cada uno de los alumnos hará un informe por escrito y entregado en la
práctica siguiente, en donde abarque los siguientes puntos: 1) Título de la
práctica; 2). Objetivos; 3). Resultados; 4). Discusión y 5). Conclusiones.
Bibliografía
• NMX-700-F-COFOCALEC-2004. Sistema, producto, leche-alimento lácteo-

leche cruda de vaca-especificaciones.
• NOM-243-SSA1-2010. Productos y servicios. Combinado y derivados
lácteos. Descripciones y especificaciones sanitarias. Métodos de prueba.
• Villegas de Gante, A. y Santos-Moreno, A. 2010. Calidad de Leche Cruda.
Editorial Trillas. México.
• Villegas de Gante, A. y Santos-Moreno, A. 2009. Manual Básico para
Elaborar Productos Lácteos. Editorial Trillas. México.
13

Práctica 2
Título: Densidad
Introducción
El porcentaje de sólidos no grasos (%SNG) y la densidad, son dos

parámetros que se controlan en las normas mexicanas, ya que estos varían con:
El porcentaje de sólidos totales. Si se suben estos aumentan tanto la

densidad y el porcentaje de sólidos no grasos
El porcentaje de grasa. Si aumenta, el porcentaje de sólidos no grasos y la

densidad disminuyen.
La temperatura: Si la leche se enfría, su densidad y los sólidos no graos se

incrementan y viceversa.
La densidad se mide con un termolactodensímetro o lactodensímetro

Quevenne (llamado también en el medio lechero lactodensímetro, “bombilla” o
pesa leche). Así una leche con densidad relativa de 1.030, tendrá 30 grados
Quevenne (esto es, 30°Q).
Ya que la densidad está muy influida por la temperatura, suele aplicarse

una fórmula para obtener la densidad corregida a 15°C, que es la de referencia en
la normatividad mexicana, esto es:
r15°C = rT + 0.0002 (T-15)
donde:
r15°C: densidad a 15°C.
rT: densidad a temperatura de la leche.
T: Temperatura de la leche
14

Establecer la densidad en distintas leches con el fin de interpretar los resultados

con base en la normatividad vigente.
Uso del Lactodensímetro
Metodología
leche en la probeta
Temperatura
Colocación del lactodensímetro en la leche
del lactodensímetro
Recursos materiales y equipos
• Lactodensímetro
• Probeta de 250 mL
• Termómetro de -10 a 110°C
• Distintas leches
• Laboratorio con mesas y sillas

• Proyector Multimedia
• Computadora
15

Colocación de leche en la probeta
1. Se agita perfectamente toda la leche del recipiente donde se encuentre
2. Se toma la leche en otro recipiente más pequeño
3. Vaciar la leche en la probeta de 500 mL
4. Llenar hasta aproximadamente 2-3 cm por debajo de la parte superior de la

probeta.
Registro de lectura del Temperatura
1. Se introduce el termómetro en el líquido (tomando el mismo con dos dedos,

de la parte superior), hasta aproximadamente 5 a 10 cm del mismo.
2. Sin soltar y sin retirar el termómetro del líquido, tomar la lectura en la escala
y registrar el dato en un cuaderno.
Colocación del lactodensímetro en la leche
1. Introducir el lactodensímetro en la probeta de 500 mL, en la parte central.

Sin soltar hasta que flote.
2. Evitar que el Lactodensímetro pegue en las paredes de la probeta
Registro de lectura del lactodensímetro
1. Colocar la vista al nivel del líquido. Observar la escala del Lactodensímetro

y tomar la lectura y anotar en el cuaderno.
2. Recordar que la escala del Lactodensímetro va de arriba hacia abajo.
3. Corregir la lectura a temperatura de 15oC.
16

Uso del Picnómetro
Metodología
Acondicionamiento del experimentoColocación de
Desarrollo del experimento Registro de lectura del
Cálculos densidad a la temperatura ambiente
o
Cálculos de densidad a 15 C Registro de lectura
• Picnómetro
• Muestra de leche
• Balanza analítica
• Vaso de precipitado
• Termómetro
• Agua destilada
• Pliego de papel filtro
• Alcohol
• Pipeta de 5 mL
• Computadora
17

Acondicionamiento del experimento
1. Acondicionamiento del picnómetro. Primeramente se debe verificar que

este esté limpio y seco, aunado a ello se determina el peso (m1), del mismo
en la balanza analítica.
2. Adición de agua destilada. Se debe llenar hasta rebosar, se coloca el tapón,

se limpia por fuera el picnómetro con una porción de papel muy
cuidadosamente; posterior a esto se procede a determinar la temperatura y
el peso (m2).
3. Limpieza del picnómetro. Se debe tirar la muestra de agua destilada, limpiar

por dentro y por fuera con papel, para que el secado sea más rápido se
recomienda por último agregar 5 mL de alcohol.
Desarrollo del experimento
1. Adición de la leche. Se procede a llenar el picnómetro con la muestra de

leche tomando su temperatura la cual debe ser la misma del agua y seguir
el procedimiento que se hizo con la determinación de densidad del agua.
Se determina el peso con la balanza analítica (m3).
Cálculos densidad a la temperatura ambiente
1. Se registran los pesos en una tabla (m1), (m2), (m3) y se procede a calcular
la densidad de la leche con la siguiente formula:
donde:
"# = Densidad a temperatura ambiente
M3 = peso de la muestra de leche
M2 = peso de la muestra de agua
M1 = peso del picnómetro
18

Cálculos de densidad a 15oC
1. La densidad a temperatura ambiente se corrige a 15°C, usando la siguiente

fórmula:
r15°C = rT + 0.0002(T-15)
donde:
"# = Densidad a temperatura ambiente
T = Temperatura ambiente en grados centígrados
Evaluación

Bibliografía

19

Práctica 3
Título: Contenido de sólidos no grasos (SNG)

Introducción
Para la determinación del porcentaje de sólidos no grasos en leche

(%SNG), se realza por medio de secado en estufa de la leche (%ST) y la
determinación de grasa (%G) y con la diferencia de los dos se obtienen los sólidos
no grasos (%ST - %G). También se pueden determinar por medio del uso del
horno de microondas. Pero el más rápido sería usando del refractómetro o
lactómetro. Existen refractómetros que miden el llamado índice de refracción,
adimensional, o refracción en grados refractométricos. Estas unidades finalmente
dependen el tipo de aparato que se emplee. En particular, el lactómetro Bertuzzi
es un tipo de refractómetro manual graduado en porcentaje de sólidos no grasos,
pero calibrado como un refractómetro más. El lactómetro Bertuzzi constituye un
instrumento de campo, útil para el personal involucrado en el abasto de leche a las
plantas; es utilizado en varias regiones del país.
También la lectura de sólidos no grasos medida con el lactómetro es

influida por la temperatura ya que está ajustado a 15°C, por lo habrá hacer la
corrección.
Establecer el contenido de sólidos no grasos en distintas leches con el fin de

interpretar los resultados con base en la normatividad vigente.
20

Uso del horno eléctrico
Metodlogía
Preparación del experimento
Secado de la muestra
Cálculos
• Arena
• Capsulas de porcelana
• Parrilla eléctrica
• Pinzas para crisol
• Desecador
• Varilla de vidrio
• Computadora
1. Colocar una varilla corta de vidrio y la cantidad de arena suficiente (20 g

aproximadamente) en una cápsula. Secar el conjunto en estufa a 102 ± 1ºC
hasta que dos pesadas sucesivas no difieran entre sí en no más de 0.5 mg.
2. Se pesa aproximadamente 10 g de muestra con una exactitud de 0.5 mg en

la cápsula, se homogeniza con la arena, utilizando para ello la varilla de
vidrio.
21

1. Se coloca la cápsula a Baño María a ebullición durante el tiempo necesario

para que la muestra se seque parcialmente, lo cual ocurre en
aproximadamente 20 minutos.
2. Se coloca la cápsula en la estufa a 102 ± 1ºC y se calienta durante 90

minutos.
3. Dejar enfriar la cápsula (con los sólidos totales) en el desecador y pesar

con aproximación de 0.1 mg.
4. Repetir el calentamiento por períodos de 30 minutos, enfriando y pesando

hasta que dos pesadas sucesivas no difieran entre sí en más de 0.5 mg, o
bien hasta que se observe un aumento de masas en cuyo caso debe
tenerse en cuenta el valor anterior.
Cálculos
1. Para obtener el contenido de sólidos totales en la leche se utiliza la

siguiente fórmula:
donde:
S= Contenido de humedad en la muestra.
m= Masa de la cápsula vacía en gramos.
m1= Masa de la muestra en la cápsula antes de la desecación, en gramos
m2= Masa de la muestra en la cápsula después de la desecación en

gramos
%ST = 100 – S
22

2. El porcentaje de sólidos no grasos (%SNG) se obtiene restando al
porcentaje de sólidos totales (%ST) el porcentaje de grasa (%G).
% SNG = % ST -% G
Uso de horno de microondas
Metodología
Cálculos
• Agua destilada
• Aserrín
• Capsulas de porcelana
• Vaso de precipitado
• Pinzas para crisol
• Desecador
• Horno de Microonda
• Computadora
23

1. Pesar las capsulas vacías en la balanza analítica, tarar la balanza para

después agregar 2 g de aserrín con error ± 0.5 mg.
2. Con una pinzas de crisol, llevar las capsulas a un horno de microonda

evitando de que no se tire el aserrín y sobreponer en la placa. Y poner 100
mL de agua en un vaso de precipitado dentro del horno fuera de la placa
giratoria.
3. Dejar calentar durante 6 min, pero por cada 2 min se cambia el agua para
evitar la evaporación.
4. Después de transcurrir este tiempo las capsulas se colocan en el desecador

usando pinzas de crisol y ahí dejar reposar 10 min.
5. Posteriormente se extraen las capsulas del desecador y se ponen en la

balanza analítica, y tomar la lectura. Es muy importante observar que la
lectura esta estático o constante las cifras, esperar que pase de 8 a 12
segundos para precisar el dato, de nuevo se pone en el desecador y
llevarla al horno de microonda.
6. El calentamiento se lleva a cabo solo por dos minutos y con 100 mL de

agua en vaso de precipitado, una vez concluido el tiempo, con las pinzas de
crisol las cápsulas se transfieren al desecador durante 10 min y pesarla de
nuevo. Se repite estos pasos hasta que las dos mediciones o pesadas la
diferencia es de 0.5 mg.
1. Las capsulas a peso constante, les es agregada la muestra (leche) en una

cantidad de 3 g, con una jeringa o una pipeta de 10 mL.
2. Las capsulas son llevadas al horno de microonda, para iniciar el

calentanamente, al principio con 4 min siempre con 100 mL de agua la cual
se cambia cada 2 minutos.
24

Ajuste o corrección del lactómetro
Determinación de sólidos no grasos

3. Después, con pinzas transferir las cápsulas al desecador y dejarlas durante
10 min y pesarlas. Se repite estos paso, pero con la condición de que el
tiempo en el horno de microonda sea de 2 min y pesarlas. Una vez que las
dos mediciones o pesadas difieran en 0.5 mg, indica que ya está a peso
constante en las capsulas.
Cálculos
1. Para obtener el contenido de sólidos totales en la leche se utiliza la

siguiente fórmula:
donde:
S= Contenido de humedad en la muestra
m= Masa de la cápsula vacía en gramos.
m1= Masa de la muestra en la cápsula antes de la desecación, en gramos
m2= Masa de la muestra en la cápsula después de la desecación en

gramos
%ST = 100 – S
2. El porcentaje de sólidos no grasos (%SNG) se obtiene restando al

porcentaje de sólidos totales (%ST) el porcentaje de grasa (%G).
% SNG = % ST -% G
Uso de refractómetro o lactómetro
Metodlolgía
25

• Refractómetro (lactómetro) Bertuzzi

• Pipeta de 1 mL o agitador de vidrio
• Computadora
Ajuste o corrección del lactómetro
1. Depositar algunas gotas de agua limpia sobre el prisma fijo y luego tapar
con la cubierta plástica móvil.
2. Esperar por lo menos un minuto dejando el lactómetro de ser posible sobre

una mesa.
3. Orientar el lactómetro hacia una fuente luminosa cualquiera. Ajustar el

ocular hasta que aparezca la escala bien definida. De ser posible, evitar
hacer la lectura al aire libre.
Determinación de sólidos no grasos
1. Mezclar bien la muestra de leche y depositar algunas gotas de leche sobre

el prisma fijo y luego tapar con la cubierta plástica móvil.
2. Esperar por lo menos un minuto dejando el lactómetro de ser posible sobre

una mesa.
3. Orientar el lactómetro hacia una fuente luminosa cualquiera. Ajustar el

ocular hasta que aparezca la escala bien definida. De ser posible, evitar
hacer la lectura al aire libre.
4. Hacer la lectura cuando la línea de separación entre el campo claro y el

oscuro sea clara. La escala tiene los grados pares a la izquierda y los
26

impares a la derecha. Entre un grado y otro existen cinco líneas. A cada
una corresponden dos décimas de grado, es decir, cada línea vale 0.2
grados.
5. Lavar con agua destilada el lactómetro y secar sin frotar el prisma de vidrio.
Evaluación

Bibliografía

27

Práctica 4
Título: Punto crioscópico
Introducción
La determinación del punto de congelación o crioscópico de la leche y de

alguna manera nos mide el aguado de la leche ya que es muy constante y se
encuentra entre -0.545 y -0.555oC. mediante la adición de agua el punto de
congelación de la la leche cambia subiendo en hacia el 0oC, dado que la adición
de agua se modifica la presión osmótica.
Un aumento del punto crioscópico en 0.01oC corresponde a una adición de

aproximadamente 2% de agua. La leche con un punto de congelación de más de -
0.53oC es dudosa. Si el punto de congelación es de más de -0.50oC, a la leche sin
duda se le adicionó agua.
En un dispositivo especial la leche se enfría con ayuda de una mezcla

refrigerante hasta por debajo de us punto crioscópico. La congelación se provoca
mediante un cristal de hielo o una barra de metal congelada. La temperatura se
mide con un termómetro de precisión especial.
Establecer el punto crioscópico en distintas leches para interpretar los resultados

28

Preparación de refrigerante
Preparación del material

Metodología
Uso del Crioscopio estándar

Desarrollo Gerber
del experimento
Toma de lectura
• Crioscopio Gerber
• Hielo
• Sal común o salmuera comercial
• Lupa
• Distintas leche

• Proyector multimedia
• Computadora
Preparación de refrigerante
1. El recipiente del refrigerante se llena hasta la mitad con trozos de hielo

pequeños.
2. Añadir un puñado de sal común y agua potable hasta alcanzar 2/3 de
altura.
29

3. En vez de hielo y agua, también se puede utilizar salmuera de uso
comercial entre -7.5 y -10oC.
4. Colocar el agitador grande en el recipiente de enfriamiento y cerrar el
recipiente con la tapa.
5. Introducir el termómetro de control con el tapón pequeño en el otro
orificio de la tapa y verificar que el termómetro se sumerge en el
refrigerante.
6. Agitar la masa de enfriamiento hasta alcanzar la temperatura óptima
para la prueba de -7oC.
Preparación del material
1. Llenar con leche el tubo límpio y seco hasta la marca.
2. El agitador pequeño y el termómetro de precisión, colocar junto con el tapón

grande sobre el tubo.
3. Colocar el tubo en el orificio de la tapa.
4. El mercurio del termómetro se debe encontrar completamente en la leche y

no debe de tocar en ninguna parte de la pared del tubo.
Desarrollo del experimento
1. Agitar el refrigerante y la muestra de leche constantemente con ayuda del

agitador pequeño y del grande hasta que la columna de mercurio del
termómetro del crioscopio se retire del depósito superior hacia los capilares.
2. La columna de mercurio continúa cayendo y desaparece por un breve

momento, luego comienza a subir nuevamente.
Toma de lectura
1. Cuando la columna de mercurio ya no se mueve, leer el valor de la

temperatura en la escala, si es necesario usar lupa para ello.
Evaluación

30

Bibliografía

31

Práctica 5
Título: Contenido de grasa
Introducción
La grasa butírica constituye uno de los componentes más importantes de la

leche por su valor económico, nutricional y tecnológico. Forma parte, junto con la
proteína, de la materia seca útil de la leche de vaca y otras especies.
La cuantificación de la grasa en la leche cruda es importante para:
El pago del fluido, según su calidad.
La estandarización de la leche, según los productos que se van a elaborar.
El manejo alimentario del hato lechero, ya que la “dieta” de los animales se

ve reflejada en la riqueza de grasa en la leche.
En México, la leche procedente del ganado holstein, típicamente lechero,

contiene con frecuencia entre 2.8 y 3.8% de grasa. Es más elevado en leche de
vacas jersey y cebuinas cuando estas últimas se hallan bien alimentadas.
Existen varios métodos para cuantificar la grasa butírica: el Rose Gottlieb,

Babcok, Gerber y métodos instrumentales con rayos infrarrojos. Uno de los más
empleados en México, es el Gerber, que aplicará en esta práctica así como el
considerado oficial que el método Soxhlet.
Establecer el contenido de grasa en distintas leches con el fin de interpretar los

resultados con base en la normatividad vigente.
32

Extracción de grasa
Método de Soxhlet
Cálculos Metodlolgía
• Éter etílico o de petróleo

• 1 Extractor SOXHLET
• 1 Destilador
• 1 Cartuchos de extracción de tamaño adecuado
• 1 Porción de algodón
• 1 Pinza para crisol
• 1 Pinza para soporte universal
• 1 Soportes universal
• 1 Parrilla eléctrica de placa con termostato
• 1 Probeta de 50 mL
• 1 Matraces bola de 200 mL
• 1 Desecador
• 1 Balanza analítica
• 1 Estufa de secado a 100-110ºC
• 1 Microondas marca Panasonic
• 1 Vaso precipitado de 100 mL
• 1 Paquete de hojas de papel filtro
• 1 Cajas Petri
• 1 agitador de vidrio
• 1 Cucharas
• Porción de aserrín a peso constante
33

• Computadora
Descripción del desarrollo de la prática
1. Primeramente se seca la muestra de leche como se especifica en la

determinación de sólidos no grasos en la práctica 3 de éste manual,
haciendo uso del horno eléctrico o de microondas. Sólo que para éste caso
se pesan 10 gramos de leche o se miden 10 mL.
2. Después pasar cuantitativamente el contenido de la cápsula de porcelana a

un cartucho de extracción a peso constante y si es necesario, usar éter de
petróleo.
Extracción de grasa
1. El cartucho así preparado es introducido en un equipo extractor Soxhlet.
2. En matraz balón del equipo Soxhlet a peso constante, colocado en la parte

inferior, se introducen cuerpos de ebullición.
3. Se añade en la parte superior del refrigerante, 150 mL de éter.
4. Hacer circular el agua por el refrigerante y calentar hasta que se obtenga

una frecuencia de dos gotas por segundo.
5. Efectuar la extracción durante 8 horas y suspender el calentamiento.
6. Quitar el cartucho del equipo de Soxhlet y escurrir el disolvente sobre un

vaso de precipitados.
7. Secar el cartucho en un horno eléctrico, aumentando la temperatura

gradualmente de 20°C hasta 120°C, durante un lapso de una hora.
34

Acondicionamiento del butirómetro
Adición de ácido sulfúrico
Cálculos
Adición de la leche
1. Calcular el porcentaje de grasa total en la muestra utilizando la siguente
fórmula:
Adición de alcohol amílico
Cerrado del butirómetro
donde:
Agitación del butirómetro
P = Peso en gramos del cartucho con grasa
Centrifugación
p = Peso en gramos del cartucho sin grasa
M = Masa en gramos de la muestra

Inmersión en baño María
Método de Gerber
Lectura Metodología
35

• Butirómetros Gerber para leche con escala de 0 a 7%

• Pipetas volumétricas de 1.0. 11.0 y 10.0 mL
• Dosificador automático
• Termómetro de -10 110°C
• Vaso de precipitados de 1 000 mL
• Centrífuga Gerber
• Baño María eléctrico y gradilla para butirómetro
• Ácido Sulfúrico con densidad 1.820-1.840
• Alcohol amílico o isoamílico, libre de furfural; de densidad 0.815 y punto de
ebullición de 130°C.
• Computadora
Acondicionamiento del butirómetro
1. Colocar el butirómetro limpio y seco, con la boca hacia arriba, en un soporte

(vaso de precipitados de 1 000 mL o gradilla para butirómetros).
Adición de ácido sulfúrico
1. Colocar a la pipeta de 10 mL correspondiente, el llenador automático.
2. Llenar la pipeta hasta la marca, con el ácido sulfúrico. Hacerlo con mucho
cuidado. ¡Nunca pipetear directamente con la boca!
3. Agregar al butirómetro el ácido, evitando mojar el cuello del mismo.
36

Adición de la leche
1. Con la pipeta de 11 mL, tomar la leche, previamente mezclada.
2. Colocar la punta de la pipeta en la base del cuello del butirómetro.
3. Dejar resbalar la leche muy lentamente, para evitar que se mezcle súbita y
prematuramente con el ácido.
Adición de alcohol amílico
1. Con cuidado, colocar la pipeta de 1 mL en el frasco en donde se encuentra

el alcohol amílico. Pipetear y ajustar el líquido hasta la marca de aforo.
2. Después, colocar la pipeta en la superficie de la leche que está ya en el

butirómetro. Vaciar la pipeta, procurando no mojar con el alcohol el cuello
del recipiente.
Cerrado del butirómetro
1. Con cuidado, colocar la pipeta de 1 mL en el frasco en donde se encuentra

el alcohol amílico. Pipetear y ajustar el líquido hasta la marca de aforo.
2. Después, colocar la pipeta en la superficie de la leche que está ya en el

butirómetro. Vaciar la pipeta, procurando no mojar con el alcohol el cuello
del recipiente
Agitación del butirómetro
1. Con cuidado, y usando un aislante del calor, colocar las manos en cada uno
de los extremos del butirómetro.
2. Agitar de manera giratoria el butirómetro, hasta que la caseína se haya

disuelto por completo, lo cual se evidencia cuando el líquido cambia a un
color morado oscuro. El butirómetro debe quedar al final con el tapón hacia
abajo.
Centrifugación
1. Con el ajustador, volver a verificar el cierre perfecto del tapón.
37

2. Introducir en la centrífuga los butirómetros, “tapón abajo”, procurando que
queden balanceados, es decir uno frente al otro. Luego, centrifugar
durante 5 minutos a 1 000 rpm.
Inmersión en baño María
1. Los butirómetros se sumergen verticalmente, con el tapón hacia abajo, en

baño María a 65°C, durante 5 minutos. El baño María puede ser eléctrico
(termorregulado), o formado por una parrilla eléctrica y un recipiente con
agua.
Lectura
1. Tal como sale del baño María, se procede a tomar la lectura del porcentaje
de grasa en el butirómetro, usando el ajustador para empujar la columna de
grasa, para que quede en la escala.
Evaluación

Bibliografía

38

Práctica 6
Título: Contenido de lactosa
Introducción
Los azúcares pueden ser reductores como la glucosa y la lactosa o no

reductores como la sacarosa. Los azúcares reductores, reaccionan, con reactivos
oxidantes tales como el sulfato de cobre en condiciones alcalinas y en caliente
dando un . En precipitado de óxido cuproso el cual se puede cuantificar ya sea
pesándolo (método gravimétrico o midiendo cantidad de azúcar generadora del
mismo (método volumétrico). En el método gravimétrico, la leche y productos
lácteos, la grasa y proteínas se remueven por precipitación y filtración. Calentando
una porción de filtrado, se precipita el óxido cuproso el cual es pesado
cuantitativamente. La lactosa equivalente al oxido cuproso se determina por medio
de valores de tablas.
El método volumétrico es semejante al gravimétrico, sólo que en lugar

cuantificar el óxido cuproso se titula la solución de lactosa clarificada con el
reactivo de Fehling, valorado con una solución tipo de lactosa.
Objetivo de la prática
Establecer el contenido de lactosa en distintas leches para interpretar los

39

Clarificación de la muestra
Precipitación
Método gravimétrico
Metodología
Separación del precipitado
Secado del precipitado
Cuantificación
• Solución de Sulfato de cobre. Disolver 34.639g de CuSO4.5H2O en agua

destilada y aforar a 500 mL con agua destilada. Filtrar la solución a través
de papel filtro.
• Solución alcalina de tartrato. Disolver 173g de KNa tartrato.4H2O (sal
Rochelle) y 50g de NaOH en agua, diluir a 500mL, dejar reposar 2 días y
filtrar a través de preparado de asbesto.
• Preparado de asbesto. Digerir asbesto con HCl (1 + 3) de 2 a 3 días.
Lavar con solución de NaOH al 10% durante el mismo tiempo, después
tratar unas horas con solución alcalina de tartrato. Lavar por varias horas
con HNO3 (1 + 3) y después con agua y agitar hasta quedar una pulpa fina.
Preparar el embudo Gooch de porcelana con 6 mm de cama y pasar agua
para remover pequeñas partículas. Lavar el Gooch con 10 mL de alcohol y
con 10 mL de éter; secar por 30 minutos a 100°C y enfriar en el desecador.
• Solución de Hidróxido de Sodio. En un vaso de precipitados de 250 mL,
se colocan 25g de NaOH (reactivo analítico). Se disuelve en 25 mL de
40

agua destilada. La solución anterior se pasa a una probeta de 50 mL.
Reposando 15 minutos. Se toman 32.5 mL y se colocan en un matraz
aforado de 1000 mL. Con agua destilada y hervida, enfriada a temperatura
ambiente, se afora. Se tapa con tapón de hule.
• Desecador
• Termómetro de –10 a 110°C
• Matraz Kitasato
• Embudo Gooch de porcelana o vidrio
• 2 Vasos de precipitados de 400 mL
• Matraz aforado de 100 mL
• Matraz aforado de 500 mL
• 2 Matraz Erlenmeyer de 250 mL
• Embudo de vidrio
• Pipeta graduada de 10 mL
• Pipeta volumétrica de 25 mL
• Bomba de vacío
• Estufa
• Computadora
1. En un matraz aforado de 500 mL poner 25 g de leche, 400 mL de agua

destilada, 10 mL de solución de sulfato de cobre y aproximadamente 8.8
mL de solución de NaOH.
41

2. Aforar con agua destilada y reposar 15-20 minutos.
3. Filtrar el sobrenadante a través de papel filtro.
Precipitación
1. Transferir 25 mL de solución de CuSO4 y 25 mL de solución alcalina de

tartrato a un vaso de precipitados de 400 mL y agregar 50 mL de solución
clarificada de la muestra
2. Calentar de tal manera que empiece a hervir en 4 minutos y continuar

hirviendo por 2 minutos, cubriendo con vidrio de reloj.
Separación del precipitado
1. Filtrar la solución caliente a través del embudo Gooch con asbesto (a peso
constante), usando vacío.
2. Lavar con agua a 60°C, después con 10 mL de alcohol y finalmente con 10

mL de éter.
Secado del precipitado
1. Secar por 30 minutos en estufa a 100°C.
Cuantificación
1. Enfriar en desecador y pesar.
2. Para cuantificar la lactosa, consultar las tablas de Hammond (páginas 1286

a 1294) del AOAC (1990). Ahí obtener el peso de lactosa equivalente al
peso de Cu2O.
42

Obtención factor lactosa
Método volumétrico
Metodología
Titulación
Cuantificación
• Solución de Sulfato de cobre (Fehling A). Disolver 34.639g de

CuSO4.5H2O en agua destilada y aforar a 500 mL con agua destilada.
Filtrar la solución a través de papel filtro.
• Solución alcalina de tartrato (Felhling B). Disolver 173g de KNa
tartrato.4H2O (sal Rochelle) y 50g de NaOH en agua, diluir a 500mL, dejar
reposar 2 días y filtrar.
• Solución acuosa de azul de metileno al 0.2%
• Solución patrón de lactosa. Disolver 10 g de lactosa anhidra a un litro con
solución acuosa al 0.2% de ácido benzóico.
• Solución acuosa saturada de acetato de plomo
• Solución acuosa saturada de sulfato de sodio
• Ácido acético glacial
• 2 Matraces Erlenmeyer de 250 mL
• Probeta graduada de 50 mL
• 2 Pipetas graduadas de 10 mL
• 2 Pipetas volumétricas 5 mL
• Embudo de vidrio
43

• 2 Vasos de precipitados de 600 mL
• 2 Vasos de precipitados de No. 2
• 2 Barras magnéticas
• Soporte universal y Bureta de 25 mL
• Computadora
Obtención factor lactosa
1. Medir con pipeta volumétrica 5 mL de solución A y 5 mL de solución B en

un matraz erlenmeyer de 250 mL.
2. Añadir 50 mL de agua, calentar en parrilla a ebullición poniendo una barra

magnética y agregar poco a poco con una bureta, solución patrón de
lactosa hasta la casi reducción total de cobre.
3. Agregar 1 mL de solución de azul de metileno continuar la titulación, hasta

la desaparición del color azul de la solución.
4. Calcular los miligramos de lactosa que se necesitan para titular la solución

A-B. Este valor corresponde al título (T) del reactivo.
1. Colocar 10 mL (o gramos) de leche en un matraz volumétrico de 250 mL

con 100 mL de agua. Añadir 15 mL de solución saturada de acetato de
plomo, 25 mL de sulfato de sodio y 2.5 mL de ácido acético glacial. Dejar
reposar media hora.
2. Diluir a la marca con agua destilada, filtrar y el filtrado colocarlo en la

bureta.
44

Titulación
1. Procede como en los puntos 1 a 3 (titulación de la solución A-B), usando el

filtrado obtenido, en lugar de la solución patrón de lactosa.
Cuantificación
1. Usando la siguiente fórmula obtener la cantidad de lactosa en la leche.
donde:
P = Peso o volumen de muestra en gramos o mililitros
T = Título de la solución A + B en gramos de lactosa
V = Volumen en mililitros de solución problema gastados en la titulación de

10 mL de la solución A + B
Evaluación

Bibliografía

45

46

Práctica 7
Título: Contenido de proteínas
Introducción
El contenido de proteínas en la leche es determinado por el método de

Kjeldahl que es un método indirecto en el que se cuantifica el nitrógeno total de la
muestra, el cual, se determina casi siempre por una combustión líquida en la que
se convierte el nitrógeno primero en sulfato de amonio y finalmente en amoniaco;
el amoniaco formado se destila y se titula con una disolución ácida normalizada.
También existen varios métodos colorimétricos o espectrofotométricos que

en base del contenido de sustancias que reaccionan con otros componentes
dando color como es el caso del grupo fenólico.
El contenido de proteína por el método de Kjeldahl, se calcula de la

siguiente manera:
% Proteína = % Nitrógeno ´ 6.38
Establecer el contenido de proteínas en distintas leches con el fin de interpretar los

47

Acondicionamiento de la muestra
Digestión
Método de Kjeldahl
Metodología
Destilación
Titulación
Cálculos
• Pipeta de 10 mL graduada
• Ácido sulfúrico concentrado
• Solución de hidróxido de sodio al 40% p/v
• Solución de ácido bórico al 4%
• Solución de ácido clorhídrico 0.1 N
• Mezcla de indicadores en proporción: rojo de metilo 0.66% y verde
bromocresol 0.33%.
• Pastillas catalizadoras
• Tubos para Kjeldahl
• Equipo de digestión para método de Kjeldahl
• Equipo de destilación para método de Kjeldahl
48

• Computadora
1. Introducir 5 mL (o gramos) de muestra al tubo de digestión.
2. Añadir después, 5 mL de ácido sulfúrico concentrado.
3. Agregar una pastilla catalizadora compuesta de sulfato de cobre

pentahidratado y sulfato de potasio.
Digestión
1. El tubo se coloca en el digestor del equipo y se calienta hasta que el líquido

adquiera una coloración azul verdosa. Que generalmente sucede de 3 a 4
horas.
Destilación
1. Enfriar hasta temperatura ambiente y se coloca en el equipo de destilación.
2. Adicionar solución de sosa al 40% (NaOH), y destilar.
3. Recibir el destilado en 50 mL de solución de ácido bórico al 4% con dos

gotas de la mezcla de indicadores.
4. Destilar hasta alcanzar 100 mL de destilado y haya virado de rojo a verde.
Titulación
1. Titular el destilado con solución valorada de HCl 0.1 N hasta que vire de
verde a rojo.
Cálculos
1. Con el gasto obtenido de ácido Clorhídrico en la titulación se usa la

siguiente fórmula:
% Proteína = % Nitrógeno ´ 6.38
49

Preparación de la muestra
Curva tipo
Método espectrofotométrico
Contenido de prorteína total Metodología
• Una gradilla para 40 tubos
• 20 tubos de ensayo
• 4 pipetas graduadas de 1 mL
• Una pipeta graduada de 10 mL
• Dos embudos de vidrio
• Dos vasos de precipitados de 200 mL
• Un vaso de precipitados de 500 mL
• Una probeta de 100 mL
• Un matraz aforado de 50 mL
• Un matraz aforado de 250 mL
• Un termómetro de -10 a 110oC
• Una propipeta
• Una balanza analítica
• Un espectrofotómetro
• Una parrilla de calentamiento
50

• Un potenciómetro
• Un papel filtro del No. 1
• Solución Carbonato-Sosa. Prepara una solución de Carbonato de sodio al

2% en Hidróxido de Sodio al 0.1N.
• Solución de ácido tricloroacético al 20%
• Solución tipo de caseína 10mg/mL en Carbonato de sodo-Sosa
• Reactivo A de Lowry. Disolver carbonato de sodio (Na2CO3) al 2% en una

solución de hidróxido de sodio 0.1 mol L-1.
• Reactivo B de Lowry. Colocar CuSO4.5H2O al 0.5% en tartrato de sodio y

potasio al 1%. Disolver en agua por separado, el sulfato de cobre y el
tartrato, mezclando ambas soluciones para tener el reactivo.
• Reactivo C de Lowry. Este reactivo es la mezcla de 50 volúmenes de

reactivo A y 1 volumen de reactivo B. Éste es útil solamente durante un día,
como máximo.
• Reactivo D de Lowry. A un matraz balón de 1.5 litros, agregar 100 g de

tungstato de sodio (Na2WO4.2H2O); 25 g de molibdato de sodio
(Na2MoO4.2H2O); 700 mL de agua destilada; 50 mL de ácido fosfórico al
85% y 100 mL de ácido clorhídrico concentrado y reflujar durante 10 horas.
Añadir posteriormente 150 g de sulfato de litio; 50 mL de agua destilada y
unas gotas de bromo. Finalmente, hervir 15 minutos, enfriar, aforar a un litro
y filtrar. El color obtenido debe ser amarillo sin tintes verdosos (éste es el
denominado reactivo de Folin-Ciocalteau o Folin-C). Se utiliza diluido con 2
volúmenes de agua destilada o bien si se desea un mayor control del
método fotométrico, se recomienda determinar su concentración,
valorándolo con una solución de NaOH 1 N, utilizando fenolftaleína como
indicador y diluir el reactivo hasta tener una concentración 1 N.
51

NOTA.- El reactivo de Folin-C se deberá guardar concentrado y diluir sólo el
que se va a utilizar cada vez. Cuando adquiera un tinte verdoso, se deberá
desechar.
1. A 20 g de leche, adicionar 30 mL de ácido tricloroacético al 20% logrando

precipitar las proteínas presentes.
2. Separar el precipitado por filtración utilizando papel Whatman No. 1 (si el

filtrado se observa turbio, refiltrar).
3. Lavar dos veces con 25 mL agua destilada fría.
4. Redisolver el precipitado en solución de carbonato-sosa, aforando a 50 mL.
5. Tomar un mililitro y determinar contenido de proteínas.
Curva tipo
1. Preparar la siguiente serie de tubos:
Tubo No. Solución tipo de Reactivo A (mL) Reactivo C (mL)

proteína (mL)
1 0.0 0.5 4.0
2 0.1 0.4 4.0
3 0.2 0.3 4.0
4 0.3 0.2 4.0
5 0.4 0.1 4.0
6 0.5 0.0 4.0
2. Mezclar bien el contenido de cada tubo y dejar reposar 10 minutos. Agregar

a cada tubo, 0.5 mL del reactivo D, agitando vigorosamente de inmediato.
Dejar reposar al menos 30 minutos y leer su absorbancia a 600 nm,
utilizando el tubo 1 como blanco.
Contenido de proteína total
1. Se procede a desarrollar la técnica de Lowry en las condiciones que se

indican para el tubo 4 de la curva tipo (colocando 0.3 mL de problema) y
52

adicionar 0.2 mL de reactivo A y 4.0 mL de reactivo C. Mezclar bien y
reposar 10 minutos. Agregar 0.5 mL de reactivo D, agitando vigorosamente,
dejar reposar 30 minutos y leer la absorbancia a 600 nm.
Evaluación

Bibliografía

53

Práctica 8
Título: Pruebas sanitarias indirectas
Introducción
Existen pruebas rápidas y sencillas que nos pueden determinar el estado

sanitario de la leche como son los casos de determinación de pH; acidez titulable;
la prueba de alcohol; la prueba de estabilidad al calor; y el tiempo de reductasa.
El pH (potencial de hidrógeno) constituye un indicador de la acidez real de

la leche, y de otros alimentos. Se mide empleando un potenciómetro, a menudo
llamado peachimetro. El potenciómetro registra los iones hidrógeno (H+)
procedentes de los ácidos que contiene la leche, por ejemplo el ácido láctico en la
leche fermentada. Cuando dulce, la leche presenta un pH entre 6.6-6.7,
generalmente. A medida que los H+ aumentan (por ejemplo cuando se produce
ácido láctico por acción de los BAL (bacterias ácido lácticas). El pH disminuye.
La acidez titulable se obtiene agregando una solución de hidróxido de sodio

0.1N a una de leche, usando como indicador fenolftaleina al 1% en alcohol.
Cuando el indicador toma un color rosa pálido, decimos que la titulación se ha
terminada y de esta manera, se calcula la acidez titulable.
La acidez titulable se puede expresar:
°N = mL de hidróxido de sodio (1/10 N) por cada 100 mL de leche.
g/L de ácido láctico = gramos de ácido láctico por litro de leche.
% de ácido láctico = gramos de ácido láctico por 100 mL de leche.
°D (grado Dornic) = 0.01 gramos de ácido láctico por 100 mL de leche.
°T = Grados Thorner (Hidróxido de sodio 1/10)
54

Relaciones:
g/L de ácido láctico = % de ácido láctico ´ 10
% de ácido láctico = g/L de ácido láctico/10

o
D = % de ácido láctico × 100
% de ácido láctico = °D/100
°SH (Grados Soxlet Henkel) = 4.4.°D
°T = 11.1°D
Generalmente una leche dulce tiene una acidez titulable total de unos 15-
17°D. La acidez titulable de la leche se clasifica en tres tipo:
Acidez natural (AN), producto de las proteínas, principalmente
Acidez desarrollada (AD), producida por el ácido láctico generado por las
bacterias acidolácticas al fermentar la lactosa
Acidez total (AT), es la suma de las dos anteriores, esto es:
AT = AN + AD
Las pruebas de alcohol al 68% y 72%, constituyen un indicador indirecto del

grado de acidificación de la leche cruda. Por tanto revela, indirectamente, la carga
microbiana total de la leche (principalmente las bacterias acidolácticas), y su
probable comportamiento ante un tratamiento térmico (ejemplo pasteurización o
esterilización comercial). De manera sencilla, se afirma que al acidificarse la leche
las micelas de caseína se vuelven sensibles al exponerse al alcohol del 68% o del
72%, ya que esta sustancia las deshidrata favoreciendo su precipitación como
floculo blanco.
En prueba de estabilidad al calor se aprecia directamente, la estabilidad de

la leche cruda frente al calor, simulando las condiciones de tratamiento térmico de
un proceso. Si existe cierto grado de acidez en la leche, las micelas caseinicas
sensibilizadas (debido a la neutralización de las cargas negativas micelares por los
hidrogeniones del ácido láctico generado por fermentación) tenderán a precipitar
55

formando un flóculo blanco. Es decir, si la prueba resulta positiva, a nivel de tubo
de ensayo, es mejor no someter la leche cruda a tratamiento térmico. En todo
caso, si se acepta esa leche, canalizarla para elaborar algún producto (por
ejemplo, queso Oaxaca), pero no someterla a pasteurización; menos a un
tratamiento térmico más drástico (por ejemplo UHT).
El cambio de potencial de redox en la leche sucede solamente después de

que el oxígeno disuelto fue consumido por las bacterias y puede ser identificado
por los cambios de color de algunos colorantes agregados a la leche (azul de
metileno, resazurina, etc.). Estos colorantes son oxidados en un sistema redox, ya
que el tiempo transcurrido antes de que el color sea reducido a un tipo de
compuesto sin color, es un indicador muy general, relacionado con el número de
bacterias presentes. Este tiempo de reductasa es el índice del gado de
contaminación bacteriana.
Por otro lado existen pruebas indirectas también para determinar

contaminación de la leche procedente de vacas con alguna enfermedad como la
mastitis y tuberculosis, los cuales veremos en prácticas posteriores. Cuando la
infección de la glándula mamaria es muy severa, puede apreciarse la sangre en la
leche por medio de la coloración de una solución de bencidina.
Determinar por medio de pruebas indirectas rápidas y sencillas, el estado sanitario

de distintas leches a fin de interpretar los resultados con base en la normatividad
vigente.
56

Acondicionamiento del potenciómetro
Calibración
Determinación de pH
Lectura Metodología
• Solución reguladora o buffer a pH 4.0

• Solución reguladora o buffer a pH 7.0
• Piceta con agua destilada
• Vaso de precipitados de 200 mL
• Potenciómetro o pHímetro
• Computadora
Acondicionamiento del potenciómetro
1. Conectar y poner en funcionamiento el aparato, oprimiendo el botón de

encendido.
2. Poner el botón de funciones en modo de pH.
3. Ubicar el botón de temperatura en 20-22°C.
4. Extraer el electrodo del recipiente de agua destilada y limpiar sin frotar, con
papel fino.
57

Toma de la muestra
Toma de 9 mL en pipeta volumétrica
Calibración
Preparación para titular
1. Colocar el electrodo en el recipiente con la solución reguladora a pH 4.0 y
con 0.1N
Colocación del NaOH el botón de calibración, ajustar la escala de pH a 4.0.
en bureta
2. Extraer el electrodo del recipiente y limpiarlo con agua destilada a través de
una piceta y secar con un papel fino, sin frotar.
Titulación
3. Colocar el electrodo en el recipiente con la solución reguladora a pH 7.0 y
con el botón de calibración, ajustar la escala de pH a 7.0.
4. Extraer el electrodo del recipiente y limpiarlo con agua destilada a través de

una piceta y secar con un papel fino, sin frotar.
Lectura
1. Introducir el electrodo en el recipiente con la leche y tomar la lectura en la

escala de pH. La cual debe estar estabilizada unos 20 segundos.
Determinación de acidez
Metodología
• Solución de Hidróxido de sodio 0.1N

58

• Solución de Fenolftaleína al 1% en alcohol del 70-96%
• Bureta automática (acidímetro)
• Equipo de titulación (bureta de 25 mL. soporte universal y pinzas para

bureta)
• Matraz erlenmeyer de 250 mL
• Piceta
• Computadora
Toma de la muestra
1. Se agita perfectamente toda el producto del recipiente donde se encuentre
2. Se muestrea la leche en un vaso de precipitados de 250 mL
Toma de 9 mL en pipeta volumétrica
1. Se introduce la pipeta volumétrica de 9 mL hasta el fondo del pequeño

recipiente
2. Se coloca la pipeta en la boca y se absorbe hasta que el producto lácteo

llegue arriba de la marca (aproximadamente 1 a 2 cm)
3. Se retira de la boca la pipeta, y rápidamente se coloca el dedo índice en la

parte superior, evitando que el líquido salga.
59

4. Se deja de presionar, sin quitar el dedo de la boca de la pipeta, provocando
que salga el lácteo lentamente.
5. Dejar salir el líquido, hasta que llegue a la marca y volver a presionar sin
que el producto se tire.
Preparación para titular
1. Evitando que el producto salga. La pipeta es colocada en un matraz

erenmeyer de 250mL y sin presionar dejar salir el líquido. Lavando con
agua destilada la pipeta colocando unos chorros con la piceta.
2. Agregar al producto, 3 gotas de solución de fenolftaleina, agitando

perfectamente.
Colocación del NaOH 0.1N en bureta
1. Pasar de la botella, a un vaso de precipitados de 150 mL, la solución de

hidróxido de sodio 0.1N
2. Bajar la bureta hasta un punto en el cual, se pueda verter fácilmente la

solución de hidróxido de sodio.
3. Cerrar la llave de la bureta que está en la parte inferior
4. Agregar la solución de hidróxido de sodio a la bureta por arriba de la marca

cero (2 cm aproximadamente)
5. Colocar el vaso de precipitados con solución de hidróxido de sodio, debajo

de la salida de la bureta.
6. Poner la vista al nivel de la marca, de manera horizontal
7. Abrir la llave de la bureta hasta que el nivel de la solución de hidróxido de

sodio alcance la marca cero
Titulación
1. Ya en la marca de la bureta o acidímetro con la solución de hidróxido de

sodio. Se coloca debajo, el recipiente en con la leche para titular.
60

Lectura
2. Agregar gota a gota la solución de hidróxido de sodio la leche con
fenolftaleína.
3. Agitar el recipiente con la leche, cada vez que se agrega la solución de

hidróxido de sodio. Viendo siempre al mismo.
4. Seguir agregando el hidróxido de sodio, hasta que la coloración de la leche

cambie a rosa pálido.
5. Este punto decimos que es el vire y se toma la lectura del gasto de

hidróxido de sodio.
6. Si se sigue agrando otra gota de la solución de hidróxido de sodio, toma

una coloración rosa. Decimos que ya se pasó y la lectura es la anterior.
Pruebas de alcohol al 68 y 72%
Metodología
• Alcohol al 68%
• Alcohol al 72%
• 4 Tubos de ensayo de 20 mL con tapón de rosca
• 2 Pipetas de 5 o 10 mL
• 1 Gradilla
• Computadora
61

Lectura
1. En dos tubos de ensayo limpio colocar 2.0 mL de leche a cada uno
2. Añadir 2.0 mL de alcohol al 68% y otros 2.0 mL de alcohol 72% al otro.
3. Agitar con ligeros golpes al tubo.
Lectura
1. Inclinar el tubo (ponerlo a unos 20 grados con respecto a una línea

horizontal) y observar si existen pequeños flóculos de caseína.
2. Si existen, la prueba es positiva (+); es decir, la leche presenta cierta

acidez. Si no, la leche es dulce.
Prueba de estabilidad al calor
Metodología
• 4 Tubos de ensayo de 20 mL con tapón de rosca
• 2 pipetas de 5.0 o 10 mL
• Baño María a ebullición con parrilla
• 1 Gradilla
• Computadora
62

Reposo o incubación
Descripción del desarrollo de l a práctica
Tiempo de decoloración
1. En un tubo de ensayo limpio colocar 3 mL de leche.

Interpretación de resultados
2. Calentar los tubos con la leche en baño maría durante 3 minutos.
3. Agitar con ligeros golpes al tubo.
Lectura
1. Inclinar el tubo (ponerlo a unos 20 grados con respecto a una línea

horizontal) y observar si existen pequeños flóculos de caseína.
2. Si existen, la prueba es positiva (+); es decir, la leche presenta cierta

acidez. Si no, la leche es dulce.
Tiempo de reducción de azul de metileno
Metodología
• Solución de tiocianato de azul de metileno. Disolver 5 mg de azul de

metileno en 100 mL de agua destilada estéril. Esta solución se conserva
durante dos semanas protegida de la luz, en un frasco bien cerrado y a una
temperatura de 4°C.
63

• Dos tubos de ensayo de 16 ´ 160 con rosca y tapón estériles
• Gradilla
• Pipeta de 1 mL estéril
• Frasco color ámbar con tapón de rosca de 200 mL estéril
• Baño maría a 37°C
• Computadora
1. En un tubo de ensayo con rosca estéril poner 10 mL de leche.
2. Agregar a cada tubo 1 mL de solución de Azul de Metileno.
3. Agitar bien cada tubo por “golpeo” ligero; que toda la leche se tiña de azul.
Reposo e incubación
1. Poner los tubos en la gradilla e introducir ésta en el baño María a

temperatura constante a 37°C. Registrar con precisión la hora de
inmersión.
2. Observar los tubos cada media hora. Los tubos con la mezcla de leche
decolorada se extraen del baño registrando el tiempo (en minutos).
3. Los tubos cuyo contenido permanece azul, se invierten una vez cada media
hora y se continúa la incubación hasta la desaparición del color azul.
64

Reposo o incubación
1. Se puede calucar aproximadamente los resultados de la prueba de azul

Lectura de color a diferentes tiempos
de metileno (AM) usando la siguente tabla.
Relación del tiempo de decoloracion del AM y la calidad de la leche

Interpretación deTiempo de
resultados Número estimado de Calidad de la leche
decoloración (horas) bacterias por mL
5 100 000 a 200 000 Buena
2a4 200 000 a 2 millones Buena a regular
Menos de 2 2 a 10 millones Mala
Tiempo de reducción de resazurina
Metodología
• Solución de resazurina estándar. Añadir 0.1g de resazurina en polvo a 200

mL de agua destilada, mezclar y calentar en baño de agua hirviendo
durante una media hora; se lleva de nuevo el volumen a 200 mL y se
conserva a 4°C en frasco de vidrio herméticamente cerrado. En el momento
del empleo, preparar la solución de trabajo, diluyendo la cantidad necesaria
de solución estándar con agua destilada estéril en proporción 1/10.
65

• Dos tubos de ensayo de 10 mL con rosca y tapón estériles
• Gradilla
• Baño maría a 37°C
• Disco comparador Lovibond
• Computadora
1. En un tubo de ensayo con rosca y estéril poner 10 mL de leche.
2. Agregar a cada tubo 1 mL de solución de trabajo de resazurina.
3. Agitar bien cada tubo por “golpeteo” ligero, con los dedos; que toda la leche
se tiña de azul-malva.
Reposo e incubación
1. Poner los tubos en la gradilla e introducir ésta en el baño María a

temperatura constante a 37°C. Registrar con precisión la hora de
inmersión.
2. Incubar por una hora. extraer los tubos del baño.
3. Leer en el comparador Lovibond. Se colocar en el compartimento de la

izquierda del comparador un tubo con la leche analizada sin el colorante
(prueba en blanco); el que contiene el reactivo y acaba de salir del baño de
agua, se coloca a la derecha. Desplazando el disco con los colores patrón,
se define el color del tubo de la reacción.
66

Lectura
Comparar con el cuadro siguiente.
Color desarrollado por la resazuria y la calidad de la leche

Coloración de la leche Calidad de la leche
Azul (disco 6)
Viloleta (disco 5) Buena
Malva (disco 4)
Rosa-Violeta (disco 3)
Malva-Rosa (disco 2) Regular
Rosa (disco 1)
Decoloración total Mala
Detección de sangre
Metodología
• Ácido acético glacial
• Agua oxigenada al 2% en agua
• Solución de bencidina u orto-toluidina al 1% en alcohol
• 2 tubos de ensayo con rosca y tapón de unos 20 mL,
• Gradilla para tubos,
• 2 Pipetas volumétricas de 5 mL.

67

• Computadora
Descripcion del desarrollo de la práctica
1. En un tubo con tapa de rosca, poner 5 mL de leche y 3 gotas de ácido

acético glacial.
2. Agregar también 2 mL de agua oxigenada.
3. Agregar 3 gotas de bencidina y se agita.
Lectura
1. La prueba es positiva cuando a los 30 segundos aparece una coloración

azul intenso.
Evaluación

Bibliografía

68

Práctica 9
Título: Pruebas sanitarias directas
Introducción
Las bacterias denominadas mesófilas o mesofílicas aerobias son todas

aquéllas que se desarrollan a temperaturas entre 20 y 40°C y que requieren de la
presencia de oxígeno para lograr su multiplicación. Entre los microorganismo
mesófilos se cuentan las bacterias acidolácticas, la microflora natural de la leche
cruda, coliformes y bacterias patógenas.
La cuenta de bacterias mesófilas aerobias se determina con el fin de

conocer el grado de contaminación del producto, en este caso leche cruda, y para
comparar los resultados con las normas sanitarias.
Existen varios métodos para determinar este tipo de microorganismos,

algunos de ellos son: conteo directo en placa, recuento en tubo, por BactoScan y
por bioluminiscencia.
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismo viables en

un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad
esta técnica no pretende poner en evidencia todos los microorganismos presentes.
La variedad de especies y tipos diferenciables por necesidades nutricionales,
temperatura requerida para su crecimiento, oxígeno disponible, etcétera, hacen
que el número de colonias contadas constituyan una estimación de la cifra
realmente presente, la que, no obstante, refleja si el manejo sanitario del producto
ha sido adecuado.
El fundamento de la técnica consiste en contar las colonias que se

desarrollan en el medio de elección después de un cierto tiempo y temperatura de
incubación, suponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo (o de un
69

agregado; UFC: unidad formadora de colonia). El método admite numerosas
fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de
varios factores.
Además de los métodos tradicionales para efectuar pruebas de cuenta total

de bacterias mesófilas aerobias en alimentos, entre ellos la leche y derivados,
existen en el mercado algunos productos que facilitan la ejecución de estas
pruebas; este es el caso de las placas Petrifilm ®, de la empresa 3 M, para el
recuento de aerobios.
Se trata de pequeñas placas de un material celulósico (o semejante)

embebidas con un medio nutritivo apropiado para las bacterias mesófilas aerobias,
y que posee un agente gelificante soluble en agua y un indicador (tetrazolio) que
facilita el conteo de las colonias tras la incubación de las placas a temperatura y
tiempo adecuados. Las placas Petrifilm vienen estériles y listas para usarse; es
decir, en un análisis de cuenta total de mesófilos ahorran tiempo y el engorroso
proceso de esterilizar material y preparar el medio de cultivo. Sin embargo, estas
placas “listas para usarse” tienen también limitaciones de empleo claramente
enunciadas por el fabricante, aunque para leche cruda y algunos lacticínios
pueden funcionar aceptablemente bien.
También por medio de las placas de Perifilm tenemos para cuenta de

coliformes totales y tenemos resultado aceptables y las mismas bondades que las
Petrifilm de cuenta total de mesófilos.
Determinar por medio de pruebas directas simplificadas en el laboratorio, el estado

sanitario (cuenta toral de mesófilos y cuenta de coliformes totales) de la leche para
70

Preparación y esterilización del material
Dilución primaria
Metodología
Diluciones adicionales
Siembra en placa
Incubación
Cuenta en placa
• Agua destilada
• Alcohol al 70%
• Solución de Hidróxido de Sodio 1.0 N. Disolver 4.0 g de hidróxido de

sodio y llevar a 100 mL con agua.
• Solución Reguladora de Fosfatos. Disolver 34.0 g de fosfato de sodio

monobásico en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2 con solución de
hidróxido de sodio 1.0. Llevar a un litro con agua. Esterilizar durante 15
minutos a 121°C ± 1,0°C. Conservar en refrigeración (solución
concentrada). Tomar 1.25 mL de la solución concentrada y llevar a un litro
con agua (solución de trabajo). Distribuir en porciones 9 mL según se
requiera. Esterilizar a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos. Después de la
esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo
deberán ser iguales a los iniciales.
71

• Agua Peptonada. Disolver 1.0 g de peptona y 8.5 g de cloruro de sodio en
un litro de agua. Ajustar el pH a 7 ± 0,1 con hidróxido de sodio 1,0 N.
Distribuir en porciones de 9 mL. Esterilizar a 121 ± 1,0°C durante 15
minutos. Después de la esterilización, el pH y los volúmenes finales de la
solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales. Si este diluyente no
es usado inmediatamente, almacenar en lugar oscuro a una temperatura
entre 0 a 5°C por un tiempo no mayor de un mes, en condiciones tales que
no alteren su volumen o composición.
• Tubos muestreadores al vacío
• Gradilla metálica
• Jeringas estériles de 5 o 10 mL
• Incubadora a 32-35°C
• Placas petrifilm para cuenta mesofílica y coliformes
• Autoclave
• Computadora
Preparación y esterilización del material
1. Poner a los tubos muestreadores 9 mL de solución diluyente de fosfato de

sodio de trabajo o de agua peptonada.
2. Hacer vacío extrayendo 5 mL de aire de los tubos, 2 veces con una jeringa
3. Esterilizar los tubos con solución diluyente a 121°C durante 15 minutos.
4. Dejar enfriar
72

Dilución primaria
1. Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un

arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos.
2. Tomar 1 mL de la muestra y diluir con 9 mL del diluyente el cual debe

encontrarse a una temperatura similar a ésta, evitando el contacto entre la
jeringa y el diluyente. En general, las diluciones de la muestra deben ser
preparadas inmediatamente antes del análisis y éstas deben ser usadas
para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su
preparación
Diluciones adicionales
1. Transferir 1 mL de la dilución primaria, en otro tubo conteniendo 9 mL del

diluyente estéril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la
pipeta y el diluyente.
2. Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un

arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos.
3. Tomar del tubo anterior 1.0 mL de muestra y colocar en otro y repetir la

operación hasta seis tubos.
Siembra en placa
1. Limpiar y desinfectar con alcohol una superficie plana.
2. Colocar la placa Petrifilm (cuenta total o coliformes) en la superficie.
3. Levantar el film superior (cubierta) y cuidadosamente depositar 1 mL de la

muestra diluida de leche cruda de los tubos 3 al 5 (diluciones 10-3 – 10-5)
en el centro de la placa.
4. Dejar caer el film superior (cubierta) encima de la muestra.
5. Con los dedos bien limpios y desinfectados, presionar muy ligeramente en

la zona de aplicación. Esto para distribuir uniformemente la muestra. No
deslizar los dedos sobre el film.
73

Incubación
1. Colocar las placas en la incubadora, en posición horizontal con el lado

transparente hacia arriba. Pueden hacerse pilas hasta de 20 placas. La
estufa/incubadora debe estar humidificada. Incubar durante 48 horas a 32-
35°C (37°C cuenta total coliformes).
Cuenta en placa
1. Tras la incubación, con un contador estándar de colonias (o una lupa

grande), contar todas las colonias rojas, independientemente de su tamaño
o intensidad.
Evaluación

Bibliografía

74

Práctica 10
Título: Pruebas de fosfatasa y peroxidasa así como fosfatasa residual
Introducción
Las fosfatasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de los ésteres

glicerofosforicos. En la leche hay dos fosfatasas, una alcalina (pH 9-10) y otra
ácida (pH 4), pero la más importante es la fosfatasa alcalina. Esta enzima es
glicoproteína que se encuentra en pequeña cantidad en la leche de principio de
lactación, pero cuya concentración va aumentando y al final de la lactación se
encuentra en la leche en una cantidad importante
La fosfatasa alcalina es una glicoproteína que contiene ácido siálico, su pH

óptimo es de 9.6 y es sensible al calor pues se inactiva a 62°C durante 15 minutos
o a 72°C durante 15 a 20 segundos. Los iones $%&' , $)&' y *+&' la activan y los
iones ,)&' , el yodo y la cisteína, la inhiben
La leche cruda contiene varias enzimas; la de mayor importancia para la

salud pública es la fosfatasa alcalina. Esta enzima tiene unas características de
destrucción térmica muy parecidas a las condiciones de temperatura- tiempo
empleadas en la pasteurización. Por lo tanto, si la actividad de la fosfatasa alcalina
de una leche pasteurizada, supera un determinado nivel, significa que su
tratamiento no ha sido correcto. La prueba de la fosfatasa consiste en valorar
colorimétricamente el fenol que se libera del fenilfosfato disódico.
La determinación de la actividad enzimática mediante la prueba de la

fosfatasa alcalina, se utiliza habitualmente como control de la pasteurización de la
leche. La inactivación de la enzima garantiza que todos los microorganismos
patógenos (al menos los que puedan crecer en la leche) han sido destruidos
durante el tratamiento térmico; también la mayoría parte de la enzima está en la
75

Lectura
membrana de los glóbulos grasos y, por lo tanto, la prueba de la fosfatasa es
menos sensible cuando se realiza sobre leche desnatada. Mientras que la
fosfatasa ácida se encuentra en el suero y es bastante termorresistente.
Considerando la NOM-243-SSA1-2010, la cual establece las

especificaciones sanitarias y nutrimentales que debe cumplir la leche, fórmula
láctea, producto lácteo combinado y los derivados lácteos. Dentro de las
especificaciones físicas y químicas de esta norma se encuentra la prueba de la
fosfatasa, que es utilizada para verificar la correcta pasteurización. Por lo que es
necesario que esta sea de fácil entendimiento, para que pequeños productores
puedan emplearla correctamente.
Para el caso de la elaboración del queso con cuajo, un sobrecalentamento

de la lewche por arriba de las temperaturas de pasterurización, existen probelmas
de actividad de la enzima coagulante (cuajo), sobre las caseínas y entonces, no
se forma el gel del queso. Con el propósito de observar este sobrecalentamiento,
se utilza como indicador la actividad de la latoperoxidasa en donde la prueba ebe
ser positiva y en el caso del sobrecalentamiento es negativa.
Determinar por medio de pruebas de fosfatasa, fosfatasa residual y peroxidasa, la

pasteurización satisfactoria de la leche a fin de interpretar los resultados con base
en la normatividad vigente.
Prueba de fosfatasa
Metodología
76

• “kit” para efectuar prueba de fosfatasa alcalina en leche (marca Lacto-

Zyma)
• 2 tubos de ensayo de unos 20 mL,
• Gradilla metálica para tubos
• Pipetas de 10 y 1 mL.
• Baño María para tubos de ensayo
• Computadora
1. Tomar una muestra de 1 mL de la leche pasteurizada y depositarla en un

tubo de ensayo en el cual, se han colocado 9 mL de agua destilada.
Mezclar por agitación.
2. Preparar una muestra de la leche cruda original de la misma manera.
3. A ambos tubos de ensayo, agregar “una cucharadita” (porción ya medida),

del reactivo I del kit, agitar e incubar en un baño María con agua a 37°C
durante 5 minutos.
4. Transcurrido el tiempo indicado, adicionar una cucharadita del reactivo II del

kit y volver a incubar cada tubo durante 5 minutos.
Lectura
1. Retirar los tubos del baño María y observar el líquido. Si se presenta una
coloración café-grisácea, en la leche pasteurizada, la prueba indica que el
proceso estuvo bien efectuado. Si aparece con una coloración azul nítida,
77

Lectura
como la leche cruda testigo, es que el proceso no estuvo bien realizado, y
la leche está cruda todavía.
Prueba de peroxidasa
Metodología
• Solución de guayacol al 0.5% en alcohol
• Solución de peróxido de hidrógeno al 0.8%
• 2 tubos de ensayo de unos 10 mL con tapón de rosca,
• Gradilla para tubos,
• Una pipeta de 5 mL y
• 2 pipetas de 1 mL.
• Computadora
1. Tomar una muestra de 2 mL de la leche y depositarla en un tubo de

ensayo.
2. Agregar sin mezclar, 1 mL de solución de guayacol y 1 mL de peróxido de

hidrógeno.
78

Elaboración de curva tipo
3. Agregar sin mezclar, 1 mL de solución de guayacol y 1 mL de peróxido de
Lecturahidrógeno.
4. Esperar el desarrollo de color (café o amarillo).

Obtención de unidades de fenol
Lectura
1. Si el color amarillo o café, no aparece en 3.5 minutos considérese la prueba

negativa. Si apareciera después de 3.5 minutos, también es negativa.
Determinación de fosfatasa residual
Metodología
• Hidróxido de bario octahidratado (Ba (OH) 2 8 H2 O).
• Ácido bórico (H3 BO3).
• Metaborato de sodio (NaBO2).
• Cloruro de sodio (NaCl).
• Borato de sodio decahidratado (Na2 B4O7 10 H2 O).
• Fenilfosfato disódico (Cristales libres de fenol) (Na2 C6H5PO4) 2H2 O.
• Alcohol butílico (C4 H10 O).
• Sulfato de zinc heptahidratado (Zn SO4. 7 H2 O).
• Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 5 H2 O).
79

• Fenol (C6H6 O).
• Reactivo desarrollador de color del kit de Lacto-Zyma II.
• Solución reguladora de hidróxido de bario-borato (pH 10,6 ± 0,15 a

25°C). Disolver 25 g de hidróxido de bario octahidratado en agua caliente y
diluir a 500 mL. Disolver 11 g de ácido bórico y diluir a 500 mL. Calentar
cada una de las soluciones a 50°C y mezclar. Agitar y enfriar
aproximadamente a 25°C. Ajustar el pH a 10.6 ± 0.15, con la solución de
hidróxido de bario-borato y filtrar. Conservar la solución en un recipiente
bien cerrado. Para leche y quesos: Antes de su uso, diluir la solución con la
misma cantidad de agua. Por ejemplo: diluir 500 mL de esta solución
reguladora con 500 mL de agua.
• Soluciones reguladoras de trabajo con fenil fosfato disódico. Disolver

0.1 g de fenil fosfato disódico en 100 mL de la solución reguladora de
hidróxido de bario-borato.
• En caso de que el fenil fosfato disódico no esté libre de fenol debe ser
purificado de la siguiente manera: Disolver 0,5 g de fenilfosfato disódico
en 4.5 mL de agua; agregar 0,5 mL de la solución reguladora de hidróxido
de bario-borato y dos gotas de reactivo B.Q.C.(0.5 g de Lacto-Zyma II);
dejar en reposo 30 min. Extraer el color formado con 2.5 mL de alcohol
butílico. Si fuese necesario, repetir la extracción del color. Luego de
separar, descartar el alcohol butírico. Diluir 1 mL de esta solución en un
matraz aforado de 100 mL y añadir el regulador de hidróxido de bario-
borato hasta aforar. Calentar la solución a 85°C por 2 min, tapar
inmediatamente y guardar en refrigeración. Esta solución madre debe
mantenerse en el refrigerador durante algunos días. Al emplearse,
desarrollar el color y eliminarlo por extracción como se ha indicado
anteriormente. La solución es estable por un año si se encuentra bien
guardada y con mínima exposición al aire. Antes de usar, desarrollar el
color y reextraer si es necesario.
80

• Solución reguladora para desarrollo de color (pH 9.8 ± 0.15 a 25°C).
Disolver 6.0 g de metaborato de sodio y 20.0 g de cloruro de sodio en agua
y diluir a un litro. Conservar en refrigeración.
• Reactivo precipitante de proteínas zinc-cobre. Disolver 3 g de sulfato de

zinc heptahidratado y 0.6 g de sulfato de cobre pentahidratado en agua y
diluir a 100 mL.
• Solución de sulfato de cobre para patrones al 0.05%. Disolver 0.05 g de

sulfato de cobre pentahidratado en 100 mL de agua.
• Solución de 2,6-dibromoquinonacloroimida (B.Q.C.). Agregar 0.6 g de

Lacto-Zyma II.
• Solución madre de fenol de 1 mg/mL. Pesar exactamente 1.0 g de fenol,

transferir a un matraz volumétrico de un litro y llevar al volumen con agua.
Mezclar perfectamente. Esta solución es estable durante varios meses
mantenida en refrigeración.
• Solución patrón de fenol de 10 μg/mL o 10 unidades/mL (solución de

trabajo). Diluir 10 mL de la solución madre de fenol a un litro con agua y
mezclar perfectamente. De manera semejante preparar las soluciones
patrón que contengan 20, 30 y 40 unidades por mL. Guardar en
refrigeración y permitir que esté a la temperatura ambiente en el momento
de su uso.
• Computadora
1. Preparación de Soluciones patrón para estándares: En cuatro matraces

volumétrico de 100 mL añadir 5, 10, 30 y 50 mL de la solución patrón de
81

fenol de 10 μg/mL, posteriormente adicionar agua destilada, agitar y aforar.
Estas soluciones contienen respectivamente 0.5; 1.0; 3.0 y 5.0 μg o
unidades de fenol por mL.
2. Pipetear 1 mL de cada solución patrón en tubos de ensayo para obtener

una serie de muestras conteniendo 0.0 (blanco), 0.5; 5.0; 1.0; 3.0; 10.0;
20.0; 30.0 y 40.0 μg o unidades de fenol por mL, como se indica en cuadro.
El blanco se obtienen pipeteando 1 mL de agua destilada.
40.0 -.
0 -. de 0.5 -. de 1.0 -. de 3.0 -. de 10 -. de 20 -. de 30 -. de
Reactivo de
fenol/mL fenol/mL fenol/mL fenol/mL fenol/mL fenol/mL fenol/mL
fenol/mL
Solución patrón 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Agua 4.0 mL 3.0 mL 3.0 mL 3.0 mL 3.0 mL 3.0 mL 3.0 mL 3.0 mL
Desarrollador de
5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL 5.0 mL
color
Sulfato de cobre 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL
Reactivo de
0.6 g 0.6 g 0.6 g 0.6 g 0.6 g 0.6 g 0.6 g 0.6 g
lactozima
3. Pipetear sucesivamente en cada tubo de ensayo 1 mL de la solución de

sulfato de cobre al 0.05 %, con objeto de aumentar la intensidad del color
azul y la estabilidad de los patrones
4. Agregar en cada tubo de ensayo 5 mL de la solución para el desarrollo de

color, 3.0 mL de agua y 0.6 g de reactivo de Lacto-Zyma II. Mezclar.
5. Dejar en reposo 30 min, a temperatura ambiente para desarrollo de color.

82

6. Realizar la lectura de la intensidad del color con un espectrofotómetro a 610
nanómetros, restar el valor que alcanza la lectura del testigo a la de cada
una de las soluciones patrones de fenol.
7. Establecer una curva de calibración la cual debe ajustarse mediante el

método de mínimos cuadrados (regresión lineal).
Ejemplo:
Se tienen los datos de lectura en el cuadro siguiente:
Concentración de fenol A610
0 0
0.5 0.007
1 0.014
3 0.061
5 0.081
10 0.2
20 0.359
30 0.523
40 0.764
83

Con los datos se elabora la siguiente gráfica
1. Medir con pipeta 1 mL de leche fluida y colocar dentro de cada uno de dos
tubos de ensayo. Uno de ellos será el testigo.
2. Agregar a cada tubo 10 mL de la solución reguladora de trabajo con fenil

fosfato disódico, posteriormente tapar los tubos y agitar.
3. Calentar el tubo testigo en un baño de agua a ebullición cubierto durante 1

min (la temperatura interna del tubo debe estar entre 85-90°C). Dejar enfriar
a temperatura ambiente y agitador.
4. Colocar el otro tubo en baño de agua a 37°-38°C. Incubar ahí por una hora.
Agitando el contenido de vez en cuando.
5. Trasladar el tubo a un recipiente con agua a ebullición durante 1 min. Dejar

enfriar a temperatura ambiente por inmersión en un recipiente de agua fría.
6. Añadir 1.0 mL de la solución precipitante de proteínas zinc-cobre, a tubos

problema y testigo y agitar. El pH de la mezcla debe ser de 9.0 -9.1.
84

7. Filtrar empleando embudos de 5 cm de diámetro y papel filtro No. 42 de 9
cm de diámetro o bien el No. 2 o su equivalente; recoger 5 mL del filtrado
en tubos graduado en 5 y 10 mL. Descartar los primeros filtrados hasta
obtener un líquido nítido.
8. Agregar a cada tubo 5 mL de solución reguladora para desarrollo de color y

0.6 g del reactivo de Lacto-Zyma II, agitar y dejar a temperatura ambiente
durante 30 min para desarrollo de color.
Lectura
1. Leer la intensidad del color azul midiendo en el espectrofotómetro la

absorbancia de la muestra por referencia a la prueba en blanco a 610 nm y
a los estándares preparados.
Obtención de unidades de fenol
1. Para calcular la actividad de la fosfatasa expresada en microgramos de

fenol por mL, empleando la formula siguiente:
U. de Fenol/mL = C x 2.4
donde:
C = concentración de la muestra obtenida de la gráfica de la curva patrón

en unidades fenol/mL.
2.4 = Factores de dilución.
Ejemplo: Se obtienen los datos de la tabla al leer la muestra o problema:
Muestra Lectura (a 610 nm)

1 0.346
2 0.335
3 0.375
Testigo 0.168
85

Restar a cada una de las muestras el testigo.
Absorbancia Final = Absorbancia –Testigo
0.346 − 0.168 = 0.178
Muestra A610 A610 Final
1 0.346 0.178
2 0.335 0.167
3 0.375 0.207
Testigo 0.168
Transformando los valores de absorbancia a mgF/mL por medio de la ecuación de

la recta obtenida de la curva tipo tenemos:
Muestra mgF/mL
1 9.70
2 9.11
3 11.26
Obteniendo las unidades de fenol/mL (miligramos de fenol por mililitros);

aplicamos la ecuación: U de fenol/ mL = C×2.4, tenemos:
Muestra mgF/mL
1 23.28
2 21.86
3 27.04
En la leche cruda se obtuvieron los siguientes resultados, estos valores no se

puede comparar con los límites máximos que especifica la norma, dado que solo
86

hay límites para los productos pasteurizados, pero es evidente la actividad de la
fosfatasa residual.
En tanto que la leche pasteurizada y de la UACH se representan en el cuadro

siguiente en los cuales se mantienen dentro de la norma ya que no supera el
límite máximo de fosfatasa residual de 4 UF/g o mgF/g.
Muestra mgF/mL
1 2.80
2 3.11
3 2.70
Evaluación

Bibliografía

87

Práctica 11
Título: Pruebas directas e indirectas de células somáticas
Introducción
Las células somáticas están constituidas por una asociación de leucocitos y

células epiteliales. Los leucocitos se introducen en la leche en respuesta a la
inflamación que puede aparecer debido a una enfermedad o, a veces, a una
lesión. Las células epiteliales se desprenden del revestimiento del tejido de la
ubre.
Se denomina a las células de la leche, a aquellas células propias del cuerpo

(somáticas) en la leche. Estas provienen de la sangre y del tejido de la glándula
mamaria. El contenido de células somáticas en la leche nos permite conocer datos
claves sobre la función y el estado de salud de la glándula mamaria lactante y
debido a su cercana relación con la composición de la leche un criterio muy
importante de calidad de la leche.
Por tanto, las células somáticas son células corporales. Estas pasan a la
leche procedente de la sangre y del tejido glandular. El contenido de células
somáticas en la leche nos permite conocer el estado funcional y de salud de la
glándula mamaria en periodo lactante mastitis; debido a su estrecha relación con
la composición de la leche, es un criterio de calidad muy importante.
Los métodos más comúnmente empleados para determinar la presencia de

células somáticas (CCS) son los siguientes:
Conteo directo en placa al microscopio.
Prueba california (CMT).
Prueba de Wisconsin (WMT).
88

Lectura e interpretación de resultados

Prueba con diferentes “kit” para células somáticas
La NOM-243-SSA1-2010 propone como método directo la cuenta de las

células somáticas directamente en el microscopio usando un portaobjeto y tinción
con azul de metileno. En esta práctica proponemos el uso de portaobjeto y la
cámara de Neubauer
En uso del portaobjeto, se prepara un frotis distribuyendo una muestra de

leche cruda, sobre un portaobjetos. El frotis es secado y teñido para contar las
células somáticas bajo el microscopio. El número de células contadas en un área
determinada se multiplica por el factor de trabajo, obteniendo la cantidad de
células somáticas por mililitro.
Cuando se usa la cámara de Neubauer, se prepara un frotis distribuyendo

una muestra de leche cruda (10µL) en la cámara de Neubauer. El frotis es secado
y teñido para contar las células somáticas bajo el microscopio. El número de
células contadas en el área de la cuadrícula de la cámara de Neubauer, se
multiplican por 10 000, y se obtiene la cantidad de células somáticas por mililitro.
Determinar de manera indirecta el contenido de células somáticas en la leche para

Prueba California (CMT)
Metodología
• Reactivo a base de sulfato de trietanolamina o fenilsulfonato de sodio y

púrpura de bromocresol (reactivo para prueba de California).
• Agua destilada
89

• Paleta para prueba de California
• Pipeta graduada de 10 mL
• Computadora
Descripción del desarrollo de la prática
1. Tomar 4 mL de leche y colocarlos en la paleta
2. Agregar 4 mL de reactivo suavemente, evitando una posible formación de

espuma
3. Hacer movimientos de rotación de manera horizontal a la paleta, para

producir la mezcla de los líquidos, por 10-15 segundos
4. Seguir haciendo movimientos lentos de la mezcla mientras se interpretan

los resultados
1. Negativo (-). La mezcla permanece líquida, sin cambio apreciable y sin

formación de precipitado. Esta leche contiene entre 50 000 y 200 000
CS/mL.
2. b). Débil (+/-). Formación de precipitado, pero sin la tendencia a la

formación de un gel; si se mantiene el movimiento de rotación de la paleta,
el precipitado puede desaparecer. Estas leche contienen entre 200 000 y
400 000 CS/mL y posiblemente los cuartos estén infectados.
3. Positivo (+). La mezcla se espesa inmediatamente con tendencia a la

formación de un gel, que con el movimiento tiende a desplazarse de la
periferia de la paleta al centro. Estas leches contienen arriba de 500 000
CS/mL; en este caso, los cuartos están severamente dañados.
90

Acondicionamiento de la muestrea
Prueba Wisconsin (WMT)
Metodología
• Reactivo para prueba de WMT (puede emplearse el mismo de la CMT, pero

diluido con agua destilada, 1:1)
• Equipo para prueba de Wisconsin
• Cronómetro
• Dosificador de reactivo
91

• Computadora
Acondicionamiento de la muestrea
1. En los tubos especiales para la prueba agregar 3 mL de la leche y 3 mL de

reactivo
2. Tapar bien con los tapones de plástico especiales
3. Mover la gradilla con los tubos, 10 veces hasta posición horizontal, en un

lapso de unos 10 segundos aproximadamente
4. Dejar reposar los tubos durante 15 segundos y en éste lapso, cambiar los
tapones por los de calibración
5. Trascurrido el tiempo, invertir las gradillas, y en posición vertical dejar fluir la

mezcla durante 15 segundo exactos (usar el cronómetro).
6. Regresar la gradilla a posición normal.
1. Medir la altura (en milímetros) de la mezcla sobrante en cada tubo e

interpretar el resultado usando el cuadro siguiente.
92


Prueba de la cinta
Metodlología
• Solución activadora.
• Tiras de prueba. Son sensibles a la humedad. Usar en un plazo de 4 horas

luego de abrir el sobre
• Carta de color. Para estimar el número de células somáticas
• Pipetas, reutilizables. Para usar la pipeta oprima el bulbo de esta, coloque

la punta en la muestra de leche, y afloje el bulbo. Oprima nuevamente el
bulbo suavemente para dispensar una gota entera de leche. Para volver a
usar la pipeta, expulse la leche remanente y enjuague en la próxima
muestra o en agua, oprimiendo y desprensado el bulbo 3 a 4 veces.
• Tira de calibración, reutilizable. Para uso con el lector digital solamente.

Guarder en la bolsa que se vuelve a sellar cuando no esté en uso
• Lector digital de células somáticas.
• Computadora
1. Despuntar la teta de la vaca.
93

2. Recoger una muestra de leche en un envase limpio. No es necesario que el
envase esté estéril (lavar y secar los envases antes de usar. El uso de
antibióticos no interfiere con la prueba. Analizar la leche a no más de 8
horas de ordeñada. Si se tiene la leche en refrigeración, deje alcanzar la
temperatura ambiente antes de usar). Escribir la identificación de la muestra
en el envase. Mezclar la muestra.
3. Agregar una gota de leche al pocillo de la tira, utilizando una pipeta del kit.
Dejar que la leche se absorba completamente en el pocillo. (Usar las tiras al
abrigo de la luz solar a una temperatura entre 7 y 35°C. Mezclar la muestra
antes de hacer la prueba. Al agregar la leche a la tira, no deje que la pipeta
toque el pocillo de la tira.
4. Agregar 3 gotas de solución activadora al pocillo de la tira.
1. Si el nivel de células es muy alto, el color puede desarrollarse en pocos

minutos
2. Esperar 45 minutos antes de utilizar la carta de color o el lector digital.
3. Estime el número de células somáticas comparando la tira con la carta de

color o utilizando el lector digital
Uso del Lector Digital
a) Presione el botón azul de la izquierda. Espere hasta que el número 543

aparezca en la pantalla.
b) Coloque una tira de calibración dentro del lector (el pocillo de la tira abajo y
hacia adelante).
c) Remueva la tira de calibración cuando aparezca un símbolo de una tira con

una gota.
d) Coloque la tira de prueba (el pocillo abajo u hacia adelante).
e) Lea el resultado. Multiplique el número que aparece por 1 000 000

(ejemplo: 0.16 = 160 000 células somáticas´mL-1.
94

Preparación de la micropipeta
Método con el microscopio óptico para conteo de células somáticas con
portaobjetos
Preparación del portaobjetos Metodlología
Preparación del frotis
Tinción
Lectura en el microscopio
Conteo de células somáticas
Cantidad de células somáticas
• Alcohol etílico comercial (70%)
• Colorante Breed. Para la preparación de 100 mL de reactivo, se necesitan:

54 mL de etanol al 95%; 40 mL de Tetracloroetano; 0.6 g de azul de
metileno y 6 mL de ácido acético glacial. Mezclar el etanol y el
tetracloroetano en un vaso de precipitado y calentar en un baño de agua a
60-70 °C. Agregar azul de metileno, enfriar la mezcla a 4°C y agregar el
acido acético glacial. Filtrar la solución y almacenarla en un frasco con tapa
hermética.
• Paquete de gasas de enfermería
95

• Frasco gotero de aceite de inmersión
• Papel filtros con un tamaño de poro de 10 a 12 µm
• Gradilla con tubos de ensayo de 10 mL
• Micropipeta con capacidad de 0.01 µL con una tolerancia máxima de 2%
• Portaobjetos limpios y desengrasados
• Preparación de placas guía, con áreas de 20 mm ´ 5 mm. Con un

plumón de punto fino, marcar en un papel de color blanco; de forma
punteada, el tamaño del portaobjeto y dentro con línea continua, un
rectángulo de 20 mm por 5 mm. 2. Hacer varias placas guía en la hoja
poniendo el número de muestra.
• Parrilla Eléctrica
• Microscopio óptico de 10-100X
• Mechero
• Reloj
• Leches distintas
• Computadora
1. Antes del análisis, la muestra debe ser previamente mezclada en forma

manual de 5 a 10 veces de forma horizontal ó automática con un agitador
eléctrico de tubos de ensayo.
96

2. Calentar la muestra de leche cruda en un baño de agua a 30-40 °C.
Enfriarla a 20 °C, dependiendo de la calibración de la micropipeta la cual
viene en las especificaciones de la misma.
1. Preparar la micropipeta manual o automática, la cual debe ser graduada a

10µL.
Preparación del portaobjetos
1. Limpiar el portaobjeto con alcohol para desinfectarlo y secarlo, flamearlo

con la ayuda de un mechero o de un encendedor; enfriarlo antes de su
uso.
2. Colocar la placa guía debajo del portaobjeto.
1. Aplicar la muestra (10 µL) de tal forma que abarque toda el área.
2. Limpiar el aplicador de la micropipeta.
3. Limpiar el aplicador de la micropipeta.
4. Secar el frotis sobre una parrilla eléctrica caliente para acelerar el proceso.
Tinción
1. Sumergir el portaobjeto seco, o añadir con la ayuda de un gotero, hasta

cubrir perfectamente el área con la solución de Breed.
2. Reposar con el colorante por 15 minutos.
3. Pasado el tiempo de tinción, se procede a un lavado con agua corriente

hasta la completa eliminación del colorante
4. Escurrir y secar
1. Colocar el portaobjetos bajo el microscopio y localizar la muestra con un

objetivo de 40X.
97

2. Colocar una o dos gotas de aceite de inmersión y pasar a un objetivo de
100X.
1. Realizar el recuento en franjas de arriba hacia abajo, cada franja mide

aproximadamente 5 mm y cada vez que atraviesa el frotis se cuenta como
una franja.
2. El largo de cada franja es de 5 mm y el ancho de la franja corresponde al

diámetro del campo del microscopio, el cual se mide utilizando una lámina
micrométrica.
1. Contar al microscopio los núcleos de las células en el frotis (al menos 400).
2. El cálculo de células somáticas se hace como sigue:
Factor microscópico:
donde:
d: es el diámetro en mililitros del campo del microscopio
b: es el numero de franjas contadas completamente.
El número de células somáticas es multiplicado por el factor de trabajo, Wf para

obtener el número de células por mililitro de muestra.
Ejemplo:
Se tiene una muestra de leche de vaca holstein en pastoreo. Encontrar el conteo

de células somáticas si se hace el frotis y al verlo en el microscopio se encontró
una cuenta de 596 células en 22 franjas.
98

Se aplica la siguiente ecuación:
Preparación de la cámara de
Neubauer
Preparación
donde:
del frotis
d = 0.17 mm
Tinción
b = 22 franjas
Conteo de Células
células /mL = 534.75´596 = 318 717.
somáticas
Método con el microscopio óptico para conteo de células somáticas usando
la cámara de Neubauer
Metodología
99

• Alcohol etílico comercial (70%)
• Colorante Breed. Para la preparación de 100 mL de reactivo, se necesitan:

54 mL de etanol al 95%; 40 mL de Tetracloroetano; 0.6 g de azul de
metileno y 6 mL de ácido acético glacial. Mezclar el etanol y el
tetracloroetano en un vaso de precipitado y calentar en un baño de agua a
60-70 °C. Agregar azul de metileno, enfriar la mezcla a 4°C y agregar el
acido acético glacial. Filtrar la solución y almacenarla en un frasco con tapa
hermética.
• Cámara de Neubauer
• Microscopio óptico de 10-100X
• Reloj
• Computadora
1. Antes del análisis, la muestra debe ser previamente mezclada en forma

manual de 5 a 10 veces de forma horizontal ó automática con un agitador
eléctrico de tubos de ensayo.
2. Calentar la muestra de leche cruda en un baño de agua a 30-40 °C.

Enfriarla a 20 °C, dependiendo de la calibración de la micropipeta la cual
viene en las especificaciones de la misma.
100

Preparación del micropipeta
1. Preparar la micropipeta manual o automática, la cual debe ser graduada a

10µL.
Preparación de la cámara de Neubauer
1. Limpiar la cámara de Neubauer con alcohol para desinfectarlo y secarlo,

flamearlo con la ayuda de un mechero o de un encendedor; enfriarlo
antes de su uso.
1. Colocar la punta de la pipeta cerca del centro del área de la cámara de

Neubauer. Procurar distribuir homogéneamente la muestra sobre el
espacio de la cámara de Neubauer con ayuda de la punta de la
micropipeta.
2. Una vez usada la punta de la micropipeta se debe lavar, escurrir y guardar

en su caja.
3. Secar el frotis preferentemente al ambiente, sin embargo se puede acelerar

con ayuda de un secador de cabello, es recomendable colocar la secadora
aproximadamente a un metro de distancia.
Tinción
1. Cuando el frotis esté completamente seco, cubrirlo con ayuda del gotero
con la solución de Breed durante 15 minutos para que se tiñan los núcleos
de las células somáticas y puedan ser observadas.
2. Lavar la cámara de Neubauer por inmersión en agua corriente hasta la

completa eliminación de exceso de colorante. Es muy importante no aplicar
directamente el chorro de agua, pues el frotis se dañaría
3. Escurrir y secar nuevamente la cámara de Neubauer, y guardarla en un

lugar libre de polvo.
101

1. Colocar la cámara de Neubauer bajo microscopio y localizar con el objetivo

de 40 X la cuadrícula que se encuentra en el centro de cada frotis.
2. Una vez localizada la cuadricula, agregar una gota de aceite de inmersión y

cambiar al objetivo de 100 X, para iniciar el conteo.
1. Iniciar el conteo en un extremo de la cuadrícula y continuar en orden de

arriba para abajo con el propósito de contar todas las células somáticas que
se encuentren dentro de la cuadrícula central de la cámara de Neubauer, es
importante mencionar que también se deben contar las células que se
encuentran sobre las tres líneas que delimitan la cuadrícula.
1. Cuando se tiene el total de células contadas en la cuadrícula se multiplica

por 10000 y se obtiene el número de células por mililitro de la muestra.
Ejemplo:
Se tiene una muestra de leche de vaca holstein en pastoreo. Encontrar el conteo

de células somáticas si se hace el frotis en cámara de Neubauer al verlo en el
microscopio se encontró en la cuadrícula, una cuenta de 75 células somáticas.
El valor de células somáticas se multiplica por 10 000.
75´10000 = 750 000
Células somáticas/mL = 750 000
Evaluación

102

Bibliografía

103

Práctica 12
Título: Presencia de antibióticos así como la adición de agua
Introducción
Los inhibidores son sustancias químicas naturalmente presentes en leche

cruda, agregados involuntariamente (por ejemplo durante el tratamiento de vacas
mastíticas con antibióticos), o adicionados voluntariamente, a menudo de forma
fraudulenta, para evitar que la leche “caliente” se deteriore (vg. acidifique). Este
último caso sería el de la incorporación de peróxido de hidrógeno (H2O2), es decir,
agua oxigenada, o una sal generadora de este oxidante.
Ahora bien, existen inhibidores naturales como el sistema lactoperoxidasa

(SLP) cuyo componente clave es la enzima del mismo nombre, el cual se inactiva
cuando a la leche se le imparte un tratamiento térmico severo como la
ultrapasteurización (UHT), o una sobrepasteurización de más de 80°C por varios
minutos.
Sin embargo, cuando la leche cruda contiene relativamente altas

concentraciones de peróxido de hidrógeno, de residuos de higienizantes (como
cloro, yodo o sus derivados, u otros desinfectantes) y, peor aún, cuando contiene
residuos de antibióticos (ampicilina, cicloxilina, tetraciclinas, etc) porque estas
sustancias son termorresistentes, en menor o mayor grado, y logran soportar la
pasteurización, e incluso tratamientos más fuertes.
Lo importante es que si una leche cruda va a ser destinada para elaborar

productos fermentados, por ejemplo yogur o quesos con leche pasteurizada y
cultivos lácticos, debe estar libre de inhibidores. De otra manera, o no se obtiene
el producto (por ejemplo, el yogur), o sus características sensoriales pueden ser
atípicas o incluso desagradables, como en los quesos. Por eso es conveniente
104

Acondicionamiento del equipo
contar con pruebas que permitan identificar y, mejor aún si es posible, cuantificar
la presencia de inhibidores. En esta práctica se efectuarán la prueba de detección
de inhibidores: una que emplea un “kit” comercial, el SNAP o el BetaStar, para
Incubación
detectar antibióticos.
La adulteración de la leche cruda con agua es quizá la práctica fraudulenta más

Activación
común en muchos países, incluyendo a México. Esta práctica no es tan
infrecuente cuando la leche se comercializa cruda por medio de “boteros”, quienes
la venden al menudeo directamente a las amas de casa, aunque también se
presenta en el abasto de pequeñas empresas que fabrican quesos y otros
derivados.l
Determinar la presencia de antibióticos y la adición de agua en leche a fin de

Presencia de antibióticos en leche
Metodología
105

• Cápsula o pastilla de antibiótico (ampicilina)

• “Kit” para la prueba de SNAP (Incubador/aplicador, tubo de mezcla y
micropipeta)
• Computadora
Acondicionamiento del equipo
1. Conectar el aparato (incubador/aplicador).
1. Agitar completamente la muestra de leche
2. Con la pipeta, tomar la muestra de leche hasta la marca (450 µL ± 50µL).
Incubación
1. Incubar el tubo y el SNAP a 45 ± 5°C; para: betalactámicos 5 minutos; para

tetraciclinas, 2 minutos. Evitar incubar más de 6 minutos
Activación
1. Adicionar la muestra en la celda para muestra. Cuando la muestra alcance

el punto de activación y el color comienza a desaparecer hay que presionar
con fuerza el activador
1. Leer el resultado. El resultado es negativo cuando el color del punto de la

muestra es más oscuro o igual que el color del punto control. Entonces
quiere decir que no hay residuos de antibióticos en la leche cruda
106

2. El resultado es positivo cuando el color del punto de muestra es más claro
que el color del punto de control. Si es así, la leche cuya muestra se probó,
contiene residuos de antibióticos
Prueba de adición de agua con el uso del lactodensímetro
Metodología
• Agua destilada
• Lactodensímetro
• Termómetro ( -10°C a 110°C)
• Computadora
1. Determinar la densidad de la leche de referencia a 15°C (0% de agua

añadida), la cual sabemos que no tiene agua.
2. Agregar a la leche 5, 10 y 20% agua destilada medir la densidad referida a

15°C.
3. Con los datos obtenidos hacer una gráfica en donde en el eje de las “X”
poner la cantidad de agua añadida (0, 5, 10, 20%), respetando la escala. Y
107

Lectura de leche de referencia
Lectura de leche problema

en el eje de las “Y”, poner los datos de densidad para cada valor de agua
Interpretación deañadida.
resultados
1. Se determina la densidad de la leche problema referida a 15°C
2. Se interpola el valor de densidad obtenido en la gráfica. De ésta manera se

determina la cantidad de agua agregada.
Prueba de adición de agua con el uso del lactómetro
Metodología
• Agua destilada
• Lactómetro monoprismático “Bertuzzi” escala 0-20%
• Agitador de vidrio
• Computadora
Lectura de leche de referencia
1. Determinar el contenido de SNG de la leche de referencia (la cual sabemos

que no tiene agua) con el lactómetro.
108

Lectura de leche problema
1. Se determina el contenido de SNG de la leche problema. Para saber la

cantidad de agua añadida se consulta la tabla siguiente:
Tabla para el cálculo del agua añadida en función con el lactómetro

monopismático “Bertuzzi”.
1. Si la leche pura de una determinada región señala constantemente en el

lactómetro un residuo no graso de 8.8 y de la misma región se examina una
partida de leche sospechosa con un residuo no graso de 8.2, la diferencia
entre los grados de la leche pura y la leche sospechosa será de 8.8 – 8.2 =
0.6. Se consulta la tabla primera y en la tabla inferior se consulta el % de
agua añadida que, en el caso del ejemplo que damos es de: 6.6%.
Prueba de adición de agua con el uso del crióscopo
Metodología
• Agua destilada
• Ccrióscopo Gerber
• Termómetro ( -10°C a 110°C)

109

• Computadora
1. Determinar el punto crioscópico de la leche de referencia a 15°C (0% de

agua añadida), la cual sabemos que no tiene agua.
2. Agregar a la leche 5, 10 y 20% agua destilada medir el punto crisocópico.
3. Con los datos obtenidos hacer una gráfica en donde en el eje de las “X”
poner la cantidad de agua añadida (0, 5, 10, 20%), respetando la escala. Y
en el eje de las “Y”, poner los datos de punto crioscópico para cada valor de
agua añadida.
1. Se determina el punto crioscópico de la leche problema.
2. Se interpola el valor de punto crioscópico obtenido en la gráfica. De ésta

manera se determina la cantidad de agua agregada.
Evaluación

Bibliografía

110

111

Práctica 13
Título: Pruebas cuantitativas y cualitativas de diferentes adulterantes (agua oxigenada,
derivados clorados, frmaldehído, neutralizantes y sales cuaternarias de amonio)
Introducción
El agua oxigenada, desde antaño, ha sido empleada como un conservador

de la leche cruda, sobre todo en las zonas tropicales o en aquéllas en donde la
leche “se pasea” mucho, es decir, donde la colecta es tardada y difícil. Esta
sustancia inhibe la acidificación de la leche, al actuar sobre la flora láctica.
Como en el caso de los neutralizantes, la adición de peróxido de hidrógeno

no está permitida en la leche cruda, ni en los lacticínios. Esto porque enmascara la
verdadera calidad sanitaria de la leche. Además, el uso de este conservador debe
ser proscrito porque al elaborar derivados con leche cruda que lo contengan, por
ejemplo queso “crudo”, es muy posible que su pH no descienda, tornando
inseguros (no inocuos) a los productos.
El agua oxigenada generalmente se aplica en leche cruda como una

solución de 10 a 30 volúmenes. Con una dosis mínima con respecto a la leche, ya
se evidencia claros efectos inhibitorios de la acidificación. Sin embargo,
presuntivamente, en la realidad se manejan dosis grandes.
Existen dos métodos muy aplicados para detectar la presencia de este

conservador: el método de la APHA (American Public Health Association), que
emplea ácido vanádico, y el método del yoduro de potasio.
En zonas del país donde se produce leche con los sistemas de doble
propósito (por ejemplo, el trópico) y de traspatio, y donde todavía operan
intermediarios que acopian leche cruda para venderla a consumidores intermedios
o finales, no es raro neutralizar la leche cruda que se torna ácida por la
fermentación láctica.
112

Esta práctica está prohibida por la legislación; sin embargo, ante la
posibilidad de perder la leche, los “ruteros”, “boteros” y otros agentes
intermediarios acuden a la incorporación de sosa (hidróxido de sodio), bicarbonato
de sodio, cal (óxido de calcio), cal apagada (hidróxido de calcio) o, incluso,
Alkaseltzer ®, para neutralizar la acidez desarrollada en la leche.
Otro conservador usado en el manejo de la leche y para la limpieza de los

utensilios de elaboración de queso, son los derivados clorados.
El uso de formaldehido como sustancia conservadora data de tiempos

remotos, así como cita Teyxeira en 1910 de que fue Behring quien propuso unir el
formaldehido a la leche como medio de conservación; en la proporción de 2 mL/L
tiene el poder de conservar la leche por 100 h a una temperatura de 25 °C.
Sin embargo, dentro de la industria láctea el formaldehido es una de las

principales sustancias utilizadas para estas alteraciones de la leche. Ya que este
elemento ha sido utilizado como agente conservador para muestras de leche que
van a ser analizadas desde el punto de vista químico y como bacteriostático en la
leche destinada para la fabricación de algunos tipos de quesos efecto estudiado
por (Brock, 1962), quien encontró que el formaldehído en soluciones diluidas (20-
50% µg /ml), tiene la capacidad de inhibir la división celular en cepas de
Aerobacter aerogenes y Pseudomona aeruginosa.
Su utilización ha suscitado discusiones, sobre su eficacia, en contraste con

las posibles alteraciones que podría ocasionar en las características
organolépticas del producto, en el proceso de la coagulación, en el equilibrio
microbiano y en la actividad enzimática Otra aplicación que se le ha dado al
formaldehído, debido a su efecto antimicrobiano, es como adulterante en leches
de baja calidad.
Para este caso, en la leche Pasteurizada, Ultra-pasteurizada y Esterilizada

deben de presentar prueba de inhibidores bacterianos, negativa; detectada por
métodos fisicoquímicos, como es el caso de la prueba de Formaldehido (Norma
Oficial Mexicana NOM-243-SSA1, 2010).
113

Por otro lado, en zonas del país donde se produce leche con los sistemas
de doble propósito (vg. el trópico) y de traspatio, y donde todavía operan
intermediarios que acopian leche cruda para venderla a consumidores intermedios
o finales, no es raro neutralizar la leche cruda que se torna ácida por la
fermentación láctica.
Esta práctica está prohibida por la legislación; sin embargo, ante la

posibilidad de perder la leche, los “ruteros”, “boteros” y otros agentes
intermediarios acuden a la incorporación de sosa (hidróxido de sodio), bicarbonato
de sodio, cal (óxido de calcio), cal apagada (hidróxido de calcio) o, incluso,
Alkaseltzer ®, para neutralizar la acidez desarrollada en la leche.
La neutralización de la leche es objetable porque constituye un fraude, al

hacer pasar por normal, dulce, una leche que ya se ha deteriorado por
acidificación natural. Además, porque se enmascara su calidad microbiológica, al
querer ocultar las altas cargas de microorganismos (de bacterias acidificantes,
pero también de coliformes y otros).
Afortunadamente la neutralización puede revelarse a través de la prueba

del ácido rosólico (coralina).
En la actualidad es muy común el uso de productos que tienen “amoniaco”

para limpiar utensilios de ordeña o de proceso, que al no enjuagarse
adecuadamente queden en la leche y pueden causar inhibición de los
microorganismos necesarios para el proceso como el de quesos; por lo que se
hace necesario el detectar su presencia.
Determinar la presencia de de diferentes adulterantes en leche a fin de interpretar

los resultados con base en la normatividad vigente.
114

Prueba cualitativa de presencia de agua oxigenada en leche usando el
método de la APHA (American Public Health Association), del yoduro de
potasio
Metodología
• Reactivo de yoduro de potasio (25 g de KI en 100 mL de agua destilada).

• 2 tubos de ensayo, de 20 mL.
• Computadora
1. En un tubo se colocan 10 mL de leche dulce, cruda; en el otro 10 mL de

leche con peróxido de hidrógeno.
2. En cada tubo se agregan 5 gotas de solución de KI.
3. Se agitan suavemente con los dedos.
1. Si aparece un color amarillo, o ligeramente café (por el yodo liberado), la

prueba es positiva, esto es, sí existe peróxido. Si no hay cambios de color
(persiste el blanco), la prueba es negativa.
115

Prueba cualitativa de presencia de agua oxigenada en leche usando el
método de pentóxido de vanadio
Metodología
• Solución de ácido sulfúrico al 6%(v/v). En un vaso de precipitados medir 94

mL de agua y lentamente resbalando por las paredes, adicionar 6 mL de
H2SO4 concentrado.
• Solución de pentóxido de vanadio (V2O5). Disolver 1 g de pentóxido de

vanadio en 100 mL de solución de ácido sulfúrico (6 + 94).
• Gradilla con tubos de ensayo con tapón
• 2 pipetas de 10 mL
• Computadora
1. En un tubo de ensayo se colocan 10 mL de leche problema; en el otro 10

mL de leche con peróxido de hidrógeno.
2. Agregar de 0,5 a 1,0 mL del reactivo de pentóxido de vanadio.
1. La aparición de un color rosa o rojo, indica la presencia de peróxido de

hidrógeno (oxidante).
116

Prueba cualitativa de presencia de derivados clorados
Metodlolgía
• Yoduro de potasio (KI). Solución al 7%
• Acido clorhídrico (HCl) diluido 1:2. A 100 mL de ácido clorhídrico agregar

200 mL de agua.
• Solución de almidón (C6H10O5)n. Suspender 1g de almidón en un poco de

agua fría, homogeneizar y agregarlo a 100 mL de agua hirviendo, agitar
hasta disolución completa, enfriar antes de usar. Utilizar solución
recientemente preparada
• Baño de agua a 85°C
• Tubos de ensaye de 16 x 150 mm
• Pipetas graduadas de 10 mL
• Embudos de filtración
• Papel filtro
• Baño de hielo
• Computadora
117

Destilación

Desarrollo de color
1. resultados
Interpretación de En un tubo de ensayo se colocan 5.0 mL de leche problema; en el otro 5.0
mL de leche con derivados clorados.
2. Agregar de 1.5 mL de solución de yoduro de potasio al 7%, agregar 4 mL

de HCl diluido y mezclar perfectamente con una varilla de vidrio.
3. Sacar los tubos y enfriarlos rápidamente colocarlos en baño de hielo.
4. Filtrar, recoger el filtrado en un tubo de ensayo. Agregar al filtrado 0.5 a 1.0

mL de solución de almidón.
1. La aparición de un color azul grisáceo que va desde azul hasta el azul

morado (de acuerdo con la concentración de cloro presente), indica la
presencia de cloro.
Prueba cualitativa de la presencia de formaldehido
Metodlogía
• Ácido fosfórico (H3PO4).
• Sal disódica del ácido cromotrópico (C10H8Na2O8S2).
• Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4).
118

• Formaldehído (CH2O) al 37%, densidad = 1,08 g/L.
• Solución de ácido sulfúrico al 72%.
• Solución saturada de sal disódica del ácido cromotrópico. Se disolvió

500 mg de sal disódica del ácido cromotrópico en 100 mL de solución de
ácido sulfúrico al 72%. Se Enfrió a temperatura ambiente.
• Solución de formaldehído de 40 mg/L.
• Equipo de destilación Kjeldahl FOSS.
• Spectrophotometers-Spectronic
• Tubos Kjeldahl de 400 mL
• Material común de laboratorio
• Computadora
1. Para analizar la leche cruda en el tubo de Kjeldahl se vació 50 mL de leche,

se adiciona 50 mL de agua y se acidifica con 1 mL ácido fosfórico
adicionando 0.5 mL de exceso.
2. Se preparó una solución control de color, colocando en un tubo Kjeldahl, 50

mL de leche y 1 mL de solución de formaldehido.
Destilación
1. En el destilador Kjeldhal de cada tubo Kjeldahl destilar 50 mL.
Desarrollo de color
1. En cada uno de dos tubos de ensaye se colocar 1 mL del destilado y 5 mL

de solución saturada de sal disódica del ácido cromotrópico.
119

2. Colocar los tubos en baño María a ebullición durante 15 minutos. Observar
durante este periodo de calentamiento.
Destilación
3. Se Deja enfriar los tubos de ensaye y observan los resultados.

Desarrollo de color
1. Si la muestra se colorea de lila a púrpura la prueba es positiva.

Prueba cuantitativa de la presencia de formaldehido
Metoldología
• El material, equipo y reactivos de la cuantificación de formaldehido en leche

es el mismo al empleado para la determinación cualitativa.
1. En series de tubos Kjeldahl se vacía 50 mL de leche, se adiciona 50 mL de

agua y se acidifica con 1 mL de ácido fosfórico adicionando 0.5 mL de
exceso. Y agregar 0.5; 1.0; 2; 3; 4; y 4.5 mL de formaldehido, se
recomienda incluir el testigo (0.0 mL).
2. De cada tubo Kjeldahl destilar 50 mL.
120

:∗<
9=
100
3. En tubos de ensaye se colocar 1 mL del destilado y 5 mL de solución

saturada de sal disódica del ácido cromotrópico.
4. Colocar los tubos en baño María a ebullición durante 15 minutos. Observar

5. Se Deja enfriar los tubos de ensaye.
6. Hacer la lectura de la intensidad de color con un espectrofotómetro a 580

nm (A580).
7. Para poder elaborar la curva de calibración, restar el valor que alcanza la

lectura testigo a cada una de las muestras que se analizaron.
8. Posteriormente para determinar la concentración de formaldehido en la

leche se tomó en cuenta la pureza del formaldehido, el cual se encuentra a
37%. Y con la siguiente formula se calcula la concentración de
formaldehido:
donde:
× = Concentración de formaldehido.
F = mL de formaldehido que se usó en esa muestra de leche.
P = pureza del formaldehido (37%).
9. Finalmente construir una curva de calibración la cual debe de ajustarse

mediante el método de mínimos cuadrados (regresión lineal).
1. Para analizar la leche cruda en el tubo de Kjeldahl se vació 50 mL de leche,

se adiciono 50 mL de agua y se acidifica con 1 mL ácido fosfórico
adicionando 0.5 mL de exceso.
Destilación
1. En el destilador Kjeldhal de cada tubo Kjeldahl destilar 50 mL.
121

Desarrollo de color
1. En el tubo de ensaye se colocar 1 mL del destilado y 5 mL de solución

saturada de sal disódica del ácido cromotrópico.
2. Colocar el tubo en baño María a ebullición durante 15 minutos. Observar

3. Se Deja enfriar el tubo de ensaye y observan los resultados.
1. Después de someter a calentamiento el tubo de ensaye se deja enfriar y se

lleva para leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 580
nanómetros (A580).
2. Con la ecuación de la recta de la curva tipo, se interpola el resultado de

lectura de absorbancia de la leche y se encuentra la concentración de
formaldehido.
Ejemplo: Después de someter a calentamiento el tubo de ensaye se deja enfriar y

se lleva para leer en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 580
nanómetros (A580).
Con la ecuación de la recta de la curva tipo, se interpola el resultado de lectura de

absorbancia de la leche y se encuentra la concentración de formaldehido.
mL de formaldehido al 37% A
580
0 0.076
0.5 0.273
1 0.421
2 0.836
3 1.14
4 1.383
4.5 1.545
122

:∗<
9=
100
Para poder elaborar la curva de calibración a cada una de las lecturas se le resto
la lectura que arrojo el tubo que fue el testigo. Los datos que se obtuvieron son los
que se muestran enseguida:
mL de formaldehido A
580
0 0
0.5 0.197
1 0.345
2 0.76
3 1.064
4 1.307
4.5 1.469
Posteriormente para convertir los mililitros de formaldehido en porcentaje se utiliza

la siguiente fórmula:
Donde:
9 = Concentración de formaldehido (%).
F= mL de formaldehido que se usó en esa muestra de leche.
P= pureza del formaldehido (37%).
Sustituyendo cada uno de los valores que existen en la tabla anterior por ejemplo
para 0.5 mL tenemos que:
=,> ?@∗AB %
9= = 0.185 Es la cantidad (%) de formaldehido presente.
D== ?@
123

Todos los resultados obtenidos se muestran en la tabla siguiente:
Concentraciónde formaldehido (%) A580
0 0
0.185 0.197
0.37 0.345
0.74 0.76
1.11 1.064
1.48 1.307
1.665 1.469
Finalmente se construyó la curva de calibración la cual se ajusta mediante el

método de mínimos cuadrados (regresión lineal).
Curva patrón para formaldehido

1.6
1.4
y = 0.8798x + 0.0371
1.2 R² = 0.99412
1
Absorbancia
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
Concentración de formaldehido (%)
124

De acuerdo a la R2 podemos ver que nuestros resultados son los correctos y que
ahora de acuerdo a la absorbancia que tomemos en otras muestras a analizar,
verificaremos cuánto formaldehido tienen la muestra problema.
Si en la muestra tenemos una lectura a 580 nm de 0.115, entonces:
Aplicamos la ecuación de la de la curva tipo:
y = 0.898x + 0.0371
donde:
y = lectura a 580 nm (0.095)
x = % de formaldehido
Por lo tanto:
0.115 − 0.0371
9= = 0.088
0.8798
Entonces decimos que la leche contiene 0.088% de formaldehido
Prueba cualitativa de presencia de neutralizante
Metodología
• Solución alcohólica de ácido rosólico. 1 g de ácido rosólico en 100 mL de

alcohol etílico.
• Alcohol etílico al 65% en agua destilada.
• Gradilla con tubos de ensayo con tapón
• Frasco gotero
125

• Computadora
1. En un tubo de ensayo, se mezclan volúmenes iguales (3-5 mL) de leche y

alcohol etílico al 65%. En otro, se mezcla (3-5 mL) de leche neutralizada e
igual volumen de alcohol etílico al 65%.
2. Se agrega en cada tubo 2-3 gotas de ácido rosólico al 1%, se agita y se

observa.
1. Si aparece un color rosa en la mezcla leche-alcohol, la prueba es positiva;

es decir, sí existen alcalinos (neutralizantes) en la leche. Si se desarrolla un
color amarillo-naranja, la prueba es negativa.
Presencia de sales cuaternarias de amonio en leche
Metoldología
• Anaranjado de metilo (C14H14N3NaO3S). Solución acuosa al 0.15%.
• Solución acuosa de hidróxido de sodio (NaOH). Disolver 66.5 g de hidróxido

de sodio en 100 mL de agua.
• Cloroformo (CHCl3)
• Sulfato de sodio anhidro (Na2SO4).
126

• Acido clorhídrico (HCl) 2N
• Cloruro de benzalconio [cloruro de n-alquil-(C12 a C18) bencildimetil amonio,

con un intervalo de peso molecular de 351-380 y conteniendo cadenas de
los grupos alquilo con 12 y 16 átomos de carbono], al 0,06%. Para
prepararlo considerar la concentración inicial del reporte del fabricante.
• Matraces Erlenmeyer de 125 mL
• Mortero de porcelana de 10 cm de diámetro
• Pipetas graduadas de 10 mL
• Embudos de filtración
• Tubos de ensayo
• Computadora
1. Colocar 25 mL de leche en un matraz Erlenmeyer
2. Agregar 0.5 mL de solución acuosa de anaranjado de metilo, 1 mL de

solución acuosa de hidróxido de sodio y 20 mL de cloroformo, agitar 3 min.
3. Pasar la emulsión resultante a un mortero al que previamente se le ha

agregado 50g de sulfato de sodio anhídro, triturar perfectamente.
4. Agregar 20 mL de cloroformo y filtrar.
5. Al filtrado agregar 5 mL de ácido clorhídrico 2 N y agitar
6. Preparar una solución control de color, colocando en un matraz Erlenmeyer

25 mL de leche y 0,5 mL de la solución de cloruro de benzalconio al 0,06%.
Proceder igual que en la muestra.
127

1. Un color magenta cereza en la capa acuosa es una prueba positiva de

cantidades mayores de 1 mg/kg de sales cuaternarias de amonio
Evaluación

Bibliografía

128

Práctica 14
Título: Presencia de materiales extraños
Introducción
La leche cruda puede contener materia extraña macroscópica en

suspensión debido a condiciones antihigiénicas de la ubre, o a contaminación del
fluido durante la ordeña o posterior a ella, a causa de un ambiente desaseado y un
manejo descuidado. Esto es más notorio cuando la ordeña se efectúa a mano y la
leche cae en cubetas o botes metálicos a menudo, también, mal higienizados.
En particular, la leche proveniente de los sistemas de producción extensiva

(generalmente de doble propósito), en los trópicos, y familiar (de traspatio), es
común que contenga materia extraña, ostentosa, en suspensión. Tal es el caso de
fragmentos de forraje, de insectos, residuos de alimentos, de paja, pelo, partículas
de estiércol, fragmentos minerales, etcétera.
Si la leche permanece en reposo un buen tiempo, algunos de los materiales

mencionados, debido a su mayor densidad, pueden sedimentar en el fondo de los
recipientes que la contienen; otros, por ser más ligeros permanecerán flotando en
el seno del líquido, o en la superficie.
De cualquier manera, porque esa materia extraña constituye una fuente de

contaminación concentrada y localizada, o por meras razones de estética, esos
materiales deben separarse de la leche. Esto puede efectuarse por colado (por
ejemplo con una tela fina, de algodón; o con una malla cerrada, de plástico o
metal), filtración, o más eficientemente con una clarificadora (máquina que
aprovecha la fuerza centrífuga para separar partículas con una densidad mayor
que la leche). Ahora bien, en leche cruda, la presencia de partículas extrañas en
suspensión o sedimentadas constituye un índice, aunque sea muy burdo, de su
calidad sanitaria. Esto porque la cantidad de ellas revela las condiciones de
129

Observación al microscopio
limpieza con que fue obtenida la leche: en la preparación de la ubre de las vacas,
durante la ordeña y en el manejo del fluido postordeña.
En consecuencia, en la práctica de evaluación de la calidad de la leche
cruda, se cuenta con dispositivos diseñados para retener las materias extrañas
que forman sedimento y, con base en la cantidad de ellas, hacer una clasificación
por grado de calidad de la leche según su “limpieza”. Este es el caso del
sedimentador de tubo para botes, y del sedimentador estándar americano; ambos
dispositivos emplean un disco de algodón de dimensiones estándar que actúa
como un filtro a través del cual se hace pasar una muestra de leche de prueba.
Estos aparatos, y las escalas con las que trabajan, han sido aprobadas por la
APHA (American Public Health Association, de los Estados Unidos de América).
En México el uso de los dispositivos mencionados no es muy común; más

bien se ha adoptado esa técnica, simplificándola, para aplicarla en algunos casos.
Sin embargo, la idea de filtrar la leche cruda, “caliente”, es clave en cualquier
modalidad aplicada.
Determinar contenido de material extraño en la leche para interpretar los

Metodlolgía
• Mezcla de glicerina:etanol 1:3 (v/v) (opcional)

• Balanza analítica con 0,1 mg de sensibilidad
130

• Equipo de filtración al vacío
• Microscopio binocular estereoscopio
• Lámpara para el microscopio o luz natural equivalente
• Embudo Büchner
• Matraz Kitazato
• Vasos de precipitados de 1000 mL
• Caja Petri
• Papel de filtración rápida para conteo con líneas paralelas de
aproximadamente 5 mm de separación
• Computadora
1. Mezclar bien todo el contenido de la muestra
2. Filtrar toda la muestra sobre un embudo de succión preparado con papel

filtro para conteo, tratando de verterlo uniformemente.
3. Pasar el papel filtro a una caja Petri y humedecerla con la mezcla glicerina-
etanol (opcional)
Observación al microscópio
1. Examinar al microscopio utilizando una luz suficientemente fuerte que

muestre los detalles en el papel filtro.
2. Contar con una aguja de disección sobre toda la superficie del papel, línea
por línea y explorar cada pieza del material dado que algunos fragmentos
son irreconocibles a menos que se muevan
131

1. Ver la presencia o ausencia de insectos enteros, fragmentos de insectos,

pelos de roedor y cualquier materia extraña que se encuentre en la cantidad
de mililitros que contenga el envase analizado.
Evaluación

Bibliografía

132

Lectura en el instrumento

Práctica 15
Título: Uso del EcoMilk y LactoScan para la determinación de algunas parámetros
Introducción
Actualmente existen aparatos cuyo funcionamiento se basan en los rayos

infrarrojos (MilkoScanÒ) y utrasonido (v.g. ECOMILKÒ y LACTOSCANÒ) para la
determinación de algunos componentes químicos y propiedades físicoquímicas de
la leche como: sólidos no grasos (SNG), proteínas, grasa densidad y punto
crioscópico simultáneamente. Particularmente, el ECOMILKÒ y el LACTOSCANÒ
resultan muy prácticos por su “portabilidad”, lo que los torna muy convenientes
para análisis de leche cruda en ranchos y en la planta industrial. A continuación se
hará referencia al manejo de ambos equipos.
Determinar de manera automatizada algunos parámetros fisicoquímicos de la

leche, haciendo uso del EcoMilk y del LactoScan para interpretar los resultados
Uso de EcoMilk
Metodología
• Aparato analizador de leche EKOMILK

133

• Computadora
1. Al instrumento, una vez encendido, se le presiona el botón “MODE” para

desplegar las funciones básicas del menú: “LECHE DE VACA”;
“LIMPIEZA”; ESCOGER MOTOR”; CALIBRACIÓN”; “SYSTEMA” y “LECHE
DE CABRA) y presionando los botones de búsqueda se elige la función
deseada.
2. La leche debe estar a una temperatura de 20°C.
3. Si la leche mantiene una capa de grasa en la superficie, debe ser calentada

en baño María hasta 40-45°C y después agitar y enfriar a 20°C. Si la
temperatura de la leche es mayor a 30°C el mensaje: “MUESTRA
CALIENTE” aparece en la pantalla.
4. Cada muestra de leche debe utilizarse una sola vez y después desecharse.
1. Se llena el recipiente de plástico con la muestra de leche por analizar y se

coloca en el soporte, introduciendo el tubo succionador en el líquido.
2. Se presiona el botón “MODE”, y con los botones de búsqueda se escoge el

tipo de leche por analiza, por ejemplo: “LECHE DE VACA”, y después se
presiona el botón “OK”.
3. La leche se succiona automáticamente a la cámara de análisis, y cuando la

muestra es analizada, aparece el resultado en la pantalla.
4. La leche ya analizada regresa automáticamente al recipiente. En caso de

formación de burbujas de aire, en la cámara, aparece en la pantalla el
134

mensaje “CÁMARA VACÍA”. Si esto sucede, es necesario empezar de

nuevo.
Uso de LactoScan
Metodología
• Aparato analizador de leche LACTOSCAN

• Computadora
1. Al instrumento, una vez encendido, se le presiona el botón “MODE” para

desplegar las funciones básicas del menú: “LECHE DE VACA”;
“LIMPIEZA”; ESCOGER MOTOR”; CALIBRACIÓN”; “SYSTEMA” y “LECHE
DE CABRA) y presionando los botones de búsqueda se elige la función
deseada.
2. La leche debe estar a una temperatura de 20°C.
3. Si la leche mantiene una capa de grasa en la superficie, debe ser calentada

en baño María hasta 40-45°C y después agitar y enfriar a 20°C. Si la
temperatura de la leche es mayor a 30°C el mensaje: “MUESTRA
CALIENTE” aparece en la pantalla.
4. Cada muestra de leche debe utilizarse una sola vez y después desecharse.
135

1. Se llena el recipiente de plástico con la muestra de leche por analizar y se

coloca en el soporte, introduciendo el tubo succionador en el líquido.
2. Se presiona el botón “MODE”, y con los botones de búsqueda se escoge el

tipo de leche por analiza, por ejemplo: “LECHE DE VACA”, y después se
presiona el botón “OK”.
3. La leche se succiona automáticamente a la cámara de análisis, y cuando la

muestra es analizada, aparece el resultado en la pantalla.
4. La leche ya analizada regresa automáticamente al recipiente. En caso de

formación de burbujas de aire, en la cámara, aparece en la pantalla el
mensaje “CÁMARA VACÍA”. Si esto sucede, es necesario empezar de
nuevo.
Evaluación

Bibliografía
• Manuales del equipo Ekomilk

• Manuales del equipo MilkoScan
• Manuales del equipo Lactoscan
• NMX-700-F-COFOCALEC-2004.
• Sistema, producto, leche-alimento lácteo-leche cruda de vaca-
especificaciones.
136

137

Práctica 16
Título: Uso del MilkoScan para la determinación de algunos parámetros
Introducción
Actualmente existen aparatos cuyo funcionamiento se basan en los rayos

infrarrojos (MilkoScanÒ) y utrasonido (v.g. ECOMILKÒ y LACTOSCANÒ) para la
determinación de algunos componentes químicos y propiedades físicoquímicas de
la leche como: sólidos no grasos (SNG), proteínas, grasa densidad y punto
crioscópico simultáneamente. Particularmente, el ECOMILKÒ y el LACTOSCANÒ
resultan muy prácticos por su “portabilidad”, lo que los torna muy convenientes
para análisis de leche cruda en ranchos y en la planta industrial. A continuación se
hará referencia al manejo del MILKOSCANÒ.
Determinar de manera automatizada algunos parámetros fisicoquímicos de la

leche, haciendo uso del MilkoSan para interpretar los resultados con base en la
normatividad vigente
Metodlogía
1. Para el uso del MikoSan, ponerse en contacto con el experto de uso del
mismo.
2. No intentar usar sin las indicaciones del experto
Evaluación

138

Bibliografía
• Manuales del equipo MilkoScan

• NMX-700-F-COFOCALEC-2004.
• Sistema, producto, leche-alimento lácteo-leche cruda de vaca-
especificaciones.
139

Manual de Prácticas de La Leche

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO

MAESTRÍA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LA ASIGNATURA: CALIDAD

ARMANDO SANTOS MORENO

Actualmente, atendiendo a un enfoque productor/usuario, la calidad de la leche

Sin embargo, todo alimento, y en especial la leche, a partir de su obtención sufre

Empero, si bien la calidad de la leche cruda (y por extrapolación, de cualquier

• Calidad composicional: % de sólidos totales, % de grasa, % de proteínas,

• Calidad fiscoquímica: el pH de la leche, su acidez titulable, su densidad, su

• Calidad sanitaria: carga mesofílica total, cuenta de coliformes, carga de

• Calidad sensorial: color, sabor, olor.

• Calidad tecnológica: fermentabilidad, “cuajabilidad”, estabilidad al calor,

La apreciación, o mejor, la evaluación de la calidad de la leche cruda es

La pertinencia de su empleo para elaborar productos seguros (inocuos)

A la leche cruda (llamada “bronca” en México), se le puede practicar numerosas

A continuación se presenta un conjunto de prácticas que contienen pruebas

Título: Presentación del programa de la asignatura y normatividad relacionada y

En este manual de análisis de leche se considerará sólo la leche de vaca y

La producción de leche sucede principalmente de tres Sistemas: el

La ordeña en los Sistemas de Producción Familiar y el Extensivo se realiza

En el Sistema de Producción Intensivo, la ordeña es mecánica y la colecta

Analizar los Sistemas de Producción de Leche así como la colecta y los

Recursos materiales y equipo

1. Distintos videos sobre Sistemas de Producción de leche, tipos de ordena y

Sistemas de producción de leche

SISTEMA SISTEMA SISTEMA DOBLE

Ordeño Ordeño Ordeño Ordeño Ordeño

SÍNTESIS DE ORDEÑO DE VACAS PARA LA ELABORACIÓN DE

1. Ordeña en el Sistema de Producción de Traspatio

2. Ordeña en el Sistema Estabilado

3. Ordeña en el Sistema Doble Propósito (Extencivo)

Salida del rancho Transvasado

Lluvias --- --- --- --- --- ---

Queso Época Bacterias mesófilas aerobias (log Acidez (g/L)

Crema de Chiapas Lluvias 6.75 ± 1.09 1.61 ±0.09

Secas 6.70 ±1.31 1.56 ±0.70

Bola de Ocosingo, Chiapas Lluvias 5.30 ±0.53 ---

Secas 6.22 ±0.62 ---

Adobera Atengo, Jalisco Lluvias 6.12 ±0.38 ---

Secas 4.77 ±0.46 ---

Asadero de Aguascalientes Lluvias 7.94 ±0.032 1.80 ±0.052

Secas 8.08 ±0.52 2.02 ±0.058

1. Los alumnos formaran equipos de máximo cinco personas en donde

• NMX-700-F-COFOCALEC-2004. Sistema, producto, leche-alimento lácteo-

El porcentaje de sólidos no grasos (%SNG) y la densidad, son dos

El porcentaje de sólidos totales. Si se suben estos aumentan tanto la

El porcentaje de grasa. Si aumenta, el porcentaje de sólidos no grasos y la

La temperatura: Si la leche se enfría, su densidad y los sólidos no graos se

La densidad se mide con un termolactodensímetro o lactodensímetro

Ya que la densidad está muy influida por la temperatura, suele aplicarse

r15°C = rT + 0.0002 (T-15)

r15°C: densidad a 15°C.

rT: densidad a temperatura de la leche.

Establecer la densidad en distintas leches con el fin de interpretar los resultados

Uso del Lactodensímetro

Colocación del lactodensímetro en la leche

Recursos materiales y equipos

• Termómetro de -10 a 110°C

• Laboratorio con mesas y sillas

Colocación de leche en la probeta

1. Se agita perfectamente toda la leche del recipiente donde se encuentre

2. Se toma la leche en otro recipiente más pequeño

3. Vaciar la leche en la probeta de 500 mL